农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化

【目的】将农杆菌介导的转化应用于重要的工厂化栽培食用菌斑玉蕈中,建立稳定的农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化技术。【方法】将构建的双元载体pYN6982转入农杆菌LBA4404菌株中,以斑玉蕈SIEF3133菌株打碎的双核菌丝为受体材料,利用根癌农杆菌介导的转化方法进行斑玉蕈转化试验。【结果】经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定以及有丝分裂稳定性试验验证,表明潮霉素磷酸转移酶基因(hph)已经整合到斑玉蕈的基因组中;转基因斑玉蕈菌丝在荧光显微镜下可以观测到绿色荧光,表明增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)已经在转基因斑玉蕈菌株中获得了表达;通过PCR检测,随机挑选的8个转基因斑玉蕈菌株中有2个可以扩增出载体转移DNA(T-DNA)边界重复序列外的卡那霉素基因(kan)序列。【结论】获得了稳定遗传和表达的斑玉蕈转基因菌株,建立了农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化方法。农杆菌介导的斑玉蕈遗传转化中,存在载体T-DNA边界重复序列之外的DNA序列转移到转基因斑玉蕈中的现象,有待进一步研究。     

斑玉蕈出菇产量与胞内外碳代谢的相关性分析

本研究收集了19株不同来源的斑玉蕈品种,通过ITS测序构建其系统发育树,随后根据菌株在木屑培养基与葡萄糖培养基的生长速度对菌株进行分类,选取生长速度差异明显的快、中和慢8株斑玉蕈菌株进行出菇实验及胞内外碳代谢指标的测定,探讨斑玉蕈生产性能与胞内外碳代谢的相关性。研究发现收集到的19株菌株均为斑玉蕈,亲缘关系近,遗传分化程度低;选取出的8株斑玉蕈菌株鲜菇产量与菌丝生长速度呈极显著正相关,菌丝生长越快,出菇产量越高。同时,斑玉蕈菌株鲜菇产量与菌丝湿重、还原糖、可溶性蛋白、滤纸酶(FPase)、CMC-Na酶(CMCase)、木聚糖酶和淀粉酶7个胞外碳代谢指标(ECMI)及胞内葡萄糖、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(Pyk)、柠檬酸合酶(CS)、α-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD) 6个胞内碳代谢指标(ICMI)呈显著正相关。说明菌丝生长速度快的斑玉蕈品种,胞外基质分解速度更快,提高可吸收碳源的供应,胞内加强对碳的吸收与同化,为菌丝的增殖提供更多原料与能量。本研究分析了斑玉蕈生产性能与胞内外碳代谢的相关性,为斑玉蕈优良品种的鉴别与选育奠定基础。     

培养基中添加海藻糖对大球盖菇、斑玉蕈菌丝生长的影响

【背景】大球盖菇和斑玉蕈是食药兼用且具有开发潜力的珍稀食用菌,培养基对菌丝生长及子实体发育具有重要作用,优化培养基显得尤为重要。【目的】筛选出最适合培养大球盖菇、斑玉蕈的新型培养基。【方法】使用添加海藻糖的新型培养基,对不同培养基培养的大球盖菇及斑玉蕈菌株的菌丝生长状况、生长速度和生物量及纤维素酶、漆酶活性进行测定与分析。【结果】相较于PDA培养基,添加海藻糖的培养基能够提高菌丝生长速度、增加生物量,海藻糖添加的比例对纤维素酶和漆酶的影响较大,对大球盖菇及斑玉蕈菌丝的生长产生显著的促进作用,但不会改变其蛋白质的组成。【结论】大球盖菇最适合选用PTA-5培养基,斑玉蕈的最佳培养基是PDTA培养基。     

斑玉蕈育种中漆酶转化体系建立的初步研究

漆酶具有降解木质素,氧化降解酚类物质,抑制杂菌,改善出菇品质等作用。采用酶学与原生质体融合相结合的技术,建立斑玉蕈育种中漆酶转化体系,将漆酶活性较高、生长速度较快的凤尾菇原生质体经高温灭活与斑玉蕈原生质体融合,通过RB-PDA平板显色技术筛选出具有漆酶活性较高的两融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A,并对其进行了拮抗试验、RAPD分子标记、漆酶基因扩增等研究。结果表明,筛选出的两融合菌株与两亲本具有明显的拮抗线,随即引物扩增的条带与两亲本有明显的差异,并扩增出漆酶基因的一个片段。同时也表明利用漆酶转化体系筛选融合菌株具有目标明确、准确、快速的优点。     

斑玉蕈工厂化栽培中的致病微生物

斑玉蕈Hypsizygus marmoreus是我国重要的工厂化栽培食用菌之一,在栽培过程中发生污染将为生产企业带来经济损失。为对实际生产中的斑玉蕈病害进行溯源和防控,本研究采集了一家大型生产企业在3个不同省市产地发生污染的菌种或子实体样品,结合分子测序和形态特征观察对分离到的微生物进行鉴定,并通过平板对峙实验分析了菌株对斑玉蕈菌丝生长的影响。从样品中共分离得到了11株可疑致病微生物,包含10株细菌和1株真菌,分布于3个科7个属,优势科为肠杆菌科Enterobacteriaceae,优势属为芽胞菌属Bacillus,其中2株细菌可能分别为芽孢杆菌属和肠杆菌属Enterobacter新种。对峙实验显示7株细菌和1株真菌对相应宿主斑玉蕈菌株的菌丝生长有明显的抑制作用。结合生产过程,提出培养料的配制、灭菌和出菇管理阶段是斑玉蕈栽培中预防病害的3个关键控制点。在秋冬季气温较低时适当延长培养料的灭菌升温时间,在夏季菇房需要设备降温时加强对出菇过程中栽培环境尤其是水体的严格管理,有助于降低斑玉蕈工厂化栽培的病害发生率。     

应用变色法筛选斑玉蕈优良杂交子

【目的】将变色检测方法应用于斑玉蕈优良杂交菌株的选育,缩短育种过程。【方法】采用分光光度计检测变色培养基的颜色变化,计算脱色率(D值)。【结果】变色检测培养基的颜色变化和脱色率(D值)是一致的,即培养基显示黄色时D值是正值,培养基显示蓝色时D值是负值。D值与斑玉蕈主要农艺性状具有紧密联系,D值是正值的菌株平均吃料速度比D值是负值的菌株快,单瓶产量和正常子实体数与D值呈正相关性,畸形菇数与D值呈负相关性。【结论】应用变色检测法可以快速简单地筛选出优良菌株,缩短斑玉蕈育种进程。     

斑玉蕈‘闽真5号’的选育报告

斑玉蕈‘闽真5号’品种系以‘闽真3号’与‘白玉-01’作为亲本,通过原生质体单核化杂交育种技术选育获得。该品种菌盖白色,呈半球形,表面斑纹少而小。鲜菇蛋白质含量2.1%,氨基酸总量1.43%。示范栽培表明,‘闽真5号’菌丝最适培养温度20-27 ℃,子实体生长发育温度12-17 ℃,袋栽菌包培养周期为110 d,出菇周期为28 d,平均单袋产量635.17 g/袋。该品种具有栽培周期短、产量高、商品性状好等优良性状,适用于袋栽工厂化周年栽培。     

单孢杂交选育金针菇新品种‘上研1820’

本研究以收集的105份金针菇种质资源经遗传性分析后,选出‘上研1号’与‘0747’菌株作为亲本,采用单孢杂交技术共得到168个杂交菌株。经实验室初筛和工厂化小中试复筛,最终获得产量高、出芽整齐和商品性状优良的金针菇新品种‘上研1820’。该品种为浅黄色,菌盖呈球形,菌柄基部颜色加深不显著,子实体干品氨基酸总含量为1.82×10⁴mg/kg。工厂化栽培条件下,菌丝最适培养温度为20℃,子实体生长发育温度为5–15℃,瓶栽菌丝培养周期为22d,子实体生育时间为25d,平均单瓶产量为314.3g/瓶。研究结果表明,利用分子标记技术和传统选育手段,可有效提高育种效率,对筛选出具有遗传性状稳定、商品性状优良和适用于工厂化栽培等特性的目标菌株具有重要的理论指导意义。     

芳香族化合物对斑玉蕈菌丝生物量、漆酶活性及其转录水平的影响

芳香族化合物适当时间适当浓度添加到培养基中,可提高真菌漆酶活性,有助于增强其对木质纤维素的利用效率。为了增强斑玉蕈漆酶活性,本文研究了8种芳香族化合物对其酶活的影响及其与菌丝生物量的相关性。研究发现在无诱导物条件下,斑玉蕈漆酶活性和菌丝生物量相关系数r为0.9956,说明它们呈正相关,但是整个培养过程漆酶活性相对较低;供试的芳香族化合物对漆酶活性都有不同程度的诱导作用,其中添加0.1mmol/L的愈创木酚对斑玉蕈漆酶活性诱导作用最大,达到3倍以上,同时提高了斑玉蕈菌丝生长速度和菌丝生物量;而随着添加时间的延长,部分化合物对漆酶活性和菌丝生物量都产生不同程度的抑制作用,这可能因为化合物对菌丝毒性的延长导致菌丝生长变慢或死亡;进一步研究发现,斑玉蕈3个漆酶同工酶基因lcc2、lcc3和lcc4在诱导剂愈创木酚的影响下转录水平都不同程度地上调。研究结果表明诱导漆酶活性可以提高斑玉蕈菌丝生长速度和生物量,暗示可能通过提高漆酶活性的方法,提高斑玉蕈的培养基利用效率。     

信息素信号通路基因在斑玉蕈生长发育过程中的差异表达

为了更清楚地了解斑玉蕈菌丝成熟、原基形成和子实体发育的过程,本研究对不同菌丝培养时期的栽培瓶进行出菇实验,并对其不同培养时期和生长发育关键时期的信息素通路基因进行差异表达分析,以期揭示信息素信号通路基因参与调节斑玉蕈菌丝的生长、子实体形成和发育的作用。研究结果表明：斑玉蕈菌丝培养40-80d过程中,子实体产量呈上升的趋势,说明菌丝的成熟程度对产量会产生重要影响。对斑玉蕈基因组中的信息素信号通路基因进行分析鉴定共获得了8个关键基因。信息素通路基因差异表达分析表明：在菌丝培养40-80d过程中,大部分信息素信号通路基因在第60天时表达量最高,其中ste20、cdc24和ste12上调了4-20倍,而在第80天出现下降。从菌丝恢复到扭结形成原基和子实体发育的过程中,大多数基因在原基时期表达量最高,其中ste20、cdc24、ste11和ste12表达量上调最为显著,在子实体成熟期这些基因表达量下降。因此,这说明在菌丝营养生长过程中,在第60天菌丝细胞增殖生长最为旺盛,而在第80天菌丝细胞基本停止生长,菌丝也逐渐达到成熟。同时,在菌丝生殖生长过程中,斑玉蕈持续地上调信息素通路基因表达使菌丝细胞不断地分裂增殖,从而使新生的菌丝扭结形成原基,其中ste3、ste20、cdc24、ste11和ste12基因可能对斑玉蕈菌丝细胞的分裂增殖和诱导子实体形成起到关键的作用。     

漆酶同工酶基因在斑玉蕈生长发育过程中的表达分析

为了探明漆酶在斑玉蕈生长发育过程中的功能,对斑玉蕈转录测序预测的13个漆酶基因序列进行分析、鉴定和构建分子系统发育树;检测了不同生长发育时期漆酶的活性和漆酶基因表达水平。研究结果显示：13个基因片段中有10个是漆酶基因。不同的漆酶同工酶之间进化关系存在明显差异,大多数漆酶与木腐菌（金针菇Flammulina filiformis和侧耳属Pleurotus）进化关系较近。对斑玉蕈不同生长发育时期的酶活检测结果显示,从斑玉蕈的菌丝恢复期到钉头期,漆酶活性逐渐升高,而在子实体形成后期酶活逐渐降低。对培养40d、60d和80d的菌丝样品以及不同生长发育时期的样品进RT-qPCR检测,结果显示在菌丝营养生长时期,大多数漆酶基因在第40-60天表达量持续增加1-3倍,而在第60-80天时表达量出现降低的情况。而在生殖生长时期,大多数漆酶基因在转色期或者原基期相对表达量达到最大值,并在子实体期出现降低,这与漆酶活性的检测具有一致性。lcc3、lcc7、lcc8和lcc9在斑玉蕈生殖生长过程中相对表达量出现了10-100倍的上调。这说明从菌丝培养到菌丝扭结形成子实体和子实体发育的过程中,不同的漆酶可能发挥着不同的作用,表达量较高的漆酶基因可能对基质降解和子实体形成起主要作用。     

精氨酸对斑玉蕈菌丝生长的影响

采用平板培养和基因表达等方法,研究了精氨酸对斑玉蕈菌丝生长的影响及其机理。结果表明添加1–2 mmol/L精氨酸能明显提高菌丝的生长速度。添加精氨酸促进精氨酸代谢,提高GCN2介导的翻译通路活力以及空泡氨基酸转运载体基因AVT3的表达。营养补充实验证实在营养匮乏的情况下,单一添加精氨酸能促进斑玉蕈菌丝良好生长。研究结果证实外源添加精氨酸能作为主要营养物质促进斑玉蕈菌丝生长。     

斑玉蕈不同交配型的原生质体单核菌株差异分析

对2个斑玉蕈菌株进行了原生质体分离与交配型鉴定,并对不同交配型单核体的代谢特性进行了研究。结果表明,2个斑玉蕈菌株均出现2种交配型,2种交配型比例不一致,且2个菌株的两种单核体的分离比例均不符合1∶1分离比,交配型比例上出现明显的偏差现象。2个菌株中,不同交配型单核菌株的菌丝形态有明显差别,代谢过程中的菌丝生物量及发酵液的pH、还原糖含量和电导率均存在差异,表明在这2个菌株中不同交配型单核菌株的菌丝形态及代谢特性与交配型因子相关。     

肺形侧耳‘申秀1号’的选育报告

肺形侧耳Pleurotus pulmonarius‘申秀1号’品种以‘3108’菌株为亲本采用单孢自交育种技术选育,经ISSR鉴定表明与亲本相比具有自身特异性。经多年的示范栽培表明：‘申秀1号’具有产量高（505g/500g干料）、商品性好（一级商品菇比例90%以上）、栽培周期短（冷刺激后4-5d完成采收）、菌丝培养阶段不出菇、冷刺激后出芽整齐、抗逆性强等优良特性,能够满足肺形侧耳温控设施化栽培与常规栽培的高温反季节用种需求。     

不同营养条件下斑玉蕈菌丝生长及产酶特性

分析测定了不同营养条件下斑玉蕈菌丝形态特征、生长速度及产酶规律。低碳氮盐培养基上菌丝生长速度最快,但其菌丝非常稀疏,边缘不整齐,在整个生长阶段酶活力(包括漆酶、锰过氧化物酶、木素过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶)较低,营养不足对该菌菌丝生长速度影响不明显,但对菌丝形态和酶活有很大的影响;低氮条件下最先产生木质素过氧化物酶,说明限氮条件可以刺激木质素过氧化物酶的产生;高无机盐条件下最先产生漆酶和锰过氧化物酶,但菌丝生长速度较慢,酶活性比较低,浓度过高会影响菌丝生长。结果表明,不同的营养条件对斑玉蕈的菌丝生长及多种酶活性有很大影响,这为斑玉蕈改变营养条件调节菌丝生长速度、菌丝形态以及基质降解提供了理论依据,同时对斑玉蕈栽培过程中基质的高效利用、缩短生产周期、降低生产成本具有重要的指导意义。     

不同启动子调控外源基因在斑玉蕈中的表达分析

启动子是控制基因转录的重要顺式元件,也是遗传转化实验中驱动外源基因表达的重要工具。在同一真菌中,不同启动子驱动外源基因表达水平可能存在明显差异。因此,选择合适的启动子是提高外源基因表达水平的关键。本研究分别应用花椰菜病毒35S RNA（cauliflower mosaic virus 35S RNA,CaMV35S）和斑玉蕈甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Hypsizygus marmoreus glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,HmGPD）基因的启动子构建了两个遗传转化质粒,在斑玉蕈中分别驱动外源的植物花青素合成基因表达,并利用来自刺芹侧耳的萎锈灵抗性基因进行转基因筛选。两个质粒通过农杆菌介导转化斑玉蕈单核菌株后,对具有萎锈灵抗性的转化子经PCR方法进行转基因验证,并运用实时荧光定量PCR对阳性转化子中外源基因的表达水平进行比较分析。结果表明,CaMV35S和HmGPD基因的启动子均成功驱动了植物花青素合成基因在斑玉蕈中转录,为增强基因表达而引入的内含子在转录过程中均被正确切割。其中,HmGPD启动子驱动外源基因表达水平比CaMV35S启动子驱动外源基因表达水平强22-36倍。     

CWI和HOG信号通路基因在斑玉蕈不同发育阶段的表达模式

为了更清楚地了解MAPK信号通路中的细胞壁完整性信号通路（cell wall integrity,CWI）和高渗透压甘油（high-osmolarity glycerol pathway,HOG）信号通路对斑玉蕈菌丝成熟、原基形成和子实体发育过程的影响及调节作用,对MAPK信号通路中的CWI和HOG信号通路基因在斑玉蕈不同菌丝培养时间（40、60、80和100d）和不同生长发育关键时期（24h、菌丝恢复期、菌丝转色期、原基期和子实体期）的表达模式进行分析,以期揭示这两条信号通路基因参与调节斑玉蕈菌丝的生长、子实体的形成和发育的作用。在斑玉蕈的CWI和HOG信号通路中经分析鉴定一共获得了15个关键基因。CWI信号通路基因表达分析表明：在菌丝培养的40-100d的过程中,大部分CWI信号通路基因在第60天时表达量最高,其中rho1、ssk1、ssk2和ste20的基因表达量上调了2-5倍,在第80-100天时出现持续下降。在HOG信号通路中的大部分基因也在菌丝培养的第60天表达量达到最高。其中sho1、ste20、ssk1和ssk2基因的表达量上调最为显著,而hog1基因的表达量在菌丝培养的第40-100天呈持续下降。子实体形成过程中两条通路的大部分基因在原基形成时期表达量最高,而在子实体时期表达量下调。其中HOG信号通路中的ssk2基因表达量上调最为显著。以上结果说明在菌丝生长过程中第60天时菌丝细胞生长增殖最为旺盛,而在第80天开始菌丝细胞基本开始停止生长,菌丝也逐渐达到成熟。同时在菌丝增殖生长过程中,斑玉蕈持续地上调CWI信号通路基因的表达来调控菌丝细胞壁的完整性,从而控制菌丝细胞壁的形成。其中bck1、mkk1和slt2基因可能对斑玉蕈菌丝细胞的分裂增殖和细胞壁的形成以及诱导子实体形成起到关键作用。     

曲酸对斑玉蕈子实体形成过程中木质纤维素酶的影响研究

为了探究曲酸增加子实体产量的机制,首先考察了搔菌后外源添加曲酸对不同菌丝培养时间出菇的影响。研究发现当菌丝培养时间过短或者过长添加曲酸都得不到很好的增产效果,菌丝培养时间在60-80d之间增产效率最高,并且后熟期60d的增产效率大于80d的增产效率。进一步研究发现添加曲酸可以提高菌丝利用基质中木质纤维素的利用率。更深入地研究发现,基质中的漆酶和纤维素酶活性在斑玉蕈的不同发育时期受到曲酸调控。漆酶活性在最初的菌丝恢复期和转色期酶活性低于对照组,但是在原基期、钉头期和子实体期酶活性显著地高于对照组;纤维素酶活性在整个发育周期中曲酸组都高于对照组,在子实体发育后期酶活性被提高3.16倍。最后,从分子水平上分析了漆酶基因和纤维素酶基因的表达量,研究显示添加曲酸后漆酶基因和纤维素酶基因在不同程度上被上调,这个结果与酶活的结果相一致。这些结果说明外源添加曲酸通过提高生殖生长阶段的菌丝利用培养基质中的漆酶和纤维素酶活性,进而提高菌丝利用木质纤维素,为斑玉蕈子实体生长发育提供更多的能源,实现增加子实体产量的目的。     

吉林省担子菌补记(五)

报道了 6种吉林省新记录担子菌 ,即斑玉蕈 [Hypsizygusmarmoreus (Peck)Bigelow],大幕侧耳[Pleurotuscalyptratus (Lindbl :Fr )Sacc ],矮包脚菇 [Volvariellapusilla (Pers :Fr )Sing ],白顶丽蘑[Calocybeleucocephala (Fr )Qu啨ｌ ],彩丽小菇 (MycenapictaHarmaja)和平截棒瑚菌 [Clavariadelphustruncatus(Qu啨ｌ )Donk ]。其中 ,斑玉蕈为首次在我国发现。     

甜菊不同杂交组合结实率及其F1代萌发和生长及对NaCl耐性的比较

以甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的耐盐性较强品种‘中山3号’和‘守田2号’及R-A高含量品种‘中山4号’和‘守田3号’为亲本配置7个杂交组合并获得杂交种子,对种子结实率和发芽率及F1代幼苗的存活率进行统计分析,在此基础上采用砂培和水培方法比较了亲本及F1代扦插苗对NaCl胁迫的耐性.结果表明:品种间杂交组合的结实率均显著高于同系列品种间杂交及自交组合,其中‘守田2号’ב中山3号’杂交组合的结实率最高,为74.9％;7个杂交组合F1代的种子发芽率为63.8％ ～ 89.0％,差异明显;‘守田2号’ב中山4号’杂交组合F1代幼苗存活率相对较低(79.80％),其他杂交组合F1代幼苗存活率均在93％以上.砂培条件下,用100 mmol·L-1NaCl胁迫7d,各杂交组合F1代扦插苗的存活率差异不显著;随NaCl胁迫时间的延长各杂交组合F1代扦插苗的存活率均明显下降;胁迫28 d,‘守田2号’ב守田 3号’杂交组合以及‘中山3号’自交组合F1代扦插苗的存活率显著高于其他杂交组合.水培条件下,用100、150、200和250 mmol·L-1 NaCl胁迫14 d,‘守田2号’ב中山3号’、‘中山3号’ב守田2号’和‘中山3号’ב守田3号’3个杂交组合F1代扦插苗的存活率均显著高于其耐盐亲本及其他杂交组合.研究结果说明:通过杂交提高甜菊耐盐能力是可行的,而亲本的耐盐能力及亲本配置对杂交后代目标性状有较大影响;‘中山3号’ב守田2号’、‘守田2号’ב中山3号’和‘中山3号’ב守田3号’是耐盐性较强的甜菊优良杂交组合.