神经细胞微囊偏侧帕金森病猴脑内移植的组织学观察

通过脑内移植脉络膜细胞(CP)海藻酸盐微囊观察偏侧帕金森病样猴脑神经组织学改变,以探讨微囊化CP对灵长类动物纹状体神经元的保护作用.用海藻酸盐多聚鸟氨酸微囊包裹猪脉络膜细胞,移植至偏侧帕金森病样猴黑质-纹状体通道,移植后6个月进行神经病理学检查,观察脑组织学变化.脉络膜细胞微囊脑内移植能改善偏侧帕金森病猴行为,能促进多巴胺能纤维增生和活动增强.     

微囊化基因工程细胞移植的研究进展

微囊化基因工程细胞移植是将目的基因通过基因转染技术导入到靶细胞内,再将该细胞微囊化后植入受体体内,具有组织相容性好,避免了机体的排斥反应(免疫隔离),且微囊内的功能细胞可以长期存活,发挥其生物学效应。该技术使得异种组织细胞或基因工程细胞移植成为可能,在神经内分泌及代谢疾病等方面的研究取得了可喜的进展,具有广阔的应用前景。     

APA微囊微环境影响胚胎干细胞增殖分化的体外研究

以小鼠胚胎T细胞（embryonic stem cell,ESC）为模型,在牛理条件F对ESC进行微囊化包封、培养,并利用免疫组织化学技术及RT-PCR方法检测其生长及未分化状态,以期建立微囊化ESC这一体外培养模型,同时明确海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（alginate-poly-lysine-alginate,APA）微囊微环境对ESC增殖及分化潜能的影响。结果表明：ESC能够在微囊（包括液化型及非液化型）或微球（海藻酸钙胶珠）内生长良好,但因生长环境存在差异,其表现的生长行为各具特征。比较其它类型,ESC在液化型APA微囊内的存活期限最长。经体外维持培养3周以上,仍能持续表达胚胎源未分化T细胞的标志性蛋白AP,SSEA-1及转录因子Oct-4。为进一步明确微囊内增殖的ESC是台仍具有多向分化的干细胞潜能,应用机械破囊法释放微囊内ESC团,并在体外进行定向诱导。经过近3周的条件诱导,其结果为：细胞团DTZ染色阳性：anti-insulin免疫荧光检测阳性;且特异性表达Pdx-1,Ins-1基因。上述结果证明：APA微囊为ESC维持未分化状态的增殖提供了特殊的微环境,APA微囊内所形成的ESC团仍具有多向分化的干细胞潜能。     

微囊化胰岛B细胞系体外生长和分泌功能的研究

目的：研究海藻酸钠－多聚赖氨酸－海澡酸钠（APA）微囊化胰岛B细胞系BTC6－F7的生长和分泌规律,探索其作为生物人工胰岛的可能性。方法：以微囊静电液滴发生器制作APA微囊化BTC6－F7细胞,体外培养并定期测定微囊化细胞的生长和胰岛素分泌。结果：在实验观察的90d内,BTC6－F7细胞可在微囊内以细胞团的形式生长、存活。囊内细胞总数随培养时间的延长而增加,但细胞活率呈下降趋势,胰岛素分泌与囊内活细胞数的变化规律一致,最初呈上升趋势,然后较长时间维持在相对恒定的水平。结论：本研究所制备的APA微囊化胰岛B细胞可在较长时间内保持生长、存活和分泌功能,为进一步发展生物型人工胰岛奠定了基础,并可用于糖尿病的发病机理和治疗研究。     

脉络丛细胞微囊脑内移植前后的物理及生化性能研究

通过测定脉络丛细胞海藻酸盐微囊在大鼠脑内移植前及移植后的物理及生化性能变化,以探讨其应用于移植治疗神经系统疾病的可行性.用海藻酸盐多聚鸟氨酸微囊包裹猪脉络膜细胞,移植至大鼠黑质-纹状体通道,移植前、移植后4个月及6个月分别测定微囊的大小、形态及细胞的活力、分泌蛋白质及神经营养因子的能力、蛋白质组学的变化.脉络膜细胞微囊在移植前、后大小、细胞活力、蛋白质组学分析、分泌蛋白质及神经营养因子的能力无显著变化.海藻酸盐-多聚鸟氨酸CP微囊能有效地防止脉络膜细胞被受体免疫系统所攻击,使得它们能在大鼠的大脑存活6个月以上并不引起不良作用.     

胚鼠黑质细胞分别移植于帕金森病模型鼠纹状体和侧脑室的比较研究

胚鼠黑质细胞悬液分别移植于帕金森病（ＰＤ）鼠纹状体和侧脑室。移植后两组动物的Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ诱导旋转行为均得到极明显改善,移植细胞生长发育良好。移植细胞和宿主细胞间的信息联系,在纹状体内可能以突触传递方式为主。侧脑室内移植的黑质细胞,相当于人工放置的“接触脑脊液神经元”,可能主要通过非实触传递方式而发挥作用。     

微囊化重组CHO细胞制备和培养条件的优化

微囊化重组基因细胞移植治疗肿瘤是一种新兴的肿瘤基因治疗方法,然而由于目前微囊化细胞规模化制备和培养技术还不成熟,阻碍了其在临床治疗中的推广与应用。以重组CHO细胞为模型,考察了不同的微囊制备和培养条件对微囊化细胞生长和内皮抑素表达的影响。实验表明,种子细胞所处的生长阶段和细胞接种密度对微囊化细胞生长和内皮抑素表达的影响较大,对数生长期的细胞进行包囊并且细胞接种密度为1×106~2×106cells/mL微囊时微囊内细胞生长良好、内皮抑素表达量高。微囊制备时间对细胞活性和内皮抑素表达也有较大的影响,制备时间延长对细胞的损伤增大,因此制备时间应控制在5h以内。生物微胶囊在制备过程中会造成细胞损伤,而体外培养是恢复细胞活性的良好方法,在培养过程中微囊接种量为5%时对细胞生长和内皮抑素表达有利。     

多巴胺合成相关酶基因联合治疗帕金森病大鼠模型的研究

目的 利用骨髓间充质干细胞（MSCs）作为运载细胞,携带DA合成代谢过程中3个重要相关酶的基因：酪氨酸羟化酶（TH）、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC) 和三磷酸鸟苷酸环化水解酶-I (GCH-I)基因,治疗帕金森病(PD) 模型大鼠。方法 首先用重组病毒AAV-TH、AAV-AADC 和AAV-GCH-I的上清液对MSCs进行体外感染;将携带有TH、AADC和GCH-I基因的MSCs移植到PD模型大鼠纹状体内,检测纹状体及黑质内多巴胺及其代谢产物的变化,并观察其行为学的变化,以评估上述基因对PD大鼠的治疗作用。结果 重组假病毒颗粒感染MSCs后植入PD模型大鼠损伤侧纹状体内。通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 和原位杂交的方法在移植后12w仍能检测到上述三种基因的表达。免疫荧光检测发现移植后12w MSCs在脑内存活良好;移植后4w、8w、12w行为学观察发现阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为较对照组LacZ基因移植组有明显改善（p<0.01）;移植后12w时三重基因移植组较双重基因移植组有明显改善（p<0.01）。移植后12w用高效液相色谱（HPLC）电化学法测定损伤侧纹状体和黑质内DA及其代谢产物3,4-二羟苯丙酸（DOPAC）的含量,三重基因移植组较hTH+hGCH-I基因移植组有明显增高（p<0.01）;三重基因移植组较hTH+hAADC基因移植组有所增高,但两组之间没有显著性差异。结论 基因工程改造的MSCs 在移植到PD模型大鼠脑内后可以很好地表达目的基因并在对动物行为学及生化方面改善的长期观察中发现三重基因联合脑内移植可能是比双重基因联合移植更佳的帕金森病基因治疗途径。     

毕赤酵母表达的neurturin对恒河猴帕金森氏病模型中黑质多巴胺能神经元的保护作用

帕金森氏病(PD)是由于多巴胺能神经元变性、坏死,导致黑质-纹状体系统的多巴胺含量下降而引起的一种神经系统退行性疾病,目前还没有一种很好的方法能使之治愈.Neurturin（NTN）能特异地作用于中脑多巴胺能神经元,对该类神经元具营养和保护作用.经静脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导恒河猴产生帕金森氏病模型,并在NTN治疗组,注射MPTP之前48 h脑室内注射重组毕赤酵母表达的人NTN 1 mg. 结果表明：模型组猴均逐渐出现了PD症状,而NTN治疗组猴,PD症状比较轻或不明显;荧光分光光度法测定MPTP模型组猴黑质、壳核和尾状核多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）的含量结果与正常对照组相比均显著降低,NTN治疗组猴的黑质、壳核和尾状核中的DA、5-HT和5-HIAA与对照组相比无显著性差异,而与模型组相比,DA、5-HT和5-HIAA含量均明显增加;光镜检查MPTP模型组猴黑质神经元细胞明显脱失,而NTN治疗组猴黑质神经元细胞丢失不明显,与正常对照组猴无差别.上述结果表明,制备的重组人NTN在恒河猴体内能保护中脑黑质多巴胺能神经元不受MPTP的损伤,使其DA含量及多巴胺能神经元维持正常,在MPTP存在下没有发生PD症状.     

人胚DA能神经元移植于帕金森氏病猴模型的TH免疫细胞化学的研究

为了对人胚黑质ＤＡ神经元移植治疗ＰＤ人的临床应用作出客观评估,将８－１２周人胚黑质细胞移植到用ＭＰＴＰ诱发的偏侧ＰＤ猴新纹状体内。实验动物分别存活２个月、５个月和１年后,用ＴＨ免疫细胞化学方法对被移植的人胚ＤＡ细胞的存活和与宿主间的突触联系进行检查。在光镜下可见被移植侧的新纹状体内有ＴＨ阳性细胞,它们成小群散在分布,每小群有３－１０个细胞。ＴＨ阳性细胞的轴突延伸到整个新纹状体,树突呈现出正常发育过     

EB病毒诱导胸腺恶性T细胞淋巴瘤的研究

为研究EB病毒在恶性T细胞淋巴瘤发生中的作用,将EB病毒感染的人胚胸腺细胞移植于Scid鼠皮下,于移植后第3日起在移植处对侧皮下注射TPA50ng／只,每周1次。于移植后第4周起,移植处皮下有结节状隆起形成,并逐渐增大。于6－15周内行病理学检查和免疫组织化学染色,证实为T细胞淋巴瘤8例。其中实验组胸腺细胞＋EBV的成瘤率为25％（1／4）,胸腺细胞＋EBV＋TPA组的成瘤率为53.8%（7／13）,对照组胸腺细胞＋TPA的成瘤率为0（0／5）。PCR和 闰杂交在诱导肿瘤可可检测到EB病毒的基因EBERs、LMP1和BARF1,并有病毒基因LMP1蛋白编码产物的表达。EB病毒可感染人胚胸腺细胞,并使其发生恶性转化,EB病毒可能在恶性T细胞淋巴瘤的发生中起病因作用。     

海马内移植颈上神经节组织改善穹窿－海马伞横切大鼠的记忆功能

３８只Ｗｉｓｔａｒ大鼠双侧穹窿－海马伞损伤后．以被动回避反应为指标观察到记忆明显受损,与损伤前相比,有记忆动物自６５．３％降至１３．６％,两者差别非常显著。于穹窿－海马伞损伤后记忆丧失动物（ｎ＝１５）自体一侧分离出颈上神经节（ＳＣＧ）,切为２－３块并在室温下孵育于２０—５０μｇ／ｍｌ２．５ｓＮＧＦ中１—２ｈ,而后移植于自体双侧海马背侧,移植４周后观察到动物记忆明显恢复,恢复记忆的动物数占７３．３％。在行为实验基础上应用荧光组化方法检查了移植细胞成活情况并测量了海马内去甲肾上腺素（ＮＡ）的含量。移植后２周海马内ＮＡ含量比损伤组有明显上升。移植后一个月,可见部分移植细胞成活并有神经纤维生长。实验表明．穹窿－海马伞损伤大鼠海马内自体移植ＳＣＧ,通过神经递质的局部补充对动物丧失的记忆能力具有一定改善作用。     

大鼠实验性帕金森病的基因治疗

将稳定转染了大鼠酪氨酶羟化酶（Ｔｙｒｏｓｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ,ＴＨ）基因的大鼠成肌细胞移植于帕金森病大鼠模型的纹状体,进行基因治疗研究。ＲＴ－ＰＣＲ和免疫组织化学检测都证明转基因细胞可在纹状体内存活并表达ＴＨ,动物的不对称旋转行为明显改善,而且疗效可维持半年以上。     

骨髓间充质干细胞移植对异丙肾上腺素致心力衰竭大鼠心功能及炎性细胞因子表达的影响

目的：观察骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对异丙基肾上腺素（ISO）致心力衰竭大鼠心脏功能和炎性细胞因子（TNF—α、IL-1β和IL-6）表达的影响。方法：采用全骨髓培养方法分离培养大鼠的MSCs;雄性Wistar大鼠45只,随机分为：正常对照组（n=15）、模型组（n=30）。正常对照组给予生理盐水皮下注射、模型组采用170mg／kg的剂量皮下注射ISO,连续4天给药;各组动物末次皮下注射4周后,行超声心动图检查,将模型组LVEF〈70％的大鼠（n=20）随机分为细胞移植组（n=10）和培养液组（n=10）,后大鼠开胸,细胞移植组将150μL（3×10^6MSCs）用微注射器分4点注射到左心室前壁,培养液组和正常对照组给与心肌内注射等量细胞培养液。移植后4周用超声心动图检测大鼠的心功能,并取心脏组织行免疫组化染色。结果：移植后4周,与正常对照组比较,细胞移植组和培养液组LVDs明显增加,EF和FS明显下降（P〈0．01）;而和培养液组相比,细胞移植组LVDs明显下降、EF和FS明显升高（P〈0．05）;免疫组化染色结果显示,与培养液组比较,细胞移植组TNF—α、IL-1β和IL-6阳性表达细胞明显降低（P〈0．05,P〈0．01,P〈0．01）。结论：MSCs移植可以改善心衰大鼠的心脏功能,同时下调心衰大鼠心脏炎性细胞因子TNF—α、IL-1β和IL-6的表达。     

多能成体祖细胞培养条件促进人脂肪干细胞的视网膜神经保护功能

目的：检测多能成体祖细胞（MAPC）的培养条件对猴骨髓间充质细胞（BMMSCs）和人脂肪干细胞（hADSCs）生长的影响,旨在获得更适合治疗视网膜变性疾病的供体细胞。方法通过细胞形态观察、MTT实验、克隆形成率、PCR检测、以及成脂、成骨、成软骨分化潜能检测等,研究MAPC培养条件下猴BMMSCs和hADSCs的特征,并用DMEM/LG和MAPC培养条件培养的hADSCs进行RCS大鼠视网膜下腔移植,通过视网膜电图（ERG）和TUNEL检测,判断细胞移植治疗对视功能及视网膜细胞凋亡的影响。结果与常规培养基相比,MAPC培养条件能促进猴BMMSCs增殖,细胞变小,但传2代后,细胞变得宽大扁平,出现衰老征象;然而,MAPC培养条件下的hADSCs细胞增殖能力及克隆形成率均增强,形成的克隆较大可稳定传10代以上,且具有成脂、成骨、成软骨的多向分化潜能,细胞表面标记物及细胞因子出现差异表达：CD140b、CD90、CD47、HGF和PEDF显著上调,CD73、CD105和IL-6显著下调。与对照组相比,移植DMEM/LG和MAPC培养条件培养的hADSCs（P4）3周后,RCS大鼠的B波波幅明显升高,外核层细胞凋亡明显减少。结论 MAPC培养条件培养的hADSCs显示出更好的视网膜神经保护作用,适合用于治疗视网膜退行性疾病。     

骨髓间充质干细胞源神经细胞移植治疗帕金森病大鼠模型

目的探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）源神经细胞脑内移植对帕金森病（Parkinson s disease,PD）大鼠的治疗作用。方法贴壁培养法分离、培养大鼠骨髓MSCs,脑匀浆上清诱导第3代MSCs向神经细胞分化,采用免疫细胞化学法鉴定诱导分化后细胞的性质,激光共聚焦显微镜检测诱导前后细胞Ca2＋浓度变化,6只PD大鼠行纹状体内MSCs源神经细胞移植作为细胞移植组,6只PD大鼠作为对照组。细胞移植术后4周检测PD大鼠的行为变化,观察移植细胞在脑内的分布情况。结果倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,有1～2个核仁,MSCs经脑匀浆上清诱导后其胞体折光性增强,发出数个细长突起,互相交织成网,有的似轴突。诱导后细胞表达神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白（NF）,胞质Ca2＋荧光强度显著增强,可推测诱导后的细胞为MSCs源神经细胞,将BrdU标记的MSCs源神经细胞移植到PD大鼠纹状体治疗4周后,可见细胞散在分布于注射侧脑组织,有少量细胞可迁移到对侧脑组织,PD大鼠的旋转行为得到显著改善。结论MSCs源神经细胞移植治疗帕金森病大鼠可使其旋转行为得到改善。     

骨髓间充质干细胞黑质内移植对帕金森病大鼠的治疗作用

目的探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植到帕金森病（Parkinson’s disease,PD）大鼠毁损侧黑质内,PD模型大鼠的姿势不对称性和黑质及纹状体内酪氨酸羟化酶（tyrosinehy droxylase,TH）表达的改变,以及BM—SCs在大鼠脑内的存活、分化情况。方法黑质、前脑内侧束两点法注射6一羟多巴胺（6-OHDH）并行为学分析筛选PD模型大鼠。将PD模型大鼠随机分为移植组和对照组。BMSCs移植术后4周和8周,观察大鼠姿势不对称性,免疫组织化学及免疫荧光显色方法检测黑质和纹状体酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表达变化以及BMSCs在大鼠体内的存活、迁移及分化情况。结果BMSCs黑质内移植可使PD模型大鼠的转动频率由（10．62±2．97）r／min降至（4．65±1．08）r／min（P〈0．01）,显著增加毁损侧黑质TH阳性细胞数量和纹状体内TH阳性纤维密度。BMSCs在大鼠黑质内可以存活至少8周,部分细胞分化为神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结论黑质内移植BMSCs对PD模型大鼠有一定的治疗作用。     

表达内皮抑素的rCHO细胞的微囊化培养

微囊化重组基因细胞移植治疗肿瘤是一种新兴的肿瘤基因治疗方法,如果将此技术应用到临床研究,就需要制备大量的细胞活性良好、重组蛋白表达量高的生物微胶囊。种子细胞是生物微胶囊治疗作用的执行者, 是构建微囊微反应器的基本元素。如何获得大量高活性的种子细胞已经成为规模化制备生物微胶囊所面临的最关键的限制因素。本实验考察了搅拌式生物反应器内扩增的重组CHO细胞进行包囊及微囊化细胞在生物反应器内规模化培养的可行性。实验结果显示:重组CHO细胞在生物反应器内可以快速生长,并且对数期细胞包囊,微囊化细胞活性良好。制备的微囊化细胞可以在生物反应器内培养,与培养板培养比较细胞生长较快、内皮抑素表达量较高。应用生物反应器培养技术能够在体外快速、大量扩增重组CHO细胞,满足微囊化细胞制备对种子细胞量与质的要求,微囊化细胞可以在生物反应器内培养。     

聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米微囊介导质粒转染骨髓间质干细胞

骨髓间质干细胞基因修饰及细胞移植是再生医学领域新兴的治疗策略和研究热点. 利用非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导质粒转染骨髓间质干细胞, 观察共聚物/质粒纳米微囊在骨髓间质干细胞的吸附、内吞以及表达效率. 结果表明, 聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米微囊能保护质粒免受核酸酶降解, 将质粒包裹为直径100~150 nm的微囊并吸附于骨髓间质干细胞表面, 经由细胞内吞, 转染效率约为11.7%, 比阳离子脂质体介导的转染效率高8.5%, 是用于干细胞转染的良好基因载体.     

骨髓间充质干细胞在大鼠体内的迁移研究

目的:将体外预先标记的骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)移植到大鼠脑内观察细胞的存活和转归,从在体(invivo)角度阐明MSCs在中枢神经系统疾病细胞治疗中的潜在应用前景。首先用DiI在体外标记MSCs。将标记后的MSCs分别移植到大鼠纹状体和侧脑室,在移植后2w和4w灌杀动物,进行脑组织及脊髓的冰冻切片,在荧光显微镜下观察细胞的存活与转归。结果:移植到纹状体的MSCs可沿针道向周围实质迁移,迁移的最远距离可达0.2mm。并且,在大脑皮层及其他脑实质的血管壁、血管中以及血管周围还可见到标记细胞;而移植到侧脑室的MSCs则主要沿脑室系统迁移,细胞主要分布在移植侧侧脑室,对侧脑室与第四脑室也有分布,也有少量细胞沿侧脑室向周围实质迁移,迁移的最远距离为0.23mm。还可见到沿胼胝体向对侧脑室迁移的细胞流,甚至有个别细胞迁移至脊髓腰段。所有动物在细胞移植后4周均未发现肿瘤形成。结论:MSCs脑内移植后可以在中枢神经系统内存活并迁移,无致瘤性。结果提示骨髓间充质细胞是很多疾病细胞与基因治疗的有力工具。