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特异亲和活性蓝染料的小分子RNA的SELEX筛选 总被引:5,自引:1,他引:4
化学合成含有20 个核苷酸随机序列, 长度为73 个核苷酸的单链 D N A 随机库; P C R 扩增和双链化后, T7 R N A 聚合酶体外转录得到单链 R N A 随机库。以活性蓝染料凝胶柱为筛选介质, 体外进化方法筛选特异亲和活性蓝染料的 R N A 分子。经8 轮循环筛选, R N A 群体亲和染料的比例从小于0 .03 % 上升至22 .4 % 。克隆筛选出 R N A 序列后, 测定了30 个克隆的序列, 得到三类 R N A 分子。经二级结构分析和活性蓝染料特异亲和能力测试,发现 R N A 特异亲和活性蓝染料的主要结构因素是 R N A 形成的双链结构 相似文献
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为研究tRNATrp 与色氨酰tRNA合成酶(TrpRS) 的相互识别及其结构、功能关系, 纯化了枯草杆菌TrpRS并用溴化氰活化的Sepharose 4B 将TrpRS固定化, 固定化TrpRS的蛋白质回收率为95 .5 % , 活力回收率为31.3% 。研究了固定化TrpRS的酶学性质, 其热稳定性和贮存稳定性方面均比液相TrpRS有了较大的提高, 最适温度、最适pH 均有一定程度的增大, 工作稳定性良好。以固定化TrpRS为亲和层析介质, 对含有20 个核苷酸随机序列、长度为56 个核苷酸的单链RNA 随机库进行了3 轮筛选,RNA 群体亲和固定化TrpRS的比例从4 .3 % 上升至14 .7 % 。筛选得到了与tRNATrp 氨基酸接受茎类似的RNA二级结构。实验结果表明固定化TrpRS可以作为SELEX 亲和层析介质, 进行模拟tRNATrp 分子的RNA 随机库的SELEX 筛选。 相似文献
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大鼠肝tRNA^Ile基因的克隆与体外转录 总被引:1,自引:1,他引:0
采用PCR扩增出大鼠肝tRNA^Ile基因,构建了重组质粒pGWIW,并用T7RNA聚合酶/启动子系统对其进行了体外表达。经过对转录产物片段大小及运用Northermblot鉴定,证明了获得了不含修饰核苷酸的大鼠肝tRNA^Ile。生物学活性检测显示:合成基因体外转录产物氨基酰经活性是天然tRNA的40%,提示修饰核苷酸在哺乳动物Ile-tRNA合成酶的识别过程中起重要作用。 相似文献
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小双节RNA病毒中国株基因组第二节段的序列测定及分析 总被引:1,自引:0,他引:1
1997年从河北省一起成人腹泻暴发病人粪便中首次分离到小双节RNA病毒(picobirnavirus,PBV)中国株。为研究该病毒复制必需的依赖RNA的RNA多聚酶(RdRp)活性机理,采用改进的单引物扩增法克隆和测序了病毒基因组第二节段。结果表明:第二节段全长1696个核苷酸,只有一个ORF,占全长的93.9%,编码530个氨基酸残基的蛋白,5’-NTR AT丰富(75.4%),可能是本位调控元 相似文献
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根据锤头状核酶(Ribozyme)的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割12-脂加氧酶(12-LO)mNRA的核酶基因。以合成的25个核苷酸长的12-脂加氧酶RNA片段为底物与转录的核酶RNA一起保温检测其体 割活性。实验结果表明,在37℃保温时,核酶在体外对12-脂加氧酶具有较高的特异切割活性,其Km值为1300nmol/L,其kcat值为0.083/min,在50℃保温时,核酶具有很高的切割 相似文献
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人颌下腺cDNA文库的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究从新鲜的人颌下腺组织中提取总RNA,从中分离出带poly(A)尾的信使RNA[poly(A)〕mRNA],并合成带NotI位点的双链cDNA后,接上EocRI接头定向插入λgt11表达载体,经体外包装后转染Y1090宿主菌,遂构建成人颌下腺cDNA文库。该文库有4.1×105个噬菌体,重组率为100%,可供寡核苷酸探针和单克隆抗体两种方法筛选目的基因。 相似文献
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小麦条锈菌毒性小种及其无毒性突变型侵染初期,是不亲和反应的小麦叶片内可翻译mRNA水平迅速增加,而呈亲和反应叶片的增加幅度小且滞后。同时前者的Poly(A+)-RNA水平高于未接种对照,后者低于对照。32P标记实验证实不亲和反应叶片Poly(A+)-RNA的合成增加早于亲和反应叶片。Poly(A+)-RNA体外翻译产物经SDS-PAGE分离后,放射自显影图谱显示一些多肽条带的35S-Met相对掺入量有定量差异。 相似文献
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以采自河南的真菌传小麦花叶病毒(FWMV-C)为材料,抽提病毒RNA,合成互补DNA(cDNA)。对杂交筛选所得cDNA克隆进行亚克隆及序列分析,结果表明,亚克隆pGSI含有一个长度为891个核苷酸的不完整开放阅读框架(ORF)和长度为258个核苷酸的3'末端非编码区(NTR),并带有Poly(A)尾序。此段序列与大麦黄花叶病毒(BaYMV)及法国报道的一种小麦梭条花叶病毒(WSSMV-F)的RNA-13'末端分别具有67.6%和69.9%的同源性。由所测序列编码区(1-891nt)可推导产生296个氢基酸,并与WSSMV-F及BaYMV外壳蛋白氨基酸序列分别具有75.9%和71%的同源性。此结果表明,FWMV-C为另外一种不同于WSSMV-F的大麦黄花叶病毒组(Baymovirus)病毒,所测基因组片段应为RNA-13'末端序列,其中可能包括了病毒全长外壳蛋白编码区域。 相似文献
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中国河南株丁型肝炎病毒全基因组的cDNA克隆和序列分析 总被引:3,自引:0,他引:3
从我国河南-抗丁型肝炎病毒抗原(anti-HDAg)及丁型肝炎病毒(HDv)RNA双阳性的HBsAg携带者血清中提取RNA,采用人工合成的引物进行逆转录和聚合酶链反应(PCR),获得了贯穿HDV全基因组的6个相互重叠的cDNA片段。经双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析,得到了长度为1674bp的我国人河南株HDVcDNA全序列。计算机分析表明,该株与我国台湾株(HDVIA型)、美国-1株(HDVIB型)、日本-1株(HDVⅡ型)和秘鲁-1株(HDVⅢ型)的核苷酸同源性分别为的94.3%、86.8%、75.4%和66.3%,氨基酸序列的同源性分别为89.7%、85.1%、71.9%和64.6%,并在核苷酸和推导的HDAg氨基酸序列中分别发现了5个和2个集中保守的区域。这些区域均与HDV的某些重要功能密切相关。 相似文献
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将KGM和Sepharose 4B凝胶在相同条件下活化、偶联接上染料Cibacron Blue F3GA制成了KGM和Sepharose 4B染料亲和吸附剂,并用来与牛血甭白蛋白(BSA)作用,每毫升KGM亲和吸附剂可吸附BSA 28mg,用NaSCN洗脱时间为84.5%,而Sepharose 4B染料样和吸附剂每毫升可吸附BSA 15.3mg,用NaSCN洗脱时间收迷81.7%,并对两种凝胶的染 相似文献
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核酸酶保护试验在黄瓜花叶病毒株系鉴定中的初步应用 总被引:3,自引:0,他引:3
采用黄瓜花叶病毒(CMV)亚组Ⅰ株系Fny-CMVRNA_2的1209~1626核苷酸片段和亚组Ⅱ株系Ls-CMVRNA_2的2002~2433核苷酸片段的cDNA克隆,体外转录,同时掺入 ̄(32)P获得负链RNA探针,与纯化的番茄和甜椒上的CMV中国分离物的RNA杂交,结果表明:CMV番茄和甜椒中国分离物与Fny-CMV的核苷酸有高度同源性,隶属于Fny-CMV为代表的亚组Ⅰ株系。并利用K-CMV株系(亚组Ⅰ,源于中国)的RNA_2全长cDNA克隆的两个EcoRI位点间的核苷酸序列(1657~2125nt)作探针,与上述两种CMV中国分离物的RNA杂交,进一步比较分析了这两个分离物和K-CMV株系的关系。讨论了核酸酶保护法在CMV株系鉴定中的作用。 相似文献
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文库筛选与分子进化的核糖体展示新方法 总被引:3,自引:0,他引:3
利用适当的文库筛选技术快速、简便地从DNA文库、随机肽库、抗体库或其它蛋白文库中筛选生物活性物质是目前分子生物学研究的一个热点.核糖体展示是一种完全离体进行的功能蛋白筛选和进化鉴定的新技术,避免了传统的活体筛选技术的缺陷,使得文库容量增大、分子多样性加强.本文系统地评述了核糖体展示技术在制备ScFv单链抗体方面的应用,包括ScFv单链抗体模板的构建、体外转录与体外翻译、亲和筛选及筛选效率的测定以及分子多样性和体外进化研究,讨论了核糖体展示技术目前的发展动态、存在问题及发展趋势. 相似文献
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以甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物(NM)RNA为模板,通过反转录和PCR扩增得到了BNYVV RNA4基因组的cDNA克隆pGBF6。序列分析结果表明,pGBF6含有全长RNA4 cDNA插入片段,大小为1465个核苷酸,含有一个849个核苷酸的开放阅读框架,编码产生由282个氨基酸组成的分子量为31kDa的蛋白。与法国F2分离物RNA4相比,其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别 相似文献
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SELEX法筛选特异亲和淀粉的小分子RNA 总被引:2,自引:0,他引:2
SELEX法筛选特异亲和淀粉的小分子RNA*王琛金由辛**王德宝(中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,上海200031)关键词SELEX;2.5SRNA;兔肌糖元分枝酶指数式富集法配体进化,即SELEX[1](system-atic... 相似文献
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观察了脓毒血症大鼠心肌II型PLA2 活性、蛋白质含量及其m RNA 的变化。结果发现, 脓毒血症早期与晚期心肌II型PLA2 活性较对照组分别降低25 .0 % (P < 0 .05)及增高47.6 % (P < 0 .01),II型PLA2 蛋白质含量分别降低27.0% 及增高48 .0 %( 均P < 0 .01); 心肌II型PLA2 m RNA合成率与含量呈现类似的双相变化, 在脓毒血症早、晚期mRNA 合成率分别降低45.0% 和升高70.0 % (均P < 0 .01),mRNA含量分别降低34.1 % 和增加157 .0% (均P< 0 .01) 。脓毒血症早、晚期心脏II型PLA2 m RNA半衰期无显著变化(P > 0.05) 。实验结果表明大鼠脓毒血症发生过程中心肌II型PLA2 活性呈现出先下降后升高的变化, 这一变化受其mRNA 转录水平的调节。 相似文献
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基于螺旋区随机堆积的RNA二级结构预测 总被引:10,自引:0,他引:10
提出了基于螺旋区随机堆积的RNA二级结构预测算法,包括三个步骤:1.根据螺旋区定义,找出所有可能螺旋区;2进行螺旋区随机堆积,形成一定数目的RNA二级结构;3.统计处理,推测RNA可能折叠方式。最后以酵母Phe-tRNA为例来说明方法的可行性。 相似文献
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SELEX:一种体外筛选核酸适配子的新技术 总被引:2,自引:0,他引:2
甄蓓 《国外医学:分子生物学分册》2001,23(2):126-128
SELEX技术是一项新的体外筛选技术,它是用体外合成的、其库容为10^15左右的随机寡核苷酸库与靶物质结合。通过数轮的筛选与扩增,筛选到靶物质的目的DNA或RNA片段,对疾病的诊断与治疗方面起着重要的作用。为核酸的结构和功能的研究,提供了一个有效的方法。 相似文献