NMT在大肠杆菌中的His6融合表达及其纯化研究

将啤酒酵母ＮＭＴ基因以Ｎ端融合６个组氨酸的形式在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中进行了ＩＰＴＧ诱导的表达研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析确定有与Ｈｉｓ。－ｒＮＭＴ理论分子量一致的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白的１０％左右;表达产物性质分析表明Ｈｉｓ－ｒＮＭＴ主要以可溶形式存在。在此基础上不受利用固定化金属离子配体亲和层析一步纯化目的蛋白,纯度可达９５％以上。体外标脾性是Ｈｉｓ６－ｒＮＭＴ具有与成熟ＮＭ     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGl在CHO细胞中的高效表达

为了得到ｔＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧＩ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线性化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯｄｈｆｒ－）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１０６细胞·２４ｈ的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间约为３６ｈ,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株     

脑源性神经营养因子（BDNF）在成肌细胞中的稳定表达

将ｂｄｎｆ基因克隆入逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ,构建得到ｐＬＮＣ／ＢＤＮＦ,经ＰＡ３１７细胞包装后,感染大鼠成肌细胞Ｌ６ＴＧ,Ｇ４１８筛选２周后,得到稳定表达ｂｄｎｆ基因的细胞克隆Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ。ＤＮＡ印迹结果证实ｂｄｎｆ基因已经整合入Ｌ６ＴＧ染色体中,ＲＮＡ印迹和斑点印迹结果分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白水平证明了ｂｄｎｆ基因的表达,且Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ培养上清中ＢＤＮＦ的含量约为２５ｎｇ（１０６细胞数每ｍｌ每２４ｈ）。     

金属硫蛋白 - 潜伏膜蛋白融合基因的体外转录调控

ＥＢ病毒（ＥＢＶ）是一种与地区性伯基特氏淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金氏病等多种人体肿瘤有关的疱疹病毒．已往的研究表明,潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）基因是ＥＢＶ最可能的致瘤基因．为制备ＬＭＰ基因转基因小鼠,探讨ＬＭＰ的体内致瘤作用,首先构建了含鼠金属硫蛋白－１（ＭＴ－１）基因调控区和ＬＭＰ基因编码区的ｐＢＲ３２２－ＭＴ－ＬＭＰ质粒,并用电击法将该质粒与ｐＫＪ１－Ｎｅｏ质粒共转染人胃癌细胞株ＭＧＣ,对ＭＴ－ＬＭＰ基因在转染细胞中的整合、转录情况及重金属镉和镍对该融合基因的转录调控进行了研究．结果表明：（１）两质粒共转染效率为８６．７％;（２）ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析显示,完整的ＭＴ－ＬＭＰ基因已整合入转染的ＭＧＣ细胞基因组,且在不同的转染细胞克隆中,ＭＴ－ＬＭＰ基因整合的方式及拷贝数不同,拷贝数从１到１９不等;（３）ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析证实,ＭＴ－ＬＭＰ基因不仅在转染的ＭＧＣ中能够转录,而且在１０μｍｏｌ／Ｌ镉诱导下,ＭＴ－ＬＭＰ基因转录增强,平均增高约１．４倍．结果说明,在ＭＴ－１基因调控区指导下,ＬＭＰ基因不但有ｍＲＮＡ水平的表达,而且其表达受重金属镉的调控,上述结果为制备ＭＴ－ＬＭＰ转基因小鼠     

人NMT的表达,纯化和活性研究

利用ＰＣＲ技术并进行ＤＮＡ序列测定,从人脑ｃＤＮＡ库中扩增得到人豆蔻酰ＣｏＡ蛋白Ｎ端豆蔻酰转移酶的编码基因,构建其在Ｔ７启动子控制下的成熟型和Ｈｉｓ６融合型的表达质粒ｐＭＦ－ｈＮＭＴ３和ｐＭＦＨＴ－ｈＮＭＴ２。转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行ＩＰＴＧ诱导表达研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果显示,在３７℃条件下表达的各种重组ｈＮＭＲ几乎全是不溶性产物,但在较低温度条件下表达的Ｈｉｓ６－ｈＮＭＲ绝大     

野生型及启动子区突变的HPFHAγ基因在MEL细胞中的表达

研究了野生型Ａγ珠蛋白基因、中国型胎儿血红蛋白持续存在综合症（ＨＰＦＨ）Ａγ基因（启动子区－１９６Ｃ－Ｔ突变）及希腊型ＨＰＦＨＡγ基因（－１１７Ｇ－Ａ突变）在鼠红白血病（ＭＥＬ）ＧＭ９７９细胞中的表达,比较每个整合的Ａγ基因明显增加的表达水平,而－１１７Ｇ－Ａ１９６Ｃ－Ｔ突变Ａγ基因未显示比野生型Ａγ基因明显增加的表达水平,而－１１７Ｇ－Ａ空变Ａγ基因在未分化的及ＨＭＢＡ或丁酸钠诱导分化的ＭＥＬＧ     

人乳头瘤病毒16碧蓝晚期基因L1在大肠杆菌中的表达

人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染与宫颈癌的发生关系密切。其晚期蛋白Ｌ１是主要结构蛋白,可以刺激机体产生中和抗体,对病毒攻击可以起到保护作用。本研究将ＨＰＶ１６型中国分离株的Ｌ１基因定向克隆到原核表达载体ｐＥＴ－２１ｃ质粒中,建立ＨＰＶ１６ Ｌ１在大肠杆菌中的高效表达系统ｐＥＴ２１ｃ－ＨＰＶ１６ Ｌ１,该系统在ＩＰＴＧ的诱导下可表达６０ｋｕ的Ｌ１蛋白,表达效率为２３％,此蛋白通过Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ得     

GL—7—ACA酰化酶在大肠杆菌中的分泌表达

利用来自假单胞菌的ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的信号肽和表达元件基因片段构建了ＧＬ－０７－ＡＣＡ酰化酶的分泌型高表达质粒ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ,其中ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ为ＩＰＴＧ诱导型质粒,ｐＫＫＣＡ１Ｓ为组成型质粒。ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ转入受体菌ＴＧ１中都可高表达ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶基因并将表达产物转运到周质空间,完整细胞酰楷酶比活力分别为２３．９单位每克菌体和１８．３单位每克菌体     

人绒毛膜促性腺激素β—亚基在中国仓鼠卵巢细胞中…

本文以哺乳动物细胞表达载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ为运载体,构建了受控于ＳＶ４０早期启动子β－ｈＣＧ基因的表达载体,转染ＣＨＯ－ｈｆｒ＾－细胞后,挑选ＣＨＯ（ｄｈｆｒ＾＋）细胞,结果表明β－ｈＣＧ不仅在细胞中表达,不分泌到培养液中,通过氨甲喋（ＭＴＸ）加压后,表达量逐渐提高,０．１μｍｏｌ／ＬＭＴＸ条件下培养液中β－ｈＣＧ最高表达量可达到１．５μｇ／１０＾６细胞．２４小时。经亲和层析获得纯的重组β－ｈＣ     

大鼠酪氨酸羟化酶基因在肌母细胞中稳定表达

用电穿孔法将大鼠酪氨酸羟化酶（Ｔｙｒｏｓｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ,ＴＨ）基因转染大鼠Ｌ－６ＴＧ成肌细胞株,经ＰＣＲ检测、免疫组织化学和荧光组织化学检测证明,ＴＨ基因能在细胞内稳定整合和表达,并在辅因子存在时将酪氨酸转化为多巴．移植于大鼠纹状体后可成活并表达ＴＨ。     

霍乱毒素B亚单位基因（CtxB）的克隆及其表达

从霍乱弧菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＥＲ方法获取霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ＣｔｘＢ）。序列分析结果表明,ＣｔｘＢ基因编码１２４个氨基酸,其中编码６２位Ｔｈｒ的密码子与文献报道有差异。将ＣｔｘＢ基因插入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２,构建ｐＧＥＸ－ＣＴＸＢ表达质粒,转化大肠相菌ＢＬ２１（ＤＥ３０,筛选表达菌株ＣＴＸＢ／ＢＬ２１。工程株经ＩＰＴＧ诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,融合蛋白分子     

Forskolin对放射性转化细胞TGF基因及部分癌基因表达的影响

＾３Ｈ－ＴｄＲ放射性转化细胞经１×１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ Ｆｏｓｋｏｌｉｎ处理２４ｈ后,ＴＧＦａ,ｃ－ｍｙｃ,ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因的ｍＲＮＡ表达下降;ＴＧＦβ,ｃ－ｆｏｓ基因表达无明显变化。非转化细胞经相同条件处理,ＴＧＦａ,ＴＧＦβ,ｃ－ｍｙｃ及ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因表达无显著改变。提示：Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ介导的转化细胞的生长抑制作用与ＴＧＦａ,ｃ－ｍｙｃ,ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因的转录表达下降有关。     

SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白

通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况,从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和以 Ｐ Ｇ 为接头的５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构预测结果相似． Ｄ Ｎ Ａ 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致．５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后,生物学活性及对高表达 Ｉ Ｌ ６ 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示：在 Ｌ９２９细胞上,前者的生物学活性是后者的 ２７ 倍;在 Ｕ９３７ 细胞上,前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的１３ 倍．它们对高表达 Ｉ Ｌ ６ 受体的 Ｕ９３７ 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 Ｔ Ｎ Ｆα衍生物的３７ 和 ２９ 倍．实验表明, Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白优于以 Ｐ Ｇ 作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白．     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＲ的方法扩增ｚｏｔ基因。序列分析表明,ｚｏｔ基因编码３９９个氨基酸,其中４个氨基酸与文献报道有差异。将ｚｏｔ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－２８（ａ＋）构建表达质粒ｐＥＴ－ＺＯＴ,转化大肠檑菌ＢＬ２１（ＤＥ３）筛有达菌株ＢＬＺＯＴ。表达菌株经１ｍｍｏｌ／ＬＴ ＩＰＴＧ诱导表达３－５ｈ后,表达大量ＺＯＴ蛋白,并形成包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组ＺＯＴ蛋白分     

构建基因工程菌发酵产生维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸

从棒状杆菌ＳＣＢ３０５８克隆得到两个２,５－ＤＫＧ＾＊＊还原酶基因后,构建了两个能够表达２,５－ＤＫＧ还原酶的基因工程大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＥＴ９ａⅡ和ＤＨ５α（ｐＢＬ４）和一个基因工程欧文氏菌ＥＲ９７。２,５－ＤＫＧ还原酶基因分别受控于ＰＬ或Ｔ７启动子,通过加入ＩＰＴＧ或提高温度进行诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和酶活测定确定它们在诱导后得到了高表达,用细胞抽提液在加入辅酶ＮＡＤＰＨ的体外实验中转     

大鼠卵巢绒毛膜促性腺激素受体在CHO中的表达和扩增

本文报道了利用二氢叶酸还原酶放大系统将大鼠ＬＨ／ｈＣＧ受体（记为Ｆ－ｈＣＧＲ）及其胞外肽段（记为Ｔ－ｈＣＧＲ）在中国苍鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中的表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,Ｆ－ｈＣＧＲ为一条蛋白质带,其表观分子量为９２ｋｄ,而Ｔ－ｈＣＧＲ为３５ｋｄ和３７ｋｄ两条带。表达受体对其配基ｈＣＧ表现出高的亲合力,Ｆ－ｈＣＧＲ的解离常数为７×１０－９ｍｏｌ／Ｌ,Ｔ－ｈＣＧＲ为６．４×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞可结合１２５Ｉ－ｈＣＧ,而表达Ｔ－ｈＣＧＢ者不结合１２５Ｉ－ｈＣＧ。这提示Ｆ－ｈＣＧＲ主要存在于细胞质膜表面上。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞能刺激。ｃＡＭＰ的形成,而表达Ｔ－ｈＣＧＲ者不能刺激ｃＡＭＰ形成。免疫荧光定位结果表明,Ｔ－ｈＣＧＲ主要分布于质膜的细胞质侧以及胞内其他一些细胞器膜上。用免疫亲和层析可以得到纯化的Ｔ－ｈＣＧＲ。     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

缩短的人巨噬细胞集落刺激因子（M—CSF）在大肠杆菌中…

本文用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子ｃＤＮＡ基因,并克隆在质粒ｐＡＥＴ３ｄ中,在Ｔ７启动子指导下,在大肠杆菌ＢＬ２ＬｙｓＥ中获得了和一个６组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合Ｍ－ＣＳＦ表达量占菌体总蛋白的１２％,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合（Ｈｉｓ）６－Ｍ－ＣＳＦ在还原型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上基     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）组合突变体FrGGl在CHO细胞中的…

为了得到ｔ－ＰＡ组合突体ＦｒＧＧｌ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧｌ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０＾－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１     

转化生长因子α—绿脓杆菌外毒素融合蛋白TGFa—PE40高效表达质…

利用基因工程技术,将质粒ＰＹＸ３８２用ＸｂａＩ和ＥｃｏＲＩ切下插入的ＴＧＦａ－ＰＥ４０融合基因片段,连接到可表达载体ＰＣＢ６０４的ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ位点中,构建成新的重组质粒Ｐ２Ｘ－ＴＰ１。Ｐ２Ｘ－ＴＰ１转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１感受态菌后,在ＩＰＴＧ诱导下Ｉｐｐ启动子转寻表达ＴＧＦａ－ＰＥ４０融合蛋白。表达产生物主要以包涵体形式沉积在细胞内,隔合蛋白表达量的高低与诱导时的细胞密度,诱导的温度以及