重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂的冻干及活性贮存时间估计

研究重组人尿激酶型纤溶酶原激活剂 ( u- PA)的冻干工艺 ,并对冻干产品的稳定性进行了观察。产品放置在 - 70℃和 4℃一年 ,活性和纯度未见明显变化。同时 ,通过在 80℃、70℃和 60℃的加速贮存试验 ( MIS) ,观察了 u- PA冻干产品的热稳定性 ,并对其活性的热降解速度和贮存寿命进行了估算。结果在 37℃、2 5℃、4℃和 0℃贮存时 ,活性单位损失 5 0 %所需时间分别为 1 73天、2 .78年、70 .8年和 1 1 8年 ;活性损失 1 0 %所需时间分别为 2 0天、1 0 0天、7.6年和 1 1年。说明 u- PA经冷冻干燥后保存 ,活性和纯度是稳定的     

重组人尿激酶原半成品的稳定性观察

对干燥前尿激酶原半成品的稳定性进行了观察。将半成品分装为数管 (1 40 μl/管 ) ,分别放在 4℃ ,- 2 0℃和 - 70℃ ,用纤维蛋白平板溶解圈法和 SDS- PAGE扫描法观察其 3个月内的活性及纯度变化。结果表明在 4℃条件下 ,处于溶液中的尿激酶原稳定性最差 ,一周后活性由 5× 1 0 4IU/ml降至 2 .3 8× 1 0 4IU/ml,单链比例由 97.7%降至 88.3 %,二周后单链比例进一步下降至 43 .8%。贮存在 - 2 0℃和 - 70℃条件下活性稳定 ,但单链也要缓慢裂解 ,一周后单链比例由 97.7%分别下降到 93 .9%和 93 .5 %,3个月后分别为 83 .7%和 86 .2 %,两者无明显差别     

通过加速贮存试验估算u-PA产品在不同温度时的贮存寿命

通过在 6 0℃、70℃、80℃的加速贮存试验 (MIS)观察了 u- PA冻干产品的热稳定性 ,并对其活性的热降解速度和不同温度时贮存寿命进行了估算。在 3 7℃ ,2 5℃ ,4℃ ,0℃贮存时 ,活性单位损失 5 0 %所需的时间为 1 73 d、2 .78a,70 .8a,1 1 8a:活性单位损失 1 0 %需的时间分别为 2 0 d、1 0 0 d、7.6 4 a、1 1 a。     

单克隆抗体在不同保存条件下的稳定性

试验了组织培养上清中的单克隆抗体在不同保存条件下的稳定性,结果发现:(1)培养上清冻干后,4℃下保存6个月仍相当稳定,(2)培养上清加或不加NaN_3,在4℃或-20℃下保存18个月,如果培养上清保持无菌的话,稳定性也是令人满意的。     

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

目的：获得重组人心型脂肪酸结合蛋白,分析其活性及制备冻干品。方法：从GenBank中检索人源H-FABP CDs 序列,合成基因后构建原核表达载体pET-28a（+）-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21（DE3）,摸索pET-28a（+）-H-FABP最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性,研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果：经过优化诱导条件,重组H-FABP在BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD₆₀₀≈0.6,IPTG终浓度0.4mmol/L,30℃诱导4h。通过Ni²⁺亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组H-FABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d,25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论：本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高,冻干品稳定性好,为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。     

抗绿脓杆菌鸡卵黄色免疫蛋白的冷冻干燥研究

介绍了冷冻干燥技术的原理、抗绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,简称PA)鸡卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk,IgY)的冷冻干燥工艺过程及其参数.通过实验,获得了抗-PA IgY的冻干曲线;经间接血球凝集实验检测,抗-PAIgY的冻干品的活性为1128;在4℃和25℃下,抗-PAIgY的冻干品保存6个月,其活性不变.     

贮存条件对血清游离氨基酸浓度的影响

测试氨基酸血样以去蛋白血滤液保存此血清保存好,尤以低温(-50℃)保存最佳。血清在4℃、-10℃和-50℃下保存都不能保证氨基酸分析结果准确可靠,而去蛋白血滤液在-10℃下保存一周基本能保持氨基酸的稳定性,在-50℃下保存更好,保存一周所有氨基酸基本保持不变,贮存到二个月时,仅有4种氨基酸(苯丙、胱、精和羟脯氨酸)有变化,变化幅度也较小,因此,作为测试氨基酸血样应去蛋白后在-10℃以下的低温条件下保存为宜。     

冻干甲型肝炎减毒活疫苗的研制

研制冻干甲肝减毒活疫苗,提高疫苗的稳定性,便于保存及运输,保证疫苗的接种效果.采用CA-9冻干保护剂,按13.5的比例加入疫苗,制备冻干疫苗.冻干甲肝减毒活疫苗具有与液体疫苗相同的安全性及免疫原性.在2～8℃保存的有效期较液体疫苗的3～5个月提高到18个月.在室温和37℃保存的稳定性也明显提高.冻干甲肝减毒活疫苗的稳定性良好,无需低温保存、冷链运输,便于甲肝疫苗的大规模推广应用.     

注射用重组人干扰素α2b冻干制剂稳定性试验

本文通过对三批注射用重组人干扰素α２ｂ（ｒＩＦＮ－α２ｂ）冻干制剂在不同温度下,保存不同时间取样,对其外观、生物学活性、ｐＨ值、溶解状态及无菌试验等各项理化指标的观察试验,结果本品的冻干制剂在－２０℃和４－８℃的条件下保存４２个月,其上述各项检定指标无明显变化,均符合质检规程,即本文制品在此条件下稳定性良好,有效期可定为三年。同时说明该产品的生产工艺稳定。     

冻干神经生长因子活性稳定性试验研究

用不同的物质作保护剂冻干纯化鼠神经生长因子,经检定以人血白蛋白作为赋形剂和保护剂冻干神经生长因子制品外观洁白细腻,结构强度良好,生物活性符合要求,残存水分低于３％。采用留样观察法检测其稳定性,将制品放置４℃～８℃,在０、０．５、１、２、３、６、９、１２、１８、２４、２５个月分别测定其各自的活性。结果表明神经生长因子冻干制品在４℃～８℃保存,２５个月仍然保持原有生物活性     

In vitro stability studies of a Factor IX concentrate (Bebulin)

Factor IX: C activity decay was studied in lyophilized concentrates (Bebulin, IMMUNO) stored at room temperature and in reconstituted preparations frozen and stored at -20 degrees C. A very slight, practically identical, decay of Factor IX: C was found in lyophilized concentrates kept at room temperature, in reconstituted lyophilized concentrates frozen and stored at -20 degrees C and lyophilized concentrates kept at +4 degrees C. At the end of the experiment, which was 4-5 months after the expiration date of the product, a 15-30% decay of Factor IX: C could be found in the concentrates with respect to initial levels.     

来源于E.coli和CHO表达系统的重组人β-NGF性质比较

基于原核表达系统极难表达具有正确三级结构的重组人β神经生长因子（rhNGF-β）,E. coli是否能作为其工业化生产菌株存在争议。为此,将构建于E.coli体系,经表达体外复性后的rhNGF-β与中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达体系分泌的rhNGF-β,运用HPLC、SDS-PAGE、质谱、N-末端分析等手段以及鸡胚背根神经节（DRG）、 PC12 细胞体外测活法对制备产物进行分析、测定。结果表明：二者具有一致的理化性质和生物学活性,HPLC纯度均大于95%、生物学比活均不低于1.8 ng/U;经添加赋型剂制成冻干粉后,在温度37℃±2℃、相对湿度75%±5%条件下进行3个月加速试验,活性均不变。说明E. coli表达体系可生产质量均一、高生物学活性的rhNGF-β,且具有明显成本优势。     

长双歧杆菌DD98冻干保护剂优化及菌粉保存稳定性研究

以长双歧杆菌DD98为研究对象,通过对冻干保护剂配方的优化,冻干菌粉的存活率提高到90%以上。通过进一步稳定性研究,采用保护剂优化配方制备的冻干菌粉在4℃保存24个月后,活菌数仍在1.0×10^10 CFU/g以上,在25℃条件下可以保存12个月,双歧杆菌的存活率在1.0×10^6CFU/g以上,符合FAO/WHO建议食品益生菌活菌数应在1.0×10^6 CFU/g^1.0×10^7CFU/g的标准。     

解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因的克隆、表达与酶学性质分析

以中温α-淀粉酶生产菌株Bacillus amyloliquefaciens M23基因组DNA为模板。PCR扩增得到了2．0kb α-淀粉酶基因全长序列。该基因由上游启动子220bp,结构基因1544bp和终止序列320bp构成。将无信号肽的α-淀粉酶结构基因amyQ,克隆入表达载体pET28a,转化E．coli BL21（DE3）,经诱导,测定α-淀粉酶活性。结果表明：α-淀粉酶基因amyQ获得了活性表达,酶活力为2．297U／mL,SDS-PAGE电泳结果显示出分子量约为58kDa特异性蛋白质条带。酶学性质分析表明,重组α-淀粉酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6．5,在60℃保温15min保持85％以上活性,超过15min,酶迅速失活,在pH5．5～10．0环境下稳定。水解产物分析表明：淀粉水解终产物主要为麦芽寡糖和糊精和少量葡萄糖。     

一种快速提取葱属植物 DNA 的方法

目的：针对分子育种工作的繁琐性及葱属植物次生代谢物较多的特点,研究一种利用普通试剂及简单仪器高效快速提取葱属植物DNA的方法。方法：对碱处理法稍加改进,在碱性环境中高温裂解细胞,将释放的DNA保存在Tris缓冲液中,用PCR检测提取质量并分析DNA的保存时间。结果：与用试剂盒提取的DNA相比,扩增产物无显著差异,利用此方法提取DNA并分析了13个洋葱品种的细胞质雄性不育类型;保存时间分析显示,DNA在常温下只能保存5d,在4℃或-20℃可至少保存2个月。结论：该方法方便快速、成本低、适于田间操作,得到的DNA可满足分子生物学实验的基本要求,可用于以PCR为基础的分子标记辅助育种。     

Changes in the electrophoretic pattern of the venom of the bushmaster (Lachesis muta stenophrys) stored under various conditions

Liquid and lyophilized samples of Lachesis muta venom were stored at different temperatures and for different periods of time, and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and immunoelectrophoresis. Only slight variations were evident when three pools of freeze-dried venom, that had been kept at -30 degrees C for several months were compared with fresh venom. These results suggest that L. muta venom is not altered drastically when stored under these conditions.     

Interaction of single-chain urokinase-type plasminogen activator with human endothelial cells

The interaction of urokinase-type plasminogen activators with receptors on the surface of endothelial cells may play an important role in the regulation of fibrinolysis and cell migration. Therefore, we investigated whether human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) express receptors for single-chain urokinase (scu-PA) on the cell surface and examined the effect of such binding on plasminogen activator activity. Binding of 125I-labeled scu-PA to HUVEC, performed at 4 degrees C, was saturable, reversible, and specific (k+1 4 +/- 1 X 10(6) min-1 M-1, k-1 6.2 +/- 1.4 X 10(-3) min-1, Kd 2.8 +/- 0.1 nM; Bmax 2.2 +/- 0.1 X 10(5) sites/cell; mean +/- S.E.). Binding of radiolabeled scu-PA was inhibited by both natural and recombinant wild-type scu-PA, high molecular weight two-chain u-PA (tcu-PA), catalytic site-inactivated tcu-PA, an amino-terminal fragment of u-PA (amino acids 1-143), and a smaller peptide (amino acids 4-42) corresponding primarily to the epidermal growth factor-like domain. Binding was not inhibited by low molecular weight urokinase or by a recombinant scu-PA missing amino acids 9-45. Cell-bound scu-PA migrated at its native molecular mass on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. In the presence of plasminogen, scu-PA bound to endothelial cells generated greater plasmin activity than did scu-PA in the absence of cells. In contrast, when tcu-PA was added directly to HUVEC, sodium dodecyl sulfate-stable complexes formed with cell or matrix-associated plasminogen activator inhibitors with a loss of plasminogen activator activity. These studies suggest that endothelial cells in culture express high affinity binding sites for the epidermal growth factor domain of scu-PA. Interaction of scu-PA with these receptors may permit plasminogen activator activity to be expressed at discrete sites on the endothelial cell membrane.     

重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原原液性质研究

目的进行重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原原液二聚体含量及性质研究,确定LcrV原液的相关质控标准。方法在不同缓冲体系(0.85%NaCl(NS)、20 mmol/L PBS),不同蛋白浓度(2.0、1.5、1.0、0.5、0.1 mg/mL)及不同保存温度(4℃、-20℃、-70℃)条件下保存LcrV抗原,采用SDS-PAGE和HPSEC方法定期检测LcrV二聚体含量及纯度。将连续三批检定合格的LcrV抗原原液进行质谱相对分子质量测定、等电点测定、N末端氨基酸序列测定、圆二色(CD)谱、HPLC肽谱及氨基酸组成分析,研究LcrV抗原的相关性质。结果随着保存时间的延长LcrV抗原二聚体含量增加,低温保存时二聚体不易大量形成。在-20℃和-70℃条件下,NS保存的LcrV抗原比PBS体系保存稳定,而在4℃条件下NS保存的LcrV抗原容易降解。LcrV抗原高浓度保存容易发生聚合。LcrV抗原在低质量浓度(0.1 mg/mL)保存时免疫学活性明显下降。质谱检测到LcrV单体和二聚体共同存在,且与理论相对分子质量一致。LcrV原液检测等电点范围为4.6～6.3。N末端测序、CD谱、HPLC肽谱图及氨基酸组成分析与理论结果一致。结论 LcrV抗原原液保存条件确定为:NS体系,蛋白质量浓度1.0～2.0 mg/mL,-20℃以下冻存。制备的LcrV抗原各项检测结果与理论结果一致,抗原性质稳定。     

马免疫血浆的稳定性研究

目的了解不同温度条件对马免疫血浆外观和效价的稳定性影响,为马免疫血浆的采集、分离、贮存、运输及抗毒素生产提供数据支持。方法将破伤风类毒素及肉毒A、B、E、F型类毒素制备的马免疫血浆,分别放置于2~8℃、20℃、37℃3种温度下,并分别于0、1、3、6、12个月取样,依据《中国药典》三部(2010版)的检测方法和标准,对样品进行外观检查及效价检测。结果破伤风及肉毒A、B、E、F型马免疫血浆在2~8℃条件下,放置12个月稳定性良好,外观及效价均符合《中国药典》三部(2010版)规定要求。20℃与37℃下放置的马免疫血浆随着时间的延长,外观会发生不同程度的浑浊,效价也均有不同程度的降低,低效价组比中、高效价组的效价下降明显,且温度越高效价降低幅度越大。结论马免疫血浆在2~8℃条件下质量稳定。