豌豆NAD激酶的提纯及活力测定

NAD激酶(ATP:NAD 2′-磷酸转移酶EC 2.7.1.23简称NADK)催化NAD磷酸化生成NADP,其活性随着酶的纯化而降低,其激活依赖于Ca~(2 )激活的钙调素(Calmod-ulin简称CaM),两者之间成剂量关系,因此,可用该酶定量CaM。活性CaM一般采用酶法[如环腺苷酸磷酸二酯酶(PDE)和红血球Ca~(2 )-ATP酶等]定量,但采用这类酶时,酶活性易受磷酯与脂     

蛋白磷酸酶

神经和激素对细胞代谢的调节机能主要是通过控制蛋白激酶和(或)蛋白磷酸酶(proteinphosphatase,PrP)的活性,使代谢途径中的调节酶发生可逆磷酸化。生物合成途径中的限速酶,如糖原合成酶、乙酰CoA羧化酶和HMG-CoA还原酶等在蛋白激酶作用下活性降低,而PrP则将这些酶重新激活。反之,磷酸化激活生物降解途径中的限速酶,如糖原磷酸化酶和甘油三酯脂酶等,则脱磷酸又使其失去活性。     

解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质

【目的】克隆解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶LIP4和LIP5的cDNA序列,研究其基因结构,并实现其在毕赤酵母中的功能表达,以探讨其酶学性质。【方法】利用反转录PCR首次扩增LIP4和LIP5的编码基因,用SignalP 3.0分析其基因序列,然后分别构建胞内表达载体pPIC3.5K-Lip4、pPIC3.5K-Lip5和胞外表达载体pPIC9K-Lip4、pPIC9K-Lip5,将其转入毕赤酵母GS115中表达,以NTA树脂纯化酶蛋白,研究其酶学性质。【结果】cDNA序列测序结果显示两者均不含内含子,酶蛋白的氨基酸序列中含有典型脂肪酶的活性三联体结构和五肽保守区;酶学性质研究表明,两者的最适底物均为癸酸(C8)对硝基苯酚酯,最适pH为7.0,最适温度为40℃,但LIP4对pH和温度更敏感;两者均能被Ca2+激活,且LIP5还能为Mg2+激活,但均被Hg2+、乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)强烈抑制。【结论】首次克隆了解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5编码基因,实现了其在毕赤酵母中的活性表达,并初步研究了其酶学性质,为上述脂肪酶的应用及进一步深入研究解脂耶氏酵母脂肪酶家族奠定了基础。     

山莨菪碱对肌质网Ca~(2+)-ATPase活力和转运功能的影响

本文研究了山莨菪碱对肌质网Ca~(2 )-ATPase活力及转运功能的影响.对膜结合及分离纯化的Ca~(2 )-ATPase,体系中加入不同量的药物都对酶的活力及转运效率无明显影响.当将药物与肌质网或纯化的Ca~(2 )-ATPase预保温后,山莨菪碱则表现出在低浓度使酶激活,高浓度抑制酶的活力.但都导致SRCa~(2 )转运效率降低.对用保温,超声及去污剂透析三种不同方法重建的脂酶体,结果表明:山莨菪碱通过作用于膜脂后,在低浓度激活Ca~(2 )-ATPase、高浓度抑制酶的活力.比较药物对不同类型纯磷脂重建的脂酶体活性的影响发现:山莨菪碱对含有酸性磷脂的脂酶体Ca~(2 )-ATPase的作用较不含酸性磷脂的要大.     

肝脂酶基因多态性与冠心病的关系

肝脂酶 (hepaticlipase,HL)对血浆脂蛋白的代谢起重要作用 ,它影响着血浆中高密度脂蛋白 (HDL)的水平以及低密度脂蛋白 (LDL)的种类 ,因此肝脂酶的活性与冠心病的发生具有相关性。肝脂酶基因的单核苷酸多态性 (SNP)与酶的活性相关 ,并影响血浆脂蛋白水平以及冠心病的发生。为研究肝脂酶基因的单核苷酸多态性与中国汉族冠心病的相关性 ,采用聚合酶链反应、变性高效液相色谱及DNA测序等技术对 10 2例经冠状动脉造影确诊的冠心病患者和 84例正常对照的肝脂酶基因 (包括启动子区以及所有外显子 )的SNP进行了研究 ,结果在肝脂酶基因启动子区发现了一未见文献报道的多态位点 ,即- 2T→C转换。经检验 ,对照组和病例组基因型频率的分布符合Hardy Weinberg平衡。冠心病患者组中 - 2C等位基因的携带者 (基因型为TC或CC)显著高于对照组 (5 7.9%versus 4 2 .7% ,χ2 =4 .181,df=2 ,P =0 .0 4 1) ,且冠心病组中 - 2C等位基因的频率显著高于对照组 (χ2 =3.988,df =1,P =0 .0 4 6 ,OR =1.5 8,95 %CI =1.0 1～ 2 .4 7) ;在冠心病组中进一步发现 -2C等位基因与高密度脂蛋白胆固醇水平升高相关 (P <0 .0 5 )。这提示肝脂酶基因的 - 2T→C多态性可能与血浆高密度脂蛋白胆固醇的水平以及冠心病的发生具有相关性。     

大鼠前脂细胞质膜Na+/H+交换同时参与细胞的增殖和分化

以原代培养的大鼠前脂细胞为模型, 以2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF)作为检测胞内pH(pHi)的荧光探针,测定不同生长因子刺激下胞内pH的变化,证明大鼠肾周前脂细胞质膜存在Na+/H+交换活性,胎牛血清(FCS)能快速激活Na+/H+交换, 导致pHi升高(约0.2 pH单位),并引起DNA合成.Ethyl-isopropyl-amiloride (EIPA)抑制Na+/H+交换与DNA合成.在无血清条件下,胰岛素不刺激DNA合成但引起细胞分化, 表现为胞内脂滴积累和3-磷酸-甘油脱氢酶(G3PDH酶)活性增强,同时激活Na+/H+交换活性导致pHi升高;EIPA既抑制胰岛素对Na+/H+交换的激活,也抑制G3PDH酶活性增强.结果证明:Na+/H+交换的激活不仅与大鼠前脂细胞增殖相关,同时也是细胞分化的早期事件.     

应用于工业生产的高效脂酶

利用原核生物生产脂酶具有很大的商业潜力。一个由CEC BRIDGE资助的项目正致力于研究假单胞菌脂酶。假单胞菌属(Pseudomonas)脂酶是一类独特的脂酶,在从食品到清洁剂等广泛领域内具有极好的应用特性。通过获得脂酶的结构信息,研究其活动机理,产生专门应用于特殊工业生产的特制脂酶是可行的。对P.glumae脂酶和另外一些脂酶的活性进行了筛选。将从不同脂酶获得的结果与其单独的结构信息比较,为这些脂酶的位置专一性提供详细的资料。当上述工作全部完成后将进行脂酶的动力学研     

膜脂状态在Mg~2+对线粒体H~+-ATP酶影响中的作用

对猪心线粒体H-ATP酶体系中膜脂在Mg~(2 )的激活功能中起极重要的作用。通过DPH外源荧光探针和5-NSESR探针测膜脂表层Mg~(2 )作用影响的研究表明Mg~(2 )首先对膜脂作用,增加膜脂的有序性。TU颗粒和复合体的酶、色氨酸残基内源荧光偏振度测定的结果表明Mg~(2 )可进而影响内嵌蛋Fo,最终导致F_1上功能位点的构象和功能的变化。但膜脂的原始状态对Mg~(2 )起作用是重要的。     

大豆液泡膜H~+-ATPase的纯化和重组

通过不连续蔗糖密度梯度离心得到的液泡膜微囊 ,先由胆酸钠和 OG分步破膜抽提、经阴离子交换柱 ( Q- Sepharose)层析分离 .纯化后的酶含 V型 H+ - ATPase的主要亚基 ,与大豆磷脂重组 ,获得了有较高泵活性的脂酶体 .脂酶体的质子泵活性受 Valinomycin激活 ,说明它是致电性的 ,受NO-3 ,DCCD以及特异性的 V型 ATPase抑制剂 Bafilomycin的抑制 .脂酶体的泵活性不受 F型和P型 ATPase抑制剂抑制 ,表明质子转运是由 V型 H+ - ATPase引起的 .     

蛋白激酶C活性变化对Adipophilin介导THP-1巨噬细胞脂质蓄积的影响

以THP-1巨噬细胞为研究对象,观察蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波酯(PMA)和抑制剂钙磷酸结合蛋白C(CalphostinC)对胞膜PKC活性、胞膜PKCα及胞浆内过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)和adipophilin表达以及细胞内脂质蓄积的影响,初步探讨PKC调控adipophilin表达及脂质蓄积的作用机制.采用PepTagRAssay、RT-PCR、蛋白质印迹、油红O染色和高效液相色谱法,观察到100nmol/LPMA在激活胞膜PKC((0.2514±0.0154)U/ml)的同时可以与氧化低密度脂蛋白(oxLDL)协同增强PKCα、PPARγ和adipophilin表达并使细胞内脂滴的蓄积极大地增强.细胞内胆固醇酯/总胆固醇比值增至(69.8±9.5)%;300nmol/L CalphostinC对荷脂THP-1巨噬细胞的处理则抑制酶活性至((0.0927±0.0056)U/ml,细胞内脂滴减少,胆固醇酯/总胆固醇比值降至(40.1±9.1)%;CalphostinC呈剂量依赖性的方式下调酶活性、PKCα、PPARγ和adipophilin表达,400nmol/LCalphostinC基本上可以逆转50mg/LoxLDL诱导的酶活化和PKCα、PPARγ和adipophilin表达的上调.结果提示,蛋白激酶C活性的改变可以影响adipophilin介导的脂质蓄积,其中PPARγ可能在这一调控机制中发挥了重要作用.