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1.
合成的编码大肠杆菌tRNAArg2的基因,嵌入受IPTG诱导启动子控制的质粒pTrc99B中。用上述含目的基因的质粒转化大肠杆菌MT102,得到tRNAArg2基因序列正确的克隆。诱导表达后,与受体菌相比,转化子中的tRNAArg的含量高出10倍,tRNAArg2的含量高出30倍,占总tRNA的70%。DEAESephacel柱层析后,tRNAArg2的纯度即可达到88%。再用benzylDEAEcelulose柱层析可得到纯度为99%、精氨酸接受活力为1600pmole/A260单位的tRNAArg2。从4升过夜培养液中得到的40mg总tRNA。从中可得到18mg纯tRNAArg2,产率为62%。首次精确地测定了精氨酰tRNA合成酶催化tRNAArg2时的动力学常数。 相似文献
2.
大鼠肝tRNA^Ile基因的克隆与体外转录 总被引:1,自引:1,他引:0
采用PCR扩增出大鼠肝tRNA^Ile基因,构建了重组质粒pGWIW,并用T7RNA聚合酶/启动子系统对其进行了体外表达。经过对转录产物片段大小及运用Northermblot鉴定,证明了获得了不含修饰核苷酸的大鼠肝tRNA^Ile。生物学活性检测显示:合成基因体外转录产物氨基酰经活性是天然tRNA的40%,提示修饰核苷酸在哺乳动物Ile-tRNA合成酶的识别过程中起重要作用。 相似文献
3.
利用T7RNA聚合酶/启动子表达系统在大肠杆菌JM109(DE3)中表达化学合成的大鼠肝tRNA^Ile基因,经酚抽提,DEAE-52离子交换柱层极及PLC层析,分离纯化大鼠肝tRNA^Ile,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Noprthern-blot鉴定表明,大鼠肝tRNA^Ile基因成功地获得表达,氨酰化活性检测表明,纯化后,每1A260(40μg)的tRNA^Ile可负载约650pmol的Ile 相似文献
4.
精胺和Mg^2+对tRNA^Ile圆二向色谱的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
由于精胺能特异异地刺激哺乳动物tRNA^Ile的氨基酰化,本文用纯化的牛肝tRNA^Ile观察了精胺和Mg^2+对tRNA^IleCD光谱的影响。结果显示:Mg^2+可使牛肝tRNA^IleCD光谱峰向短波方向偏移2nm,波峰为263nm,峰值被增大约10%ΔθMg^2+=2.3×10^3deg.cm^2/dmol;而精胺使牛肝tRNA^IleCD兴谱峰减少40%,Δθspermine=1×10^ 相似文献
5.
大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化… 总被引:1,自引:1,他引:0
本文从含ArgRS306KR基因args306KR的pUC18重组质粒的大肠杆菌TG1转化子中经DEAE-Sephacel和Blue-Sepharose两步柱层析,得到电泳一条带的ArgRS306KR。纯酶的比活为2790单位/毫克。该酶氨酰化和ATP-PPi交换活力的最适PH分别为PH8.3和PH7.5。氨酰化活力对ATP、Arg和tRNA的Km分别2.6mmol/L、14.0μmol/L和5. 相似文献
6.
大肠杆菌亮氨酰—tRNA合成酶LeuRS67R的纯化及其动力学研究 总被引:1,自引:1,他引:0
本实验室已得到的亮氨酰-tRNA合成酶基因,与文献相比,67位氨基酸残基由His变为Arg,此酶被定名为LeuRS67R。我们从该基因与pUC19重组质粒的大肠杆菌TG1转化子TG1-91中得到LeuRS的高表达,粗抽液中LeuRS的表达量在转化子中比在宿主菌TG1中高20倍以上。用三步柱层析得到电泳一条带的酶,其比活为1789单位/毫克。测定其动力学常数,氨酰化活力为Leu、ATP的Km值分别为 相似文献
7.
构建了3种来源于水稻、人和啤酒酵母的线粒体tRNA^Trp基因。实验表明这些线粒体tRNA^Trp的体外转录产物具有被枯草杆菌色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)氨酰化的能力,但是不能被鼠肝来源的氨酰tRNA合成酶粗酶所催化。动力学资源常数测定表明枯草杆菌TrpRS对线粒体tRNA^Trp的亲和力为野生型tRNA^Trp的一半,而在催化效率上,水稻和啤酒酵母线粒体tRNA^Trp的色氨酰化能力比野 相似文献
8.
本文利用pAmy413质粒通过定点诱变技术,在α-淀粉酶基因的287和291位分别引入1个G和C,代替原来的T和G,构建成质粒pAMY413B使成熟的α-淀粉酶N-端^7Leu^8Met变为^7Arg^8Ile,pAmy413Lα-淀粉酶信号序列因引入1个多酶切点接头而比pAmy413的29个氨基酸增加了13个氨基酸,创造了1个新的信号肽酶I识别窗口Ala-Gln-AlaSer,利用计算机对该信号 相似文献
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本文从含ArgRS306KR基因args306KR的pUC18重组质粒的大肠杆菌TG1转化子中经DEAE-Sephacel和Blue-Sepharose两步柱层析,得到电泳一条带的ArgRS306KR。纯酶的比活为2790单位/毫克。该酶氨酰化和ATP~PPi交换活力的最适pH分别为pH8.3和pH7.5。氨酰化活力对ATP、Arg和tRNA的Km分别为2.6mmol/L、14.0μmol/L和5.0μmol/L:Vmax为7630单位/毫克;koat为9S-1。ATP~PPi交换活力对ATP和Arg的Km分别为8.3mmol/L和99μmol/L;Vmax为16320单位/毫克;kcat为18S-1。 相似文献
10.
大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的Lys306为酶活力所必需 总被引:2,自引:2,他引:0
将大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)上Lys306用基因点突变的方法分别变为Ala和Arg的密码子,得到变种基因args306KA和args306KR。变种基因重组在pUC18上,转化到大肠杆菌TG1中,转化子中ArgRS及其变种ArgRS306KA和ArgRS306KR所表达的蛋白量生活为TG1表达ArgRS蛋白量的100倍。细胞粗抽提液中ArgRS的比活TG1,转化子pUC18-arg 相似文献
11.
在酵母体内用RNA聚合酶II表达大肠杆菌tRNA^Sec基因 总被引:1,自引:1,他引:0
我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸tRNA基因(SelC基因)连接到分泌型表达质粒PVT102U-αMFL中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于SelC基因的下游。将该质粒转化酵母,通过SDS-PAGE分析,在SD液体培养基中检测出7 ̄8kd的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总RNA用互补与该tRNA TψC茎环区的21-mer寡核苷酸,经5'标记后作为探针进行North 相似文献
12.
人白细胞介素—2第20位残基局部空间结构稳定性对活性的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
用寡核苷酸诱导的基因定位突变法,将人白细胞介素-2(IL-2)第20位Asp分别突变为Arg,Lys和Asn,比较第20位残基碱性基团对IL-2活力的影响,结果^20Asp突变为碱性残基时,IL-2活性急剧下降,但突变为Arg时所导致的活性下降较突变为Lys时所导致的活性下降较突变为Lys严重3000倍以上。从空间结构变化上对这2个碱性残基造成的如此大的活性差异进行了分析,发现^20Arg突变后对 相似文献
13.
精胺对牛肝tRNA^lle氨基酰化的刺激作用 总被引:3,自引:0,他引:3
本实验用纯化的牛肝异亮氨酸tRNA(tRNA^Ile)和异亮氨酰tRNA合成酶,研究了精胺对Ile-tRNA复合物形成及IleRS活性的作用。结果表明:精胺能特异地促使牛肝tRNA^Ile氨基酰化反应;对IleRS活性无影响;能明显地增加形成Ile-tRNA复合物反应的Vmax和tRNA^Ile的Km值。 相似文献
14.
我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸tRNA基因(SelC基因)连接到分泌型表达质粒PVT102U-αMFL中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于SelC基因的下游.将该质粒转化酵母,通过SDS-PAGE分析,在SD液体培养基中检测出7~8kd的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总RNA用互补与该tRNATC茎环区的21-mer寡核苷酸,经5′标记后作为探讨进行Northernblot。结果有两条较强的条带和一条较弱的条带,较强条带中一条相当于790nts左右,另一条相当于370nts左古,根据组建的表达型质粒结构资料推测790nts左右的条带是由RNA聚合酶II转录的未被加工的前体;370nts左右的条带是5′端被加工而3′端未被加工的分子,较弱的条带则是相当于90nts左右的成熟tRNA分子。因此,我们认为RNA聚合酶II可以转录tRNA基因。由于实验用酵母的3′内切核酸酶含量较低,致使带长尾巴的tRNA前体3′端加工速度缓慢。 相似文献
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将大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)上Lys306用基因点突变的方法分别变为Ala和Arg的密码子;得到变种基因args306KA和args306KR。变种基因重组在pUC18上,转化到大肠杆菌TG1中,转化子中ArgRS及其变种ArgRS306KA和ArgRS306KR所表达的蛋白量至少为TG1表达ArgRS蛋白量的100倍。细胞粗抽提液中ArgRS的比活TG1、转化子pUC18-args、pUC18-args306KA和pUC18-args306KR分别为1.65、210、1.8和38单位/毫克。结果表明ArsRS的Lys306为Ala取代使活力完全丧失;若被Arg取代,则活力丧失80%以上。Lys306为ArgRS活力所必需。 相似文献
16.
我们测定了鲁鱼线粒体半胱氨酸tRNA基因和轻链复制起始区的核苷酸序列,绘制了半胱氨酸tRNA三叶草形的二级结构以及L链复制区的茎环结构。通过种脊椎动物tRNA^CYS基因的核苷酸序列分析发现,鲤鱼线粒体tRNA^CYS基因的不寻常的结构特点。鲤鱼线粒体L链复制起始区含有36个碱基,复制起始区茎环名的茎含有11对碱基,而环则是由14个碱基组成。同其它10种脊椎动物L-链复制起始区的核苷酸序列比较发现 相似文献
17.
用点突变的方法将大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶(ArgRS)的基因args上相应于Lys378和Lys381的密码AAA分别变为两氨酸的密码GCA和精氨酸的密码子CGT,得到了4个args的突变体args378KA,args378KR,args381KA和args381KR,将它们分别连接到pUC18上,转入大肠杆菌TG1,在TG1转化子中,ArgRS及其变种的表达量约为TG1中的120倍以上。结果表明Lys378为Arg和Ala取代分别使活力下降0%和10%;Lys381变为Ala和Arg后,活力分别下降33%和10%左右。Lys378不为酶活力必需。Lys381部位的正电荷对酶活力是重要的。 相似文献
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大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质 总被引:1,自引:1,他引:0
本文研究了Ly381变为Ala的精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)变种ArgRS381KA的最适pH和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ArgRS的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ArgRS381KA的氨酰化活力和ATP ̄PPi交换活力的最适pH分别为8.0和7.0,与天然酶相同;ArgRS381KA的氨酰化活力对精氨酸、ATP和tRNA^Arg的Km分别为12μmol/L、0.3mmol/ 相似文献
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稀有密码子对proUK基因在大肠杆菌中高表达的影响 总被引:6,自引:0,他引:6
AGG/AGA密码子在proUK基因中出现的频率高达2%,大肠杆菌中现有的编码tRNAUCU的argU基因不能满足proUK高表达的需要。本文研究了argU基因剂量对proUK表达的影响,结果表明带有argU基因的中等拷贝数质粒能促进proUK基因表达。 相似文献
20.
在脊椎动物线粒体基因组的研究中,迄今为止已测定了人、牛、大鼠、爪蟾、鲸鱼、海豹、鸡等动物线粒体基因组的全序列。结果表明,脊椎动物线粒体基因组结构排列非常紧密。22个tRNA基因分布于结构基因和rRNA基因之间,并随其临近的基因一起转录,随后被精确地剪切下来,继续加工成熟。线粒体tRNA与细胞质tRNA相比有许多不同之处,如:D环碱基数目明显减少;TΨC环中缺少T54-C-Pu-A序列;且各个臂上有高比例的碱基错配;同时在线粒体tRNA中A+U含量很高。目前有报道指出线粒体中某些tRNA三叶草结构的变化与物种的进化相关联,但这一说法是否具有普遍性尚须探讨。我们最近完成了鲤鱼线粒体tRNAphe基因的结构分析(图一),并将其与上述已报导的几种脊椎动物线粒体tRNAphe基因进行了比较(表一),发现这些tRNAphe基因的D臂上都存在一个13bp的强保守区,而其它21种线粒体tRNA基因上的这一区域却是最不保守的。我们将此保守区前7个碱基与真核生物RNAPolⅢ识别的A区相比较,发现RNAPolⅢ识别的A区的3个强保守碱基在碱基类型与碱基排列位置上完全与此保守区相同(图二)。考虑到tRNAphe基因在线粒体基因组 相似文献