核转运蛋白SsKapJ调控甘蔗鞭孢堆黑粉菌有性配合与菌丝生长

为了研究核转运蛋白SsKapJ在甘蔗鞭孢堆黑粉菌中发挥的作用,本研究利用PEG介导的原生质体转化方法获得基因敲除突变体,并进行了相关生物学表型分析.结果显示潜在核转运蛋白基因SsKapJ△突变体有性配合和菌丝生长显著减弱,转录组分析SsKapJ参与环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK...     

基于Cfku70基因失活策略构建果生刺盘孢的高效基因敲除底盘菌株

果生刺盘孢侵染危害多种植物,是重要的植物病原真菌。在一些丝状真菌中,敲除非同源末端连接修复通路的关键基因ku70或ku80可显著提高同源重组效率,进而提高靶基因置换频率。本研究从果生刺盘孢基因组鉴定到Cfku70和Cfku80两个基因,并明确了基因失活对菌株生物学表型和基因敲除效率的影响。敲除Cfku70或Cfku80不影响菌株的菌落形态、营养生长、产孢、分生孢子萌发、侵染结构发育和致病;Cfku70基因敲除还大幅提升3个测试基因的敲除效率。本研究证实Cfku70基因失活能显著提高果生刺盘孢的基因敲除效率,适宜作为高效基因敲除的底盘菌株,研究结果为通过批量敲除策略筛选新型致病因子奠定重要基础。     

PEG介导的柱状田头菇遗传转化体系建立

柱状田头菇（茶树菇）Agrocybe aegerita是一种美味的食用菌,具有极高的经济价值。随着其全基因组测序的完成,功能基因组学研究也逐渐展开,其中,高效的遗传转化体系作为技术基础成为研究重点。本研究以柱状田头菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因（hph）作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）为报告基因,应用PEG介导法进行柱状田头菇遗传转化体系研究。结果表明,150μg/mL潮霉素可以完全抑制柱状田头菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3h,能够获得最大得率的原生质体。通过PEG介导将构建好的DNA片段转化入柱状田头菇原生质体,通过潮霉素抗性筛选获得转化子,转化得率达到7个/μg DNA。PCR验证和荧光显微镜观察,外源片段成功转入柱状田头菇中并稳定表达。本研究建立的PEG介导转化体系,为柱状田头菇基因功能研究提供了技术基础。     

棘孢木霉嗜铁素sidA基因敲除及表型分析

明确棘孢木霉菌Trichoderma asperellum嗜铁素合成的关键基因,能够为进一步探索嗜铁素在生防和促生中的作用奠定基础。本研究在对sidA基因进行定位、结构分析和RT-PCR检测的基础上,利用double-joint PCR技术构建基因敲除载体,经聚乙二醇（PEG）介导原生质体转化、潮霉素初筛、PCR和southern blot验证获得突变株,并对其表型进行分析,获得2株性能稳定的敲除突变体?sidA1和?sidA2。与野生型相比,?sidA1和?sidA2的嗜铁素产量在5d时分别下降了38.67%和36.65%;孢子萌发率在12h时分别下降了45.33%和47.47%;产孢量在10d时分别下降了33.01%和41.02%,且突变株在受NaCl、KCl、SDS等胁迫时的抗性较野生型降低。表明sidA基因的缺失降低了嗜铁素产量,抑制了菌体的生长以及对胁迫因子的抗性,sidA基因是影响棘孢木霉嗜铁素产生的关键基因之一。     

尖孢镰刀菌亚麻专化型Folprp4基因参与调控菌丝生长和分生孢子发生

目的: 通过对尖孢镰刀菌中Folprp4基因的鉴定,揭示其在尖孢镰刀菌中的功能及致病相关性。方法: 基于同源重组原理,根据测定出的Folprp4基因序列,应用Split-Marker重组技术构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒。将基因缺失盒经PEG介导转化到野生型原生质体中,在含有潮霉素B的TCC培养基上筛选转化子,通过PCR正负筛查获得Folprp4基因缺失突变株(ΔFolprp4)。构建含有Folprp4基因的载体pZDH1,并将其转化到敲除突变体中进行互补测验。结果: 与野生型(hm)和异位插入突变体(ecFolprp4)相比,敲除突变体菌丝生长受到严重阻碍,当野生型和异位插入突变体长满整个平板时,敲除突变体菌落呈小点状。敲除突变体的另一个显著变化是ΔFolprp4的分生孢子产量显著下降。侵染实验表明,ΔFolprp4对亚麻幼苗的毒力显著降低。互补实验表明,该互补载体的回复子(Folprp4-C)在菌落形态、生长速率、分生孢子产量和毒力方面均恢复到了野生型菌株。结论: Folprp4基因与尖孢镰刀菌的菌丝生长、分生孢子发生和致病性有关。     

一种有效的嗜热真菌杜邦嗜热菌靶向基因替代系统

以嗜热真菌杜邦嗜热菌Thermomyces dupontii NRRL 2155为研究材料,利用同源重组原理和真菌原生质体转化方法,以潮霉素抗性基因替换嗜热真菌目标基因,获得抗潮霉素的靶向基因敲除突变菌株。优化的遗传转化体系为：用15mg/mL裂解酶,在28℃下酶解2g杜邦嗜热菌菌丝5.5h以获得原生质体,经STC缓冲液洗涤重悬后,利用PEG（polyethylene glycol）介导的遗传转化方式,将10μg线性敲除全长片段转化至杜邦嗜热菌原生质体中,通过潮霉素筛选及PCR验证得到基因替换突变菌株,同源重组率达到20%。本研究首次将原生质体转化方法应用在杜邦嗜热菌,并成功建立稳定高效的基因替换体系,为快速构建杜邦嗜热菌的遗传转化体系和研究该嗜热真菌的基因功能提供有效方法。     

利用CRISPR/Cas9双基因敲除系统初步解析大豆GmSnRK1.1和GmSnRK1.2对ABA及碱胁迫的响应

蔗糖非发酵相关激酶(sucrose non-fermenting related protein kinases, SnRKs)是广泛存在于植物中的一类Ser/Thr蛋白激酶,在植物的生长、发育、代谢和抗逆等方面具有重要调节作用。大豆(Glycine max L.)基因组中含有4个SnRK1同源基因,其中GmSnRK1.1和GmSnRK1.2为两个主要表达基因,可能参与大豆多种抗逆途径。为解析大豆GmSnRK1.1和GmSnRK1.2对ABA及碱胁迫的响应,本研究构建了双靶点CRISPR载体定向敲除GmSnRK1.1和GmSnRK1.2基因,利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导大豆遗传转化,获得双基因敲除突变体毛状根,经测序鉴定双基因突变率为48.6%;同时,利用实验室前期构建的植物超量表达载体获得超量表达GmSnRK1基因大豆毛状根。经25 μmol/L ABA处理15 d,对照组和超量表达毛状根的生长受到明显抑制,其根长与根鲜重均显著低于双基因敲除突变体毛状根;经50 mmol/L NaHCO₃处理15 d,对照组和双基因敲除突变体毛状根的生长受到明显抑制,其根长与根鲜重均显著低于超量表达毛状根。本研究建立的CRISPR/Cas9系统能够有效地对大豆进行GmSnRK1.1和GmSnRK1.2双基因敲除,基因敲除突变降低了植物对ABA的敏感性及对碱胁迫的耐性,研究结果初步说明SnRK1激酶在植物响应非生物胁迫中具有重要作用。     

液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢的生长发育和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要流行致病菌.本文研究果生刺盘孢中液泡分选蛋白CfVps17的生物学功能,为阐明该蛋白调控致病分子机制提供依据.采用over-lap方法构建CfVPS17基因敲除载体片段,使用PEG介导法将敲除载体片段转化至果生刺盘孢原生质体中,通过验证筛选获得突变体菌株△Cfvps17.构建目的 基因CfV...     

甘蔗内生解淀粉芽孢杆菌CGB15的分离、鉴定及生防活性

真菌病害占作物病害种类的一半以上,病原真菌是目前已知种类最多的作物病原菌。从作物根际与/或体内分离筛选具有生防活性的微生物,并应用于病害的防控,是除作物品种改良与化学防治外的另一种高效的病害防控策略。【目的】本研究拟筛选并分离鉴定对重要作物病原真菌具有拮抗作用的甘蔗内生细菌,为开发生物防治作物真菌病害新策略提供理论依据。【方法】采用平板对峙法初步筛选对病原真菌具有拮抗能力的甘蔗叶片内生细菌,通过16SrRNA基因测序鉴定其种属;进一步检测候选拮抗内生细菌对甘蔗鞭孢堆黑粉菌(Sporisorium scitamineum)致病发育过程关键步骤：有性配合/菌丝生长、冬孢子萌发的抑制率,田间试验检测其对甘蔗鞭黑穗病的防治效果;检测候选拮抗内生细菌对稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)附着胞形成、离体叶片及盆栽条件下叶片病斑形成的抑制作用。【结果】分离自甘蔗叶片的细菌菌株,编号为CGB15,经分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。CGB15菌株能有效抑制甘蔗鞭孢堆黑粉菌有性配合/菌丝生长,对峙培养条件下使真菌菌落呈现光滑;抑制冬孢子萌发,...     

双孢蘑菇萎锈灵抗性基因定点突变的载体构建与遗传转化

为建立更为安全、有效的双孢蘑菇遗传转化体系,构建了双孢蘑菇琥珀酸脱氢酶的铁硫蛋白亚基Agsdi1突变（His突变为Leu）表达载体pAgsdi1,并通过农杆菌介导方法转化双孢蘑菇W192,经萎锈灵筛选以及PCR扩增和MnlⅠ酶切验证后获得了转化菌株。验证结果表明,点突变的铁硫蛋白亚基Agsdi1可以作为双孢蘑菇有效的抗性标记基因。因其并未引入新的外源基因,是一种比潮霉素抗性基因更为安全的筛选标记,将可用于双孢蘑菇等食用菌的遗传转化。     

薏苡黑粉菌基因组测序揭示其物种分类及适应性进化

以薏苡黑粉菌病瘿为研究对象,采用固体和液体培养方法对薏苡黑粉菌进行分离纯化培养和形态观察;利用Illumina、Pacbio测序和Hi-C辅助基因组组装技术对黑粉菌进行测序、组装和注释,分析其基因组结构和组成特征。通过与其他6个黑粉菌物种基因组进行比较基因组学研究,分析薏苡黑粉菌的基因家族进化和系统发育关系。在pH 7的固体PDA和液体PDB培养基中实现了薏苡黑粉菌的纯化培养,固体培养菌落表现为白色、表面隆起、具褶皱,较湿润且不透明的形态特征。Illumina、Pacbio和Hi-C组装结果显示,薏苡黑粉菌具有20对染色体(2n=40),基因组大小20.093 417 Mb,GC含量53.81%;共预测和注释到7 476个蛋白编码基因和164个非编码基因,占整个基因组长度的61.02%和0.285 3%;查找到3 674个散在重复序列和8 139个串联重复序列,分别占整个基因组长度的2.754 4%和1.605 4%。同源基因家族聚类显示,7个黑粉菌物种Ustilago coicis、U. bromivora、U. maydis、U. hordei、Sporisorium reilianum、S. scitamineum和S. graminicola的编码基因被聚类为6 999个基因家族,其中共有基因家族5 379个。薏苡黑粉菌包含5 339个单拷贝基因、105个多拷贝基因、89个特异基因、752个其他基因和188个未分类基因。基因家族进化和系统发育聚类表明,薏苡黑粉菌U. coicis在~60.9 MYA分化出来,与雀麦黑粉菌U. bromivova、大麦坚黑粉菌U. hordei聚为一支,表现为更近的亲缘关系;而玉米黑粉菌U. maydis在~66.6 MYA分化出来与3个孢堆黑粉菌物种S. scitamineum、S. graminicola和S. reilianum聚为一支。     

深海白色侧齿霉遗传转化体系建立及渗透压调控相关的EaSHO1基因功能

海洋中具有丰富的动植物及微生物资源,海洋真菌是其重要组成之一。我们前期的研究发现一株深海真菌白色侧齿霉Engyodontium album能产生具有抑菌活性的次级代谢产物engyodontiumin A,该化合物能抑制黑曲霉、金黄色葡萄球菌及创伤弧菌等病原菌的生长,是一种潜在的海洋源抗菌药物。目前,该菌遗传转化体系尚未建立,不利于开展次级代谢产物合成调控机制及其他功能基因研究。本研究成功制备了深海白色侧齿霉菌的原生质体,建立了借助聚乙二醇3350介导的原生质体转化体系,并将pCT74-sGFP载体成功导入白色侧齿霉的原生质体中,结果显示外源GFP能稳定表达。此外,为了明确白色侧齿霉菌是否能够开展基因敲除研究,通过氨基酸序列同源比对,我们选取酵母高渗甘油信号途径中的同源基因EaSHO1进行初步探究。利用同源重组的方法成功将目的基因EaSHO1的开放阅读框(ORF)替换成潮霉素磷酸转移酶基因(HPH),由此获得EaSHO1基因敲除突变体,并对突变体进行Southern杂交验证及初步的表型分析。结果表明,EaSHO1缺失不影响白色侧齿霉菌的营养生长及对高盐胁迫的响应,亚细胞定位结果显示EaS...     

基于PEG介导原生质体转化构建粉红聚端孢荧光标记

粉红聚端孢是多种植物的重要病原菌。本研究通过酶解粉红聚端孢幼嫩菌丝细胞壁获得原生质体,用PEG介导原生质体转化将携带GFP基因和博来霉素抗性基因的外源DNA随机插入粉红聚端孢基因组,共获得博来霉素抗性菌株90株,转化效率达18个/μg。选取22株转化子荧光观察,发现均可表达荧光,菌株间荧光强度不同,其中10株转化子荧光表达较强。与野生型相比,突变菌株TR45的菌落生长、产孢量和致病力等生物学特性均未改变,在不含博来霉素的培养皿中继代培养10代荧光仍能稳定表达。本研究构建的高效原生质体制备和PEG介导粉红聚端孢遗传转化方法,可用于该菌基因功能研究,绿色荧光标记菌株可用于病菌侵入、田间监测、侵染循环等发生规律研究。     

Toll样受体4(TLR4)基因剔除小鼠构建及初步表型分析

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建Toll样受体4(TLR4)基因敲除小鼠模型,并观察突变小鼠对革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)刺激响应的变化。方法 针对TLR4基因外显子2设计并合成1对sgRNA片段,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法,建立TLR4基因敲除小鼠,通过繁育获得基因敲除纯合子小鼠(TLR4^-/-小鼠);通过LPS刺激,分析TLR4^-/-小鼠对炎症应激的反应情况,并在分子和病理水平上和野生型对照(WT)进行比较。结果 PCR及测序检测表明TLR4基因外显子2在小鼠基因中被成功敲除;给予LPS刺激后,IL1β、IL6、MyD88、iNOS及TNFa等炎症因子的表达在野生型小鼠的心、肝和肺组织中显著上调,而在TLR4^-/-小鼠中则几乎没有变化;血生化指标显示LPS刺激后WT小鼠血清中的尿素(Urea)和肌酐(Cre)水平显著升高,而TLR4^-/-小鼠刺激前后无显著变化,病理分析同样发现TLR4^-/-小鼠能够抵抗LPS对肾组织的损伤。结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TLR4基因剔除小鼠模型,TLR4的缺失能够降低IL1β、IL6、MyD88、iNOS及TNFa炎症因子对LPS刺激的响应,抑制LPS引起的炎症反应及对组织的损伤。     

基因组数据揭示肺形侧耳X1野生菌株后代单孢的特异交配型位点

肺形侧耳味道鲜美,营养丰富,深受广大消费者喜爱。它属于四极性异宗结合担子菌,但其交配型位点结构仍未被解析。本研究利用二代测序技术对肺形侧耳的基因组进行测序,通过生物信息学方法找到了肺形侧耳野生菌株X1菌株后代单核菌株的交配型位点。结果显示肺形侧耳的A交配型位点较为特异,2株原生质体单核化菌株（X1-1和X1-15）的A交配型位点结构差异较大,X1-1含一对保守的HD1和HD2基因,而X1-15除了一对HD1和HD2基因外,还含有额外的2个HD2基因和1个HD1基因。肺形侧耳的B交配型位点与其他担子菌的交配型位点相似,含有8个信息素受体基因和1个信息素前体基因。本研究揭示的肺形侧耳特异的交配型位点结构为后期的遗传育种提供了理论依据。     

The cyclization of linear DNA in Escherichia coli by site-specific recombination

The efficiency with which linearized plasmid DNA can transform competent Escherichia coli can be significantly increased by use of the Cre-lox site-specific recombination system of phage P1. Linear plasmid molecules containing directly repeated loxP sites (lox² plasmids) are cyclized in Cre⁺ E. coli strains after introduction either by transformation or by mini-Mu transduction, Exonuclease V activity of the RecBC enzyme inhibits efficient cyclization of linearized lox² plasmids after transformation. By use of E. coli mutants which lack exonuclease V activity, Cre-mediated cyclization results in transformation efficiencies for linearized lox² plasmids identical to those obtained with covalently closed circular plasmid DNA. Moreover, Cre⁺ E. coli recBC strains allow the efficient recovery of lox² plasmids integrated within large linear DNA molecules such as the 150-kb genome of pseudorabies virus.     

雷公藤悬浮细胞原生质体的制备及瞬时转化体系的建立

为探索药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)悬浮细胞原生质体提取的最优条件,并建立雷公藤原生质体瞬时转化体系,以雷公藤悬浮细胞为材料,对酶解液配比、酶解时间、甘露醇浓度及处理转速进行考察。用PEG介导的瞬时转化法将外源基因转化到雷公藤原生质体中。结果表明,以雷公藤悬浮细胞为材料提取原生质体的最佳条件是酶液配比为2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶,甘露醇浓度为0.6 mol·L–1,酶解10小时,处理转速为67×g;用PEG介导法将含有编码GFP的植物表达载体转化雷公藤悬浮细胞原生质体,激光共聚焦扫描显微镜下细胞显示绿色荧光。通过实验筛选得到雷公藤悬浮细胞原生质体的最佳提取条件,建立了雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展雷公藤功能基因及合成生物学研究奠定了基础。