酵母转录因子PHO81基因的上游序列功能分析

利用ＰＨＯ８１ｌａｃＺ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对ＰＨＯ８１基因的表达是必需的：－４０１～－２８９ｂｐ和－１０１２～－８０１ｂｐ。比较ＰＨＯ８１和ＰＨＯ５,ＰＨＯ８４基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在－４０１～－２８９ｂｐ区域有ＰＨＯ４蛋白结合位点的核心序列５′ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ３′,以及ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ两侧富含Ａ／Ｔ的序列（可能是ＰＨＯ２结合位点）。推测－４０１～－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,－１０１２～－８０１ｂｐ可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对－１０１２～－８０１ｂｐ进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。     

应用实时BIA研究酵母PHO4和PHO2的相互作用

应用实时生物分子相互作用分析技术（ＢＩＡ）分析了酵母ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白的相互作用。将ＰＨＯ４蛋白通过氨基耦联在感应片上。进样５μｍｏｌ／Ｌ重组的谷胱甘肽转移酶融合的ＰＨＯ２蛋白（ＧＳＴ－ＰＨＯ２）及其两种突变体融合蛋白。结果表明ＰＨＯ２的２３０位丝氨酸变为天冬氨酸的突变体（ＧＳＴ－２ＳＤ）与ＰＨＯ４有强的表面等离子体激元共振信号,而生型ＰＨＯ２和２３０位丝氨酸变为丙氨酸的突变体（ＧＳＴ－２ＳＡ     

酵母PHO2与PHO4蛋白的激活活性的分析及两者的相互作用

ＰＨＯ２与ＰＨＯ４是酵母ＰＨＯ５基因的两个正调控因子,本文发现,ＰＨＯ２与酵母转录因子ＧＡＬ４的ＤＮＡ结合功能域融合后就能激活报道基因ｌａｃＺ的表达,其激活力受高低磷影响,表明ＰＨＯ２蛋白上存在酸性转录激活区。ＰＨＯ２蛋白上酸性氨基酸丰富的２８７－３２６肽段并非ＰＨＯ２的激活区。在ＰＨＯ２蛋白上２３０位Ｓｅｒ处于磷酸化状态２ＰＨＯ２才有激活作用,表明了这一磷酸化位点可能与ＰＨＯ２的转录激活能力有关     

酵母转录调控因子PHO81的结构与功能

本文发现ＰＨＯ８１蛋白上的碱性区和酸性区附近的微小变化可导致ｒＡＰａｓｅ的表达向组忝型转化,且这两个区域是协同作用的,而酸性区的净负电荷的降低能使ｒＡＰａｓｅ的活力降低。     

酵母转录因子PHO81锚蛋白重复序列表达和功能分析

酵母转录因子ＰＨＯ８１蛋白含有６个锚蛋白重复序列。将ＰＨＯ８１锚蛋白重复序列与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达（ＧＳＴ－ＡＮＫ）,表达产物以包含体形式存在。利用氧化型和还原型谷城肽系统对包含体进行复性,得到了可溶性蛋白,亲和纯化后,进行了活性分析。通过免疫共沉淀、分别制备了ＰＨＯ８５－ＰＨＯ８０和ＰＨＯ８５－ＰＡＰ１激酶复合物,用重组的ＰＨＯ４蛋白作底物,在激酶反应体系中加入ＧＳＴ－ＡＮＫ,发现它     

醇母PHO81基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游序列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得到完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ８１基因的表达水平,研究了它的表达作用。ＰＨＯ８１基因为阻遏型表达,受无机磷浓度的控制,高磷使基因表达阻遏,低磷去阻遏。ＰＨＯ８１对其自身的表达有正调控作用,它与ＰＨＯ５和ＰＨＯ１１基因的调控模式相似,但ＰＨＯ８１上游调控序列和ＰＨＯ５及ＰＨＯ１１的同源性很低。     

酵母转录因子PHO2在PHO5,HIS4及HO基因表达中的作用

酵母ＰＨＯ２蛋白在多个不同基因的表达中起作用,是一个多效的转录激活因子。本文比较了该因子要ＰＨＯ５,ＨＩＳ４及ＨＯ３种基因表达系统中的作用。ＰＨＯ２的缺失使ＰＨＯ５在低磷时不能去阻遏;使ＨＩＳ４和ＨＯ的表达分别降低到正常的２５％和４０％。如果把克隆于抵拷贝穿梭质粒的ＰＨＯ２基因转入ＰＨＯ２缺陷的酵母菌,则３种基因的表达都恢复正常。     

酵母PHO2蛋白的磷酸化研究

本文报道了ＰＨＯ２蛋白能被一种未知的蛋白激酶磷酸化。ＰＨＯ２蛋白的第２３０－２３３位氨基酸残基因组成一个可能ｐ３４＾ｃｄｃ３／ＣＤＣ２８相关的蛋白激酶识别的一致序列,用点突变的方法将Ｓｅｒ－２３０变成Ａｌａ可导致ＰＨＯ２蛋白激活ＰＨＯ５表达能力的完全丧失。     

酵母PHO2蛋白及其变异体与PHO5USA体外的相互作用

酵母ＰＨＯ２蛋白及其变异体与ＰＨＯ５ＵＳＡ体外的相互作用杨军,敖世洲（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,２０００３１）关键词酵母;ＰＨＯ２;突变;ＤＮＡ结合ＰＨＯ２是酵母阻遏型酸性磷酸酯酶基因转录的正调控因子［１］,由５５９个氨基...     

酵母PHO4基因的克隆与表达

用原位杂交方法从酵母菌染色体ＤＮＡ中分段克隆,拼接,获得完整的ＰＨＯ４基因,全长约３．４ｋｂ,利用体内同源重组的方法,构建了ＰＨＯ４基因缺失突变株。ＰＨＯ４基因的缺失导致酸性磷酸酯酶活性明显下降,将完整的ＰＨＯ４基因转入这种缺陷细胞,能使酶活性回复到野生型水平,ＰＨＯ４起正调控作用,构建ＰＨＯ４－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷酶的活力表示ＰＨＯ４的表达水平。融合基因不同名的表达表明,ＰＨＯ４基因     

酵母酸性磷酸酯酶转录调控因子PHO2的功能域分析

利用定点诱变,氨基酸插入或缺失的方法对ＰＨＯ２进行结构改造,观察对其功能的影响。ＰＨＯ２蛋白的同源域中有α－螺旋２－β－转我－α螺旋３的结构,是转录因子结构ＤＮＡ的功能域。定点诱变α－螺旋３上的Ｉｌｅ１２３为Ｐｒｏ１２３或者在α－螺旋２中插入ＰＤＰＤ４个氨基酸,破坏α－螺旋的结构,可导致ＰＨＯ２功能的丧失。氨基酸片段的缺失分析表明,Ｎ端Ｇｉｎ丰富区大部缺失,对ＰＨＯ２功能没有影响;而包含酸性氨基酸     

酵母PAP1与PHO85激酶复合物对PHO4的磷酸化

酵母ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＡＰ１与其它的ＰＨＯ８５结合蛋白ＰＨＯ８０、ＰＣＬ１及ＰＣＬ２有较高的同源性。我们上ＰＡＰ１与ＨＡ抗原的融合基因,利用抗－ＨＡ抗体进行免疫沉淀。体外翻译的融合ＨＡ标记肽的ＰＡＰ１与体外翻译的ＰＨＯ８５的免疫共沉淀证明了ＰＡＰ１与ＰＨＯ８５的结合。同时纯化了大肠杆菌表达的ＰＨＯ４蛋白,并构建了Ｐ９ＨＯ８５：：ＰＲＰ１缺失株。ＰＡＰ１与ＨＡ的融合基因被置于酵母ＡＤＨ１启动子的控     

芽残酵母PHO85基因对细胞周期调控的影响

By homo-recombination with yeast intergrating plasmids, a serial of haploid mutants of budding yeast YPH499 had been constructed, which included pho85 delta strain YPH600, pho85 delta cln1 delta strain YPH610, cln1 delta cln2 delta strain YPH640 and galactose inducible strain YPH630 (pho85 delta cln1 delta cln2 delta (GAL1-10PHO85)). By analyzing the growth rate of different strains, we concluded that PHO85 gene have greater influence than CLN1 and CLN2 genes on cell growth control. After transferred from galactose media to glucose media, the tri-mutant cells collected at intervals were observed with microscope and analyzed by FACS. The results showed that the tri-mutant cells arrest in G1 phase when they were transferred to glucose media.     

植物花药花粉特异性基因的调控序列

植物的花药发育和花粉成熟过程中,有大量的基因表达,肯许多是花药和花粉组织特异性的,本文介绍了几种已知的花药和花粉特异笥基因及其上游调控序列,并简单地介绍了花粉特异性的启动子在植物基因工程中的应用。     

植物花药花粉特异性基因的调控序列

植物的花药发育和花粉成熟过程中,有大量的基因表达,其中有许多是花药和花粉组织特异性的,本文介绍了几种已知的花药和花粉特异性基因及其上游调控序列,井简单地介绍了花药特异性的启动子在植物基因工程中的应用。     

酵母PHO85结合蛋白PAP1基因的克隆和表达

酵母调探因了ＰＨＯ８５是一个依赖于细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）的蛋白酶（ＣＤＫ）,参与对细胞周期和酸性磷酸酯酶基因表达的调控。冯ＰＨＯ８５为靶分子,利用酵母的染色体基因文库中克隆到了一个新的与ＰＨＯ８５相结合的蛋白因子的基因,利用酵母双杂交（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）系统从酵母的染色体基因文加中克隆到了一个新的与ＰＨＯ８５相结合的蛋白因子的基因,将此蛋白质命名为ＰＡＰ１（ＰＨＯ８５ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ     

鹅卵清蛋白基因5'端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出1．2kb的鹅清蛋白基因5’端调控区,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点(标记为pOV),经酶切和测序鉴定：扩增产物只有3个碱基发生了突变,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异,表明鹅清蛋白基因5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列。为构建其启动外源基因的质粒表达载体奠定了研究基础。     

牛β-酪蛋白5'端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用ＰＣＲ扩增了牛β－酪蛋白基因５‘－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取ＤＮＡ。在牛β－酪蛋白基因外显子１和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为１９个核苷酶,引物间跨度为６３５ｂｐ。以牛肝ＤＮＡ为模板,进行ＰＣＲ扩增,扩增产物在２％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。