PHO4和PHO2蛋白与PHO81基因调控序列的相互作用

高效表达产纯化了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白,凝胶阻抑电泳分析证明了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白与ＰＨＯ８１上游－４０１－２８９ｂｐ片段的结合,定点突变ＰＨＯ２的２３０位丝氨酸为天冬氨呈丙氨酸,不影响ＰＨＯ２蛋白与此片段的结合。足迹法分析证明了ＰＨＯ４结合在ＰＨＯ８１基因上游的３５４－３３３ｂｐ,ＰＨＯ２结合在３４１－３３４ｂｐ。因此,这些结果表明－４０１－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,     

酵母PHO2与PHO4蛋白的激活活性的分析及两者的相互作用

ＰＨＯ２与ＰＨＯ４是酵母ＰＨＯ５基因的两个正调控因子,本文发现,ＰＨＯ２与酵母转录因子ＧＡＬ４的ＤＮＡ结合功能域融合后就能激活报道基因ｌａｃＺ的表达,其激活力受高低磷影响,表明ＰＨＯ２蛋白上存在酸性转录激活区。ＰＨＯ２蛋白上酸性氨基酸丰富的２８７－３２６肽段并非ＰＨＯ２的激活区。在ＰＨＯ２蛋白上２３０位Ｓｅｒ处于磷酸化状态２ＰＨＯ２才有激活作用,表明了这一磷酸化位点可能与ＰＨＯ２的转录激活能力有关     

酵母PH02蛋白的磷酸化研究

本文报道ＰＨＯ２蛋白能被一种未知的蛋白激酶磷酸化ＰＨＯ２蛋白的第２３０－２３３位氨基酸残基组成一个可能被ｐ３４相关的蛋白激酶识别的一致序列（ＳＰＩＫ）,用点突变的方法将Ｓｅｒ－２３０变成Ａｌａ可导致ＰＨＯ２蛋白激活ＰＨＯ５表达能力的完全丧失。进一步的研究显示,将Ｐｒｏ－２３１突变成Ｓｅｒ同样可导致ＰＨＯ２的矢活,而Ｓｅｒ－２３０突变成Ａｓｐ则不影响ＰＨＯ２的活力。由于ＰＨＯ２（Ａｓｐ－２３０）突变体通过在第２３０位残基引入了一个负电荷,可以看成Ｓｅｒ－２３０被磷酸化的状态,由此推测ＰＨＯ２蛋白可能需要在Ｓｅｒ－２３０被磷酸化后才会具有激活ＰＨＯ５基因转录的能力。体外磷酸化分析的结果表明,大肠杆菌表达的ＧＳＴＩ－ＰＨＯ２（野生型）融合蛋白能够被酵母ＹＰＨ４９９总蛋白抽提物磷酸化,如果以ＳＰＩＫ（２３０－２３３）一致序列被破坏的ＧＳＴ－ＰＨＯ２（Ｐｒｏ－２３１→Ｓｅｒ）突变体作为底物,则观察不到该融合蛋白被酸磷化标记。结果表明ＰＨＯ２在细胞内是一种磷骏化蛋白,第２３０位Ｓｅｒ的磷酸化是该转录因子较制ＰＨＯ５基因表达的活性所必需。     

酵母转录因子PHO81锚蛋白重复序列表达和功能分析

酵母转录因子ＰＨＯ８１蛋白含有６个锚蛋白重复序列。将ＰＨＯ８１锚蛋白重复序列与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达（ＧＳＴ－ＡＮＫ）,表达产物以包含体形式存在。利用氧化型和还原型谷城肽系统对包含体进行复性,得到了可溶性蛋白,亲和纯化后,进行了活性分析。通过免疫共沉淀、分别制备了ＰＨＯ８５－ＰＨＯ８０和ＰＨＯ８５－ＰＡＰ１激酶复合物,用重组的ＰＨＯ４蛋白作底物,在激酶反应体系中加入ＧＳＴ－ＡＮＫ,发现它     

酵母PHO2蛋白的磷酸化研究

本文报道了ＰＨＯ２蛋白能被一种未知的蛋白激酶磷酸化。ＰＨＯ２蛋白的第２３０－２３３位氨基酸残基因组成一个可能ｐ３４＾ｃｄｃ３／ＣＤＣ２８相关的蛋白激酶识别的一致序列,用点突变的方法将Ｓｅｒ－２３０变成Ａｌａ可导致ＰＨＯ２蛋白激活ＰＨＯ５表达能力的完全丧失。     

酵母转录因子PHO81基因的上游序列功能分析

利用ＰＨＯ８１ｌａｃＺ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对ＰＨＯ８１基因的表达是必需的：－４０１～－２８９ｂｐ和－１０１２～－８０１ｂｐ。比较ＰＨＯ８１和ＰＨＯ５,ＰＨＯ８４基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在－４０１～－２８９ｂｐ区域有ＰＨＯ４蛋白结合位点的核心序列５′ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ３′,以及ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ两侧富含Ａ／Ｔ的序列（可能是ＰＨＯ２结合位点）。推测－４０１～－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,－１０１２～－８０１ｂｐ可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对－１０１２～－８０１ｂｐ进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。     

酵母PHO2蛋白及其变异体与PHO5USA体外的相互作用

酵母ＰＨＯ２蛋白及其变异体与ＰＨＯ５ＵＳＡ体外的相互作用杨军,敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,２０００３１）关键词酵母;ＰＨＯ２;突变;ＤＮＡ结合ＰＨＯ２是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶基因转录的正调控因子［１］,由５５９个氨基...     

酵母PAP1与PHO85激酶复合物对PHO4的磷酸化

酵母ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＡＰ１与其它的ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＨＯ８０、ＰＣＬ１及ＰＣＬ２有较高的同源性。我们上ＰＡＰ１与ＨＡ抗原的融合基因,利用抗－ＨＡ抗体进行免疫沉淀。体外翻译的融合ＨＡ标记肽的ＰＡＰ１与体外翻译的ＰＨＯ８５的免疫共沉淀证明了ＰＡＰ１与ＰＨＯ８５的结合。同时纯化了大肠杆菌表达的ＰＨＯ４蛋白,并构建了Ｐ９ＨＯ８５：：ＰＲＰ１缺失株。ＰＡＰ１与ＨＡ的融合基因被置于酵母ＡＤＨ１启动子的控     

酵母转录因子PHO2在PHO5,HIS4及HO基因表达中的作用

酵母ＰＨＯ２蛋白在多个不同基因的表达中起作用,是一个多效的转录激活因子。本文比较了该因子要ＰＨＯ５,ＨＩＳ４及ＨＯ３种基因表达系统中的作用。ＰＨＯ２的缺失使ＰＨＯ５在低磷时不能去阻遏;使ＨＩＳ４和ＨＯ的表达分别降低到正常的２５％和４０％。如果把克隆于抵拷贝穿梭质粒的ＰＨＯ２基因转入ＰＨＯ２缺陷的酵母菌,则３种基因的表达都恢复正常。     

酵母转录调控因子PH081的结构与功能

本文发现ＰＨＯ８１蛋白上的碱性区（８８－１６０）和酸性区（７７１－８１０）附近的微小变化可导致ｒＡＰａｓｅ的表达向组成型转化,且这两个区域是协同作用的,而酸性区的净负电荷的降低能使ｒＡＰａｓｅ的活力降低。ＰＨＯ８１蛋白中有６个锚蛋白重复单位（ａｎｋｙｒｉｎｒｅｐｅａｔｓ）,是ＰＨＯ８１蛋白与ＰＨＯ８０－ＰＨＯ８５蛋白复合物的结合区。对锚蛋白重复序列的突变表明锚蛋白重复序序列１,２,４,５,６对ＰＨＯ８１是十分关键的,而锚蛋白重复序列３的Ｐｒｏ５０９,Ｌｅｕ５１０的缺失并不影响ＰＨＯ８１的功能。在ＰＨＯ８１蛋白的７０１－７１９位氨基酸残基有一段类似核定位序列的肽段,相应基因片段的缺失导致ＰＨ０８１完全失活。但将该可能的核定位序列的最保守的碱性氨基酸Ａｒｇ７０１、Ｌｙｓ７０２同时变为中性氨基酸（Ｓｅｒ,Ｇｉｎ）导致ｒＡＰａｓｅ的表达大大提高,而将核定位序列中Ｌｙｓ７１７变为Ａｓｎ,或将Ａｒｇ７１９变为Ｓｅｒ,都不影响ＰＨＯ８１的功能。     

酵母酸性磷酸酯酶转录调控因子PHO2的功能域分析

利用定点诱变,氨基酸插入或缺失的方法对ＰＨＯ２进行结构改造,观察对其功能的影响。ＰＨＯ２蛋白的同源域中有α－螺旋２－β－转我－α螺旋３的结构,是转录因子结构ＤＮＡ的功能域。定点诱变α－螺旋３上的Ｉｌｅ１２３为Ｐｒｏ１２３或者在α－螺旋２中插入ＰＤＰＤ４个氨基酸,破坏α－螺旋的结构,可导致ＰＨＯ２功能的丧失。氨基酸片段的缺失分析表明,Ｎ端Ｇｉｎ丰富区大部缺失,对ＰＨＯ２功能没有影响;而包含酸性氨基酸     

酵母PHO4基因的克隆与表达

用原位杂交方法从酵母菌染色体ＤＮＡ中分段克隆,拼接,获得完整的ＰＨＯ４基因,全长约３．４ｋｂ,利用体内同源重组的方法,构建了ＰＨＯ４基因缺失突变株。ＰＨＯ４基因的缺失导致酸性磷酸酯酶活性明显下降,将完整的ＰＨＯ４基因转入这种缺陷细胞,能使酶活性回复到野生型水平,ＰＨＯ４起正调控作用,构建ＰＨＯ４－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ４的表达水平。融合基因不同名的表达表明,ＰＨＯ４基因     

酵母PHO80基因的克隆,表达及功能分析

利用原位杂交方法从野生型酵母菌染色体ＤＮＡ中克隆了ＰＨＯ８０基因,全长约４．２ｋｂ,包括１．１ｋｂ的上游序列和８７９ｂｐ的编码序列。以ＵＲＡ３基因为筛选标记,通过体内同源重组和营养互补筛选获得了ＰＨＯ８０基因缺失突变株。进一步研究了ＰＨＯ８０在细胞内的功能,它是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶结构基因以及调控基因ＰＨＯ８１表达的负调控因子,但不影响ＰＨＯ４和ＰＨＯ８５的表达。还构建了ＰＨＯ８０－ＬａｃＺ融合基因,探索它在细胞内的表达规律。β－半乳糖苷酶活力测定结果表明,ＰＨＯ８０基因在细胞内呈低水平表达,并受自身产物和ＰＨＯ８５的抑制,推测它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ８１基因的调控模式可能相似。     

酵母PHO85结合蛋白PAP1基因的克隆和表达

酵母调探因了ＰＨＯ８５是一个依赖于细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）的蛋白酶（ＣＤＫ）,参与对细胞周期和酸性磷酸酯酶基因表达的调控。冯ＰＨＯ８５为靶分子,利用酵母的染色体基因文库中克隆到了一个新的与ＰＨＯ８５相结合的蛋白因子的基因,利用酵母双杂交（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）系统从酵母的染色体基因文加中克隆到了一个新的与ＰＨＯ８５相结合的蛋白因子的基因,将此蛋白质命名为ＰＡＰ１（ＰＨＯ８５ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ     

酵母PHO81在酸性磷酸酯酶基因表达调控中的作用

利用酵母ＰＨＯ８１与大肠杆菌β－半乳糖苷酶的融合基因,系统地研究了ＰＨＯ８１基因在酵母酸性磷酸酯酶的不同调控因子的单缺失株和双缺失株中的表达规律,它与酸性磷酸酯酶基因ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１的控制机制相似。构建 了ＡＤＨ１启动子控制下ＰＨＯ８１表达质粒。在ＰＨＯ８１在细胞内组成型表达时,酸性磷酸酯酶基因的表达仍受无机磷的控制,提示ＰＨＯ８１蛋白可能在不同浓度无机磷条件发生变构。ＰＨＯ８１的酸性磷酸酯酶     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。     

酵母PHO81蛋白的结构预测和功能分析

以Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ和ＧＯＲ方法预测酵母ＰＨＯ８１蛋白的二级结构。用Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ方法分析它的疏水性。分析了ＰＨＯ８１蛋白与其他蛋白的同源性,发现它包含５个ＳＷ１６／ＡＮＫ重复单位,这些重复单位可能是ＰＨＯ８１蛋白与负调控因子ＰＨＯ８０相互作用的位点。     

GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究

将构建好的可表达ＧＳＴ融合蛋白的重组病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－－ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８感染Ｓｆ９细胞,一定时间后取感染了病毒的细胞裂解物上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,结果显示５３ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－６ｘＨｉｓ－Ｅｔｐ２８）呈不溶状态。在原有裂解液的基础上,加固体十二烷基肌氨酸钠致终浓度１．５％,并将Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的比例由１％提高到２％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示至少有１／     

蓝藻原生质球渗透稳定剂的研究

蓝藻原生质球渗透稳定剂的研究郭厚良,陈勇,金传荫（武汉大学生物系,４３００７２）（中国科学院水生生物研究所,武汉４３００７２）ＡＳＴＵＤＹＴＯＴＨＥＳＴＡＢＩＬＩＺＥＲＳＩＳＯＬＡＴＩＮＧＯＦＢＬＵＥ－ＧＲＥＥＮＡＬＧＡＬＳＰＨＥＲＯＰＬＡＳＴＳ￥Ｇ...     

生物技术生产生物可降解塑料PHB的前景

生物技术生产生物可降解塑料ＰＨＢ的前景谢安勇,宋艳茹（中国科学院植物研究所,北京１０００４４）ＰＲＯＳＰＥＣＴＯＦＰＲＯＣＵＣＩＮＧＰＨＢ,ＡＢＩＯＤＥＧＲＡＤＡＢＬＥＰＬＡＳＴＩＣＢＹＵＳＩＮＧＢＩＯＴＢＣＨＮＯＬＯＧＹ￥ＸｉｅＡｎ－ｙｏｎｇ;Ｓｏ...