试管出菇法测定刺芹侧耳的交配系统*

在MDA或PNA培养基上,用单孢分离物在试管中进行配对,观测菌丝体上的锁状联合和子实体的形成情况,判定单孢菌株间的亲和性;研究了2个刺芹侧耳菌株PE-11、PE-12和1个糙皮侧耳菌株PO-02的交配系统,以及3个菌株间的亲缘关系;结果表明刺芹侧耳和糙皮侧耳是双因子交配系统。这是一个测定侧耳属的交配系统的新方法。     

试管出菇法测定刺芹侧耳的交配系统

在MDA或PNA培养基上,用单孢分离物在试管中进行配对,观测菌丝体上的锁状联合和子实体的形成情况,判定单孢菌株间的亲和性;研究了2个刺芹侧耳菌株PE-11、PE-12和1个糙皮侧耳菌株PO-02的交配系统,以及3个菌株间的亲缘关系;结果表明刺芹侧耳和糙皮侧耳是双因子交配系统。这是一个测定侧耳属的交配系统的新方法。     

基因组数据揭示肺形侧耳X1野生菌株后代单孢的特异交配型位点

肺形侧耳味道鲜美,营养丰富,深受广大消费者喜爱。它属于四极性异宗结合担子菌,但其交配型位点结构仍未被解析。本研究利用二代测序技术对肺形侧耳的基因组进行测序,通过生物信息学方法找到了肺形侧耳野生菌株X1菌株后代单核菌株的交配型位点。结果显示肺形侧耳的A交配型位点较为特异,2株原生质体单核化菌株（X1-1和X1-15）的A交配型位点结构差异较大,X1-1含一对保守的HD1和HD2基因,而X1-15除了一对HD1和HD2基因外,还含有额外的2个HD2基因和1个HD1基因。肺形侧耳的B交配型位点与其他担子菌的交配型位点相似,含有8个信息素受体基因和1个信息素前体基因。本研究揭示的肺形侧耳特异的交配型位点结构为后期的遗传育种提供了理论依据。     

农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系的建立

以刺芹侧耳菌丝球为受体,潮霉素（Hyg）为筛选标记,应用农杆菌介导法对刺芹侧耳菌丝进行了遗传转化研究。潮霉素敏感性测试结果表明,刺芹侧耳Hyg耐受浓度为50mg/L。农杆菌介导的刺芹侧耳菌丝最佳遗传转化体系为：菌液浓度OD₆₀₀=0.6-0.7,侵染时间30-35min,共培养时间2d,侵染液和共培养培养基中乙酰丁香酮（AS）浓度为1mg/mL;经潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和GUS活性的组织化学分析,表明外源基因GUS已转入到刺芹侧耳菌丝中,并获得表达。本实验成功地建立了稳定的农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系。     

我国肺形侧耳栽培菌株交配型分析

为分析我国栽培肺形侧耳的遗传多样性,对肺形侧耳菌株的交配型进行测定,测试的肺形侧耳菌株包括俗称为秀珍菇和凤尾菇的菌株。结果显示,我国栽培的秀珍菇与凤尾菇菌株间可以发生性亲和,属于同一生物学物种,但它们之间的交配型特异性低,36个菌株中只含4种A交配型和3种B交配型,暗示我国栽培的肺形侧耳种质资源基因匮乏。     

刺芹侧耳谷氨酰胺合成酶编码基因克隆和表达分析

谷氨酰胺合成酶（GS）是真菌氮素同化代谢和谷氨酸合成中的关键酶,采用3’RACE和5’RACE实验技术,克隆获得刺芹侧耳（杏鲍菇）谷氨酰胺合成酶编码基因（PE-GS）全长序列,长度为1 271bp,具有4个内含子和5个外显子,编码353个氨基酸残基。系统进化树分析表明,刺芹侧耳PE-GS与糙皮侧耳GS在分子进化关系上相近。通过real time RT-PCR方法对PE-GS基因在刺芹侧耳基质菌丝体和子实体中的表达情况进行了分析,结果表明,刺芹侧耳PE-GS基因在子实体具有较高的表达水平,这暗示刺芹侧耳PE-GS基因在子实体的氮素代谢中可能承担重要功能。     

电击法介导的紫孢侧耳原生质体转化

使用基因脉冲导入仪成功地将糙皮侧耳DNA导入紫孢侧耳单核原生质体内,获得了具有"锁状联合”特征的双核转化菌株T₁,和T₂。转化率为8．2×10^-5,转化比为3．6％。酯酶同I酶分析结果表明,转化菌株除具有受体菌的酶带外,还存在供体菌的酶带,由此证明转化菌株确为紫孢侧耳和糙皮侧耳DNA重组的产物。转化菌株子实体形态也发生了变化。两菌株子实体均不释放孢子;T₁。菌柄中生,T₂成熟子实体菌盖中部易长出菌丝。     

担子菌类食用真菌双核体生物学性质研究进展及其启迪

担子菌类典型食用真菌,如香菇、灵芝、金针菇、糙皮侧耳、刺芹侧耳、黑木耳等,其生活史中的主要存在形式是双核体。双核体可以通过有性和无性两种方式生成单核体,可亲和的单核体之间通过质配形成具有锁状联合的双核体。目前对食用真菌单核体的研究结果拓展了对单核体和双核体生物学性质特性的认识。双核体细胞作为一种单倍双核存在形式,具有许多不同于二倍体的生物学特性,许多研究者对双核体的等级秩序、适配性、稳定性等生物学性质开展了一些研究,相关研究结果为菌种种性维持、杂交育种创新、遗传学研究范式建设等工作带来诸多启迪。对双核体在作为菌种中表现出的增量性、可育性、全能性等特性的分析,可以为解决食用真菌菌种种性长期维持稳定的问题带来启迪。双核体细胞核之间的显隐性关系以及互补关系对杂交育种创新可能具有重要的指导意义。核间等位基因在双核体细胞中存在不同的表达水平,为从双核体视角研究食用真菌的科学问题提供新思路。对食用真菌双核体的研究有可能形成更加具有学科特色的食用真菌研究范式。     

以新单倍体化和新单倍体性生物交配为手段鉴定侧耳属的培养

使用牛胆汁琼脂技术对侧耳属的双核体培养物进行新单倍体化(neohaploidization),生成的新单倍性生物(neohaplont)分离物为单核体,并且缺少锁状联合。这些新单倍性生物的分离物在与侧耳属已知单孢子测交菌株交配时,来自每一个亲本双核体的新单倍体性生物只能与一个种的测交菌株亲合。从而表明,该技术对鉴定双核体侧耳培养物有价值,同时对其它一些真菌类群有效。     

木耳和毛木耳的极性研究*

从木耳(Auricularia auricula)和毛木耳(A.polytricha)的同一子实体弹射、分离30个单孢子并发育成单核菌丝体,各自分成3组,以10×10方式进行单核体两两配对。取两配对单核体交结处菌丝体块到新的平板上继续发育并插入无菌的盖玻片让其菌丝爬上。后利用双苯并咪唑(Hoechst 33258)染色,在萤光显微镜下逐块检查配对后菌丝体细胞中核的数目。如果出现双核,再加以检查锁状联合以验证,则为配对亲和。不亲和者仍为单核。根据配对行为进行不亲和因子分配决定其交配型。检测结果表明,木耳和毛木耳担孢子的性别是由一对遗传因子A.a所控制。属典型性二极性(bipolar)异宗结合。     

木兰围场天然次生林优势种群的结构与动态

为了阐明木兰围场天然次生林优势种群的结构和动态特征,对群落乔木层组成以及优势种群的径级结构、静态生命表、存活曲线、死亡曲线、生存函数和时间序列预测等进行研究.结果表明: 群落乔木层有9个种群,其中,五角枫、蒙古栎、糠椴和白桦种群为群落的优势种群;五角枫和糠椴种群存活曲线接近于Deevey-Ⅱ型,蒙古栎种群存活曲线趋于Deevey-Ⅲ型,白桦种群存活曲线为Deevey-Ⅱ型;随着径级的增加,各优势种群的死亡率和消失率曲线呈现相似的变化趋势,五角枫、蒙古栎、糠椴种群的消失率和死亡率分别在Ⅳ、Ⅰ和Ⅰ径级下出现最大值,而白桦种群在各径级呈现稳定的变化趋势;4种生存函数曲线分析表明,五角枫、蒙古栎和糠椴种群具有前期锐减、中后期相对稳定的特点;白桦种群数量波动不明显,具有较稳定的特点.种群数量的时间序列预测表明,白桦种群小径级(Ⅰ～Ⅱ级)个体数量逐渐减少,种群未来有趋于衰退的趋势,五角枫、蒙古栎和糠椴种群趋于相对稳定.推测该次生林将逐步演替为以五角枫、蒙古栎和糠椴为主要树种的天然次生林.     

基于转录组分析香菇不同漆酶活性单核菌丝体基因表达

漆酶是香菇生长发育过程中一种重要的木质素降解酶,其活性高低对于香菇木质素降解能力和香菇品质形成具有重要作用。为探讨香菇不同漆酶活性的单核菌丝体基因表达变化,对漆酶活性存在差异的单核菌丝体进行转录组测序分析,共获得15 522个注释基因。GO（gene ontology）分析表明差异基因在氧化还原酶活性节点大量富集,包括参与木质素降解的酶类及55个细胞色素P450基因;KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析发现淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化途径中糖苷水解酶、UDPG脱氢酶等基因上调表达。通过搜索转录因子数据筛选到172个差异表达的转录因子,预测了可能与漆酶结合的bZIP、C₂H₂、C₄转录因子家族。由此推测,在漆酶高产单核菌株中木质素降解和碳水化合物代谢的相关基因的表达发生变化,及糖醛酸和磷酸戊糖途径相关基因上调表达,促进了木质素降解产物高效转化成糖、核酸等生物大分子,有助于香菇菌丝体的生长,转录因子在漆酶活性调控中起了重要作用。本研究为深入理解香菇漆酶高产菌株的生理代谢机制提供了重要的基因数据资源。     

Genes encoding multiple drug resistance-like proteins in Aspergillus fumigatus and Aspergillus flavus

Polymerase chain reaction using degenerate primers was used to identify genes encoding proteins of the ATP-binding cassette superfamily in Aspergillus fumigatus and Aspergillus flavus. In A. fumigatus, two genes (AfuMDR1 and AfuMDR2) encoding proteins of the ATP-binding cassette superfamily were identified. One gene (AflMDR1) was isolated from A. flavus and is the apparent homologue to AfuMDR1. AfuMDR1and AflMDR1 encode proteins of molecular weights 148 000 and 143 000, respectively, each containing 12 putative transmembrane regions and two ATP-binding sites. These proteins are arranged in two homologous halves, each half consisting of a hydrophobic region (encoding six putative transmembrane domains) and an ATP-binding site. The AfuMDR1 and AflMDR1-encoded proteins bear a high degree of similarity to the Schizosaccharomyces pombe leptomycin B resistance protein and to human MDR1. The second gene identified in A. fumigatus, AfuMDR2, encodes a protein of molecular weight 85 000, containing four putative transmembrane domains and an ATP binding domain. The encoded protein is similar to those encoded by MDL1 and MDL2, two MDR-like genes of Saccharomyces cerevisiae. Expression of AFUMDR1 in S. cerevisiae conferred increased resistance to the antifungal agent cilofungin (LY121019), an echinocandin B analog.     

粗山羊草CCT家族基因序列分析及激素响应

开花是植物生长发育的重要过程。CCT家族基因在植物中广泛存在, 参与植物花期的调控过程。该文从粗山羊草(Aegilops tauschii)全基因组中分离出26个CCT基因, 它们分布于7对染色体上, 按照排列顺序将其命名为AetCCT1-26。AetCCT蛋白分子量介于14.9 kDa (AetCCT3)-83.2 kDa (AetCCT12)之间, 其中有25个蛋白包含完整的CCT保守结构域。系统发育分析显示, 12对粗山羊草/乌拉尔图小麦(Triticum urartu) CCT蛋白和9对粗山羊草/水稻(Oryza sativa) CCT蛋白为直系同源蛋白。通过公共数据的数字表达分析表明, AetCCT具有组织特异性和组成型2种表达形式, 其中AetCCT3、AetCCT4、AetCCT7及AetCCT9等9个基因在大部分组织中都有表达, 而AetCCT15、AetCCT21和AetCCT25等基因分别在种子、叶和根等少数组织中特异表达。AetCCT家族可以响应不同外源激素, 施用激素24小时和72小时后各成员对激素响应整体表现一致, 但不同成员对于不同激素的响应存在差异, 表明该家族成员在功能和行使方式等方面具有一定的多样性, 可能参与不同生长发育过程。光照条件影响AetCCT的表达, 说明光照和春化作用是影响与调控该家族基因表达的重要因素。研究结果有助于探索小麦(T. aestivum)进化、驯化和演变的规律, 以及认识重要农艺性状的形成与互作网络。     

农杆菌介导Txpam基因转化烟曲霉TMS-26及其产紫杉醇效果评价

为研究红豆杉紫杉醇合成途径限速酶基因功能及其对内生真菌烟曲霉TMS-26发酵产紫杉醇的影响,以曼地亚红豆杉愈伤组织制备cDNA作为模板扩增苯丙氨酸氨基变位酶基因（Txpam）,构建重组质粒pGEX-4T-1-Txpam,转入大肠杆菌中进行异源诱导表达,经亲和层析纯化,获取重组酶TxPAM并验证其酶活性。构建pCAMBIA1302-Txpam质粒,转化农杆菌感受态细胞,利用农杆菌介导的转化体系获得转化子并优化转化条件,结合插入片段携带的分子标记和目的基因进行转化子验证,同时培养转化菌株并检测紫杉醇产量。结果表明：纯化获取的重组酶TxPAM,经HPLC检测具有将α-苯丙氨酸催化为β-苯丙氨酸的功能;在最优转化条件下,转化子数目达到471个/10⁶个孢子;根据基因hyg和Txpam的克隆以及测序结果,说明成功构建了基因工程菌株,通过对其发酵条件进行优化,紫杉醇产量达到721.87μg/L。     

基于COⅠ基因序列的蜜蜂属系统发育分析及其舞蹈和筑巢行为进化分析

【目的】分析蜜蜂属Apis的系统发育关系,并在此基础上探讨蜜蜂属舞蹈方向、舞蹈声音、营巢环境、巢脾结构的祖先状态和演变过程。【方法】PCR扩增并测定中国分布的蜜蜂属内东方蜜蜂A. cerana、西方蜜蜂A. mellifera、大蜜蜂A. dorsata、黑大蜜蜂A. laboriosa、小蜜蜂A. florea和黑小蜜蜂A. andreniformis的线粒体COⅠ基因序列,并从NCBI数据库中下载分布于其他国家或地区的上述6种蜜蜂以及绿努蜂A. nulunsis、苏拉威西蜂A. nigrocinta、沙巴蜂A. koschevnikovi、炳式大蜜蜂A. dorsata binghami的COⅠ同源序列。分别利用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯分析(BI)依据这些序列数据构建蜜蜂属系统发育关系。对蜜蜂属上述种的舞蹈语言和筑巢行为进行编码并作为性状特征标记到系统发育树中,利用简约法对祖先状态进行追溯。【结果】系统发育分析结果表明,蜜蜂属可划分为3大类群,即穴居蜜蜂类群(东方蜜蜂、西方蜜蜂、苏拉威西蜂、绿努蜂、沙巴蜂)、大蜜蜂类群(大蜜蜂、黑大蜜蜂)和小蜜蜂类群(小蜜蜂、黑小蜜蜂);小蜜蜂类群更加接近于祖型,大蜜蜂类群和穴居蜜蜂类群是两支单系;炳式大蜜蜂是独立于大蜜蜂和黑大蜜蜂的蜂种,且与黑大蜜蜂的亲缘关系更近。祖先状态重建结果显示：蜜蜂属祖先在露天环境下筑造垂直的单脾,且在传播食物或巢址信息时跳水平方向的无声摆尾舞,有嗡嗡声的舞蹈及筑造复脾是后来形成的。【结论】COⅠ基因可作为分子标记用于分析蜜蜂属的舞蹈和筑巢行为的祖先状态及进化过程;蜜蜂筑造复脾、跳有嗡嗡声的舞蹈是后期的适应性进化行为。     

基于较大降水事件的人工固沙植被区植物水分来源分析

水分是干旱、半干旱地区植物生长最主要的限制因子.为了探究较大降水事件后两种常见人工固沙植物柠条与油蒿的水分来源差异,分析降水、土壤水、地下水和植物茎水的氢氧稳定同位素特征,并采用直接对比法和多元线性混合模型对植物水分来源进行分析.结果表明: 沙坡头地区大气降水线方程为δD=7.83δ¹⁸O+5.64(R²=0.91).降水δ¹⁸O值的变化范围较大,具有明显的季节变化规律;生长季前期与后期δ¹⁸O值相对较高,生长旺盛期δ¹⁸O处于较低水平.浅层土壤水δ¹⁸O值变化范围较大,随土层深度的增加,土壤水δ¹⁸O值变幅减小且呈减小趋势.在降水后第一天,柠条和油蒿分别对40～80与20～60 cm土层土壤水利用比例较高,利用比率分别为56.1%和56.4%.降水一周后,柠条与油蒿都不同程度地增加了对浅层土壤水的利用比例.柠条和油蒿对0～40和0～20 cm土层土壤水分利用率分别增加了12.5%和10%.表明在较大降水事件后,柠条和油蒿会通过调整水分利用策略来积极适应干旱环境.     

盐胁迫下大豆根组织定量PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR已广泛用于基因表达的分析, 适当的内参基因选择是获得准确分析结果的关键。在大豆(Glycine max)分子生物学研究中, 逆境响应基因和microRNA (miRNA)表达的内参辅助检测基因均有哪些目前尚不清楚。该研究选用不同盐梯度和时间点组合处理的大豆根组织为材料, 对已报道的其它条件下表达相对稳定的内参基因(ACT、ACT2/7、CYP2、ELF1A、ELF1B、F-Box、TUA和UBC2)以及miRNA内参基因(U6、miR1515a、miR1520c、miR1520d、miR171a和miR171b)的表达情况进行了全面检测; 并采用Δ-Ct、Bestkeeper、NormFinder和Genorm四种方法对检测结果进行了综合分析, 发现ELF1B和CYP2适合作为大豆根系盐胁迫响应基因研究的内参基因, miR1515a和U6适合作为盐胁迫下大豆根组织miRNA研究的内参。上述研究结果为大豆盐胁迫响应基因和miRNA表达及其进一步的功能研究奠定了基础。     

互补交配型配对诱导蛹虫草有性子实体形成

前期我们获得了优良性状蛹虫草Cordyceps militaris野生菌株W141436,其子实体虫草素含量高达3.72 mg/kg干重,子实体多糖高达6.7 g/100 g干重,但在大规模应用中发现它发生退化。针对蛹虫草人工栽培退化问题,我们提出蛹虫草子实体形成是有性生殖过程,其两种交配型发生交配是蛹虫草子实体形成的必要条件。本文基于交配型基因分子标记研究了优良性状蛹虫草野生菌株W141436的退化机制。具体地,采用单孢子分离的方法对蛹虫草野生分离株W141436的子囊孢子进行分离,得到了72个单孢菌株。进一步采用PCR方法对单孢菌株及亲本菌株进行了交配型基因类型鉴定。在72个单孢菌株中,28株为Mat1-1类型交配基因型,31株为Mat1-2类型交配基因型,13株含有与亲本相同的交配型基因。根据鉴定结果,对2株Mat1-1型(SP28、SP33)和2株Mat1-2型(SP15、SP32)菌株进行了栽培实验。结果表明,形成子实体的栽培用亲本菌株同时含有Mat1-1和Mat1-2两种交配类型基因,即只有含不同交配型基因的菌株具有发育为子实体的能力,而含同种交配型基因的菌株则不能发育为子实体。本研究为防止蛹虫草在大规模种植中退化提供了理论依据。     

针叶树病原菌异担子菌属的物种多样性及相关检疫建议

异担子菌属Heterobasidion种类是北半球针叶树最严重的森林病原菌,在世界范围内能侵染27种针叶树,对欧洲和北美洲的经营林已造成重大损失。基于传统形态学研究,认为异担子菌属有2个种,即多年异担子菌H. annosum和岛生异担子菌H. insulare,然而单孢交配实验研究证明2个种为复合种。分子系统发育分析研究表明：异担子菌属包括15个种,其中5个种为森林病原菌[冷杉异担子菌H. abietinum、多年异担子菌（狭义）H. annosum s. str.、变孔异担子菌H. irregulare、西方异担子菌H. occidentale和小孔异担子菌H. parviporum];10个种为腐生菌（淀粉孢异担子菌H. amyloideum、南洋杉异担子菌H. araucariae、阿曼德异担子菌H. armandii、南方异担子菌H. australe、岛生异担子菌H. insulare、林芝异担子菌H. linzhiense、东方异担子菌H. orientale、拟岛生异担子菌H. subinsulare、拟小孔异担子菌H. subparviporum和西藏异担子菌H. tibeticum）。多年异担子菌（狭义）H. annosum s. str.、小孔异担子菌H. parviporum和冷杉异担子菌H. abietinum分布于欧洲,分别是松属、云杉属和冷杉属林木的病原菌。变孔异担子菌H. irregulare和西方异担子菌H. occidentale分布于北美洲,前者侵染松属和柏属树木,后者侵染冷杉属、铁杉属、黄杉属和巨杉属树木。虽然广义的多年异担子菌H. annosum sensu lato曾在我国报道,但基于目前研究结果表明该种为拟小孔异担子菌H. subparviporum。目前世界上最具侵染力的5种病原菌即狭义的多年异担子菌H. annosum s. str.、小孔异担子菌H. parviporum、冷杉异担子菌H. abietinum、变孔异担子菌H. irregulare和西方异担子菌H. occidentale还未在我国发现,也未列为对外检疫对象,因此建议将其列为进境植物检疫性有害生物。RNA聚合酶II大亚基序列（RPB1）在异担子菌属种类鉴定中敏感性和特异性最高,研究证明该分子方法可应用于鉴别不同异担子菌种类的有效基因标记,在海关部门进行原木和木质产品的检疫中可运用该分子标记进行林木病原异担子菌的检测。