hEGF和hTGF—αN结构域与C结构域的功能差异

用ＰＣＲ的方法将人表皮生长因子和人转化生长因子－α（ｈＴＧＦ－α）的Ｎ结构域和Ｃ结构域互换,构造了两个嵌合分子Ｅ－ＴＧＦ（ＥＧＦ１－３２－ＴＧＦ－α３４－５０）和Ｔ－ＥＧＦ（ＴＧＦ－α１－３３－ＥＧＦ３３－５３）。野生型和嵌合分子基因在大肠杆菌ｐｈｏＡ系统表达并纯化定量。各重组体的受体竞争结合活性大小为ｈＥＧＦ〉ｈＴＧＦ－α和Ｅ－ＴＧＦ〉Ｔ０－ＥＧＦ,它们的促细胞生长活性的大小为ｈＴＧＦ－α和Ｅ－     

hTGF—α的C结构域半保守残基对其结构与功能的影响

ＥＧＦ家族Ｃ结构域有较高的同源性,其中有一些氨基酸表现为半保守性质。我们应用定点突变法对ｈＴ－ＧＦ－αＣ结构域的半保守残基进行突变,代之以ｈＥＧＦ的相应残基,构建３个突变分子ｈＴＧＦ－αＶ３５、ｈＴＧＦ－αＱ４４和ｈＴＧＦ－αＹ４５Ｒ４６。实验发现ｈＥＧＦ与ＥＧＦ受体的亲和力为ｈＴＧＦ－α的２倍,而３个突变体与ＥＧＦ受体的亲和力分别为ｈＴＧＦ－α的２２％,１３．４％和２５％;ｈＥＧＦ促ＮＲＫ－４９     

人转化生长因子β1在大肠杆菌中的分泌表达

为了研究双体形式生长因子的原核基因工程,尝试了人转化生长因子β１（ｈＴＧＦβ１）基因的分泌表达．通过缺失突变,构建了能表达具有天然一级结构的ｈＴＧＦβ１单体蛋白的周质分泌表达质粒．采用双顺反子表达系统,使ＴＧＦβ１在周质中获得了高效可溶性表达．研究了改善转运通路对重组蛋白分泌表达的影响,发现共表达σ３２基因和ｄｓｂＡ基因,可促进周质中ＴＧＦβ１双体分子的形成;而共表达ｓｅｃＥ／Ｙ基因对ＴＧＦβ１的分泌表达则没有明显影响．通过共表达ｋｉｌ基因,使ＴＧＦβ１在胞外培养基中获分泌表达,并在胞外折叠、组装形成具有生物活性的双体分子     

重组人肿瘤坏死因子α和白细胞介素6融合基因的构建和表达

本文利用ＰＣＲ技术和基因定位突变技术,将编码人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦα）和白细胞介素６（ｈＩＬ－６）成熟肽的基因通过中间接头连接成编码单一蛋白的基因,构建了融合蛋白表达载体ｐＢＩＴ,并在大肠杆菌中得到了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的电泳胶薄层扫描显示,融合蛋白的表达量是菌体总蛋白量的２０％,其分子量约为３７ｋＤ。活性检测证实,融合蛋白既有ＴＮＦ活性,又有ＩＬ－６活性。     

高效融合表达中载体蛋白对hIGF—I免疫原性结构形成的…

利用人工全合成人胰岛素样生长因子Ｉ（ｈＩＧＦ－Ｉ）基因,构建了分别以β－半乳糖苷酶的三种即含５９０、３１０、２８０个氨基酸序列片段和一种以Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｃ结构域为载体蛋白的融合型表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了以上各种ｈＩＧＦ－Ｉ的融合蛋白产物。通过对羟胺裂解前后的ｈＩＧＦ－Ｉ产物进行放射免疫结合测定分析;结果显示以β－Ｇａｌ５９０、３１０、２８０为载体蛋白;均严重影响与其融合的ｈＩＧＦ－     

高效融合表达中载体蛋白对hIGF－Ⅰ免疫原性结构形成的影响

利用人工全合成人胰岛素样生长因子工（ｈＩＧＦ－Ｉ）基因,构建了分别以β－半乳糖苷醇（β－ｇａｌ）的三种即含５９０、３１０、２８０个氨基酸序列片段和一种以ＰｒｏｔｅｉｎＡ的Ｂ、Ｃ结构域（ＰＡＢＣ）为载体蛋白的融合型表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了以上各种ｈＩＧＦ－Ｉ的融合蛋白产物。通过对羟胺裂解前后的ｈＩＧＦ－Ｉ产物进行放射免疫结合测定分析,结果显示以β－Ｇａｌ６９０、３１０、２８０为载体蛋白,均严重影响与其融合的ｈＩＧＦ－Ｉ的免疫原性结构形成,但在ＰＡＢＣ－ｈＩＧＦ－Ｉ融合蛋白中,载体蛋白ＰＡＢＣ无明显的影响作用。这表明在高融合表达低分子量蛋白或肽段中,需选择适宜的载体蛋白,以利于目的产物的功能性结构形成。     

人表皮生长因子(EGF)与单核-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合蛋白在大肠杆菌中的表达

应用基因工程技术,将ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ基因克隆到ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）载体的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明ＥＧＦ－ＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白获得表达,并且具有ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ的免疫学活性．这为进一步研究该融合蛋白的功能和肿瘤治疗提供一种新的基因产品．     

乙肝病毒表面抗原preS1与人肿瘤坏死因子α融合基因的表达

用ＰＣＲ法获得了ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（１－６５）肽段基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子（ｈＴＮＦα）之后,插入表达载体ＰＳＢ－９２中,使融合基因的５′端直接置于大肠肝菌ＰＬ启动子下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,获得了ＴＮＦ与ｐｒｅＳ１（１－６５）融合蛋白的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为２５ｋＤ,约占细菌总蛋白的３５％。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证,能分别特异地与ｈＴＮＦα抗体与ｐｒｅＳ１抗体结合,稀释复性后,该融合蛋白还具有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ９２９细胞的细胞毒活性）。经ＤＮＡ序列测定,ｐｒｅＳ１（１－６５）肽基因正确地融合在ｈＴＮＦα基因之后。该结果提供了一种制备ｐｒｅＳ１的新方法,为进一步开展治疗肝癌和乙肝的导向药物打下基础。     

人PSP94全长cDNA的获得及PSP94-TNF~Δ融合蛋白的构建

利用ＲＴ－ＰＣＲ从人肥大前列腺组织钓取９４个氨基酸的人前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）全长ｃＤＮＡ,序列分析结果与文献报道的完全一致．将ＰＳＰ９４成熟肽与人ＴＮＦα衍生物（ＴＮＦΔ）通过Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＡＰＧＴＰ在基因水平上融合成５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ,融合基因ＤＮＡ序列分析结果与设计的相符合．５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ在大肠杆菌中表达产物分子量约为３１ｋＤ,表达量约占菌体总蛋白量的３５％．以Ｌ９２９细胞和人前列腺癌细胞株ＰＣ－３为靶细胞进行细胞毒分析结果表明,５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ融合蛋白既具有ＴＮＦ的细胞毒活性,又具有对前列腺癌细胞ＰＣ－３的杀伤作用     

人碱性成纤维细胞生长因子基因克隆,cDNA5‘端修饰及在大 …

采用ｃＤＮＡ－ＰＣＲ技术,从人胎盘ｃＤＮＡ文库ＤＮＡ中克隆了人碱性成纤维在子（ｈｂＦＧＦ）基因,用ＰＣＲ突变法对其５＆端序列进行修饰,奖天然和修饰后的ｈｂＦＧＦ基因分别克隆至表达载体ｐＢＶ２２１,免疫抑迹和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果证明,经修饰后的基因在大肠杆菌ＤＳ５α中获得了表达,表达量占菌体总蛋白９％。     

rhGM—CSF／LIF融合蛋白基因的克隆及表达

利用基因重组技术,人工构建了一个编码五肽Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｓ的基因接头,将ＧＭ－ＣＳＦ和ＬＩＦ的ｃＤＮＡ相连而构成融合基因,将融合基因载入原核表达载体ｐＢＶ２２０后转化大肠杆菌,经热诱导后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹反应鉴定证实获得ｒｈＧＭ－ＣＳＦ／ＬＩＦ融合蛋白（简称ｒｈｇＭ－ＬＩＦ）活性测定表明重组的融合蛋白具有两因子双重活性。     

人α－肿瘤坏死因子基因的高效表达

用人工合成的α－肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是ＳＤ序列与起始密码子ＡＴＧ间距离（Ｄ）各异。计算机模拟计算出翻译起始区域（ＴＩＲ）中二级结构的最小生成自由能,以（Ｄ）为６个核苷酸时最小（绝对值）。它的表达效率也最高,产物ＴＮＦ－α可达菌体总蛋白的６０％。密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成ＴＮＦ－α基因（选用大肠杆菌偏爱的密码子）的表达效率高于ｓｃ－     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

人α降钙素基因相关肽与肿瘤坏死因子的融合表达

用半酶和半化学合成的方法合成和克隆了人ａ降钙素基因相关肽基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子之后插入表达载体ｐＳＢ－９２中,使融合基因的５＇端直接置于大肠杆菌ＰＬ启动下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,使ＴＮＦ与ＣＧＲＰ融合蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白既有ＣＧＲＰ的结合活性（酶标检测为阳性）又有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ－９２９细胞的细胞毒活性）。表达菌裂解液走ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳,显示     

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中…

通过ＲＴ－ＰＣＲ方法把葡萄扇叶病毒（ＧＦＬＶ）外壳蛋白基因（ＣＰ ｇｅｎｅ）分成两部分扩增,扩增产物克隆入ｐｇＥＭ－５Ｚｆ（＋）载体,并通过ＢｇｌⅡ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为１５１２ｂｐ,编码５０４个ＡＡ＇ｓ与国外株系ＧＦＬＶ－Ｆ１３相比,核苷酸同源性为８８．４％,氨基酸同源性为９５．８％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌Ｅ． ｃｏｌｉＤＨ－５α中得到了表达。     

高活性重组hG-CSF的制备

我们构建了新的硫氧还蛋白（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）融合表达载体ｐＥＴＴｒｘＬ和ｐＥＴＴｒｘ－ＨｉｓＬ,它们可使功能蛋白在大肠杆菌胞质中以可溶性形式高效表达。利用此表达系统成功地获得的ｈＧ－ＣＳＦ－硫氧还蛋白融合蛋白的高效可溶性表达,表达水平达总细胞可溶蛋白的４１％以上。所表达的ｈＧ－ＣＳＦ－硫氧还蛋白融合蛋白可通过Ｃｕ２＋－ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ固相金属螯合层析柱,方便地从细胞破碎可溶上清中直接纯化。所获得的融合蛋白具有ｈＧ－ＣＳＦ特异的生物活性,其比活性达到０．５－１．３３×１０７ｕ／ｍｇ融合蛋白。这样表达的ｈＧ－ＣＳＦ融合蛋白能被ＩｇＡ蛋白酶特异地切割,将ｈＧ－ＣＳＦ从融合蛋白上切下获得与天然蛋白一级结构完全一致的重组ｈＧ－ＣＳＦ 。     

人γ干扰素（IFN－γ）－表皮生长因子（EGF）融合蛋白的抗肿瘤细胞增殖作用与靶细胞的EGF受体有关

采用表皮生长因子（ＥＧＦ）受体丰富的Ａ４３１细胞进一步研究了人ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白￣〔１〕的抗细胞分裂活性,以及它和靶细胞ＥＧＦ受体的关系。结果表明,ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的抗肿瘤细胞增殖作用明显高于其母体分子。￣１２５Ｉ－ＥＧＦ受体竞争抑制试验表明,ＩＦＮ－γ可与ＥＧＦ竞争Ａ４３１细胞的ＥＧＦ受体,而ＩＮＦ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的ＥＧＦ受体竞争抑制作用更为明显,说明人ＩＦＮ－γ和ＩＦＮ－γ－ＥＧＦ３融合蛋白的抗肿瘤细胞分裂活性,与靶细胞ＥＧＦ受体被竟争抑制密切相关。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)融合蛋白的高效表达及鉴定

碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）参与了许多细胞生长和分化的调控过程。本文采用重组ＤＮＡ技术在大肠杆菌中高效表达了人ｂＦＧＦ。首先将编码人ｂＦＧＦ基因克隆到ｐＸＴ表达载体中与其上游的一短Ｓ导肽共一阅读框架,ｂＦＧＦ基因的表达受强的Ｔ７启动子调控。采用ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌作为宿主菌,用ＩＰＴＧ诱导ＢＬ２１（ＤＥ３）细菌合成的Ｔ７ＲＮＡ聚合酶,后者可催化高水平的ｂＦＧＦ基因表达,其ｂＦＧＦ产量可占总菌体蛋白的４２.５％。采用肝素Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ一步亲和层析法直接从诱导后的细菌裂解产物中得到纯化的重组人ｂＦＧＦ蛋白。经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析证明该蛋白可被人ｂＦＧＦ特异性单克隆抗体所识别。进一步研究证明该蛋白具有刺激ＮＲ６Ｒ－３Ｔ３成纤维细胞增殖的生物学活性,并且这一活性可被人ｂＦＧＦ特异性中和抗体所中和。     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的？…

将编码血管内皮细胞生长因子受体ＦＩｔ－１胞外区１－３ｌｏｏｐ３１６个氨基酸残基的ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ＦＩｔ＝１（１－３）,转化酵母景菌ＧＳ１１５,筛选Ｈｉｓ＾＋Ｍｕｔ＾ｓ表型转化子,经插瓶培养,１％甲醇诱导表达４ｄ后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,培养上清中ＦＩｔ－１（１－３）表达这总蛋白的３０－％     

血管内皮细胞生长因子受体(KDR)的分子克隆与原核表达

血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）是特异的血管内皮细胞促分裂素,它主要通过相应受体（ＫＤＲ）刺激血管内皮细胞增殖．ＶＥＧＦ及其受体在肿瘤血管形成中起重要作用．通过逆转录及多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）成功地从人脐静脉内皮细胞扩增出编码ＫＤＲ胞外ＶＥＧＦ结合区的ＤＮＡ片段,将该片段克隆在谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ中,获得在大肠杆菌Ｊｍ１０９的稳定表达．表达的不溶性融合蛋白可经碱变性法大量提取,为后续的研究工作奠定了基础．