乙型肝炎病毒重组DNA转化Vero绿猴肾传代细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原

使用首尾相连的乙型肝炎双拷贝DNA重组质粒pTHBV-1,以pSV2-gpt(Eco-gpt)为选择标记基因,共转化CV-1绿猴肾非营养缺陷型细胞,用霉酚酸、黄嘌呤(MX)作选择培基,选出分泌表面抗原(HBsAg)的细胞系,但HBsAg分泌量较低,见前报告。Christman等人报告,利用二氢叶酸还原酶(dhfr)基因和乙肝重组DNA质粒共转化NIH     

几种乙型肝炎病毒DNA重组质粒的改建及其在哺乳动物细胞高效表达乙型肝炎表面抗原

将Bgl Ⅱ不完全水解pTHBV一1质粒产生的两种乙型肝炎病毒(HBV)DNA片段插入pSV2-dhft质粒的Bglll切口,构造成{种重组质粒,其结构特点是：1都含有SV40的DNA复制起点和早期启动子;2都含有二氢叶酸还原酶基因(dhfr) 3·{种重组质粒是在dhfr。基因3’末端分别插入两种大小不同,方向相反的HBV’DNA片段而成。使用这4种质粒DNA分别和tk质粒DNA共转化Ltr细胞,在HAT培养基选择压力下4种质粒都得到有效表达HBsAg。通过换用氨甲喋呤并逐渐增加其药量,从氨甲喋呤抗性细胞中获得高效表达HBsAg的B2和B16细胞系。据固相放射免疫检测结果计算,B16细胞系的HBxAF分泌量可达12．5pg／10’细胞／天．细胞传代4个月表达稳定。这些细胞在HBsAg诊断试剂和疫苗研制中具有潜在的应用价值。     

靶向HBs基因的shRNA表达载体的构建及其抑制HepG2.2.15表达HBVsAg的作用

探索用PGenesil-1(Pg)构建的靶向乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(简称Pgs),对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV基因及其抗原表达的抑制作用.设计、合成靶向HBV S区的3对DNA序列,分别插入PGenesil-1中构建3个siRNA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,经限制性内切酶,DNA序列测定等技术鉴定确认.筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量后,分别或按不同组合转染HepG-2.2.15细胞,48 h后采用半定量RT-PCR检测HBVsmRNA转录水平,免疫细胞化学技术检测HBsAg表达水平,MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平.结果表明,HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3均能不同程度地抑制HepG2.2.15细胞中的HBsAg、HBeAg合成和HBs-mRNA转录.成功构建的HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,其中PgS3能显著抑制HBsAg表达(P＜0.01).多种表达载体联合对抗原表达的抑制作用效率不同.     

mbr-FPGS高效表达质粒增强Jurkat细胞对甲氨蝶呤的敏感性

叶酰多聚谷氨酸盐合成酶(Folylpolyglutamate synthetase,FPGS)是将化疗药物甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)转化成甲氨蝶呤多聚谷氨酸盐(MTXPG)的关键酶,其表达水平直接影响肿瘤细胞对MTX敏感性。与B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)相比,T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞中FPGS表达水平低,因此对MTX不敏感。本实验室前期研究证实,位于BCL2基因3′-UTR区的一段长279 bp的DNA序列mbr具有显著的增强子效应。文章构建了含有mbr增强子样序列的FPGS表达质粒,用其转染Jurkat细胞后,分别以Westernblotting和MTT法检测FPGS表达水平及MTX对肿瘤细胞的抑制率。结果表明mbr能够显著提高FPGS表达质粒的表达水平,并有效增强Jurkat细胞对MTX的敏感性。这一结果为将基础研究结果应用于临床、提高MTX对T-ALL细胞的化疗疗效提供了新的思路。     

乙型肝炎病毒adr和adw亚型表面抗原在非洲绿猴肾细胞中的表达

用pSV2-gPt作载体,将乙型肝炎病毒adr亚型的全序列基因和adw亚型的Bgl Ⅱ大片段DNA分别插入PSV 2-gpt BamHI及Bgl Ⅱ切口,获得4种重组质粒。它们都含有SV40DNA复制起始点、早期启动子、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)和氨苄青霉素抗性基因(Apr)。经酶切鉴定,选出正向重组质粒PSV 2-gbr1和pSV 2-gbw1,并分别转化Vero细胞,在选择培养基的压力下,两个质粒所含乙型肝炎表面抗原DNA均得到表达。     

HeLa S3 DNA转染后XP细胞UV抗性的稳定增加和切除修复基因的定位探索

 通过带有选择标志的质粒pSV_2Neo的基因共转染和第一轮转化的XP细胞DNA的再转染,进一步证明了前文报道的HeLaS3 DNA的切除修复基因在XP细胞中的稳定表达,以及受体细胞UV抗性的稳定增加。通过五种限制性核酸内切酶酶切DNA片段的转染,初步寻找出切除修复基因位于Bg1 Ⅰ,xhoⅠ 酶切片段之中。     

丹参酮ⅡA联合CASC2对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响固有淋巴细胞在脂质代谢中的研究进展

为了研究丹参酮ⅡA联合长链非编码RNA(lnc RNA)癌易感性候选基因2(CASC2)对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响,该研究采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测CASC2在甲状腺癌组织中的表达。将甲状腺癌SW579细胞分为pc DNA3.1组(转染pc DNA3.1质粒), pc DNA3.1-CASC2组(转染pc DNA3.1-CASC2质粒), con组(用与丹参酮ⅡA等量的二甲基亚砜处理),药物-1、2、3、4组(分别用1、2、4、8μg/m L丹参酮ⅡA处理),药物-4+pc DNA3.1组(转染pc DNA3.1质粒且用8μg/m L丹参酮ⅡA处理),药物-4+pc DNA3.1-CASC2组(转染pc DNA3.1-CASC2质粒且用8μg/m L丹参酮ⅡA处理)。分别用细胞计数试剂盒(CCK-8)和平板克隆检测细胞存活与克隆形成;流式细胞术检测细胞凋亡; Transwell检测细胞迁移、侵袭;蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达。结果显示,与癌旁组织相比,甲状腺癌组织中的CASC2表达量显著降低(P0.05)。过表达CASC2明显降低SW579细胞的存活率、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数和MMP-2蛋白表达量,显著提高细胞凋亡率、P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表达量(P0.05)。丹参酮ⅡA明显降低SW579细胞的存活率、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2蛋白水平,显著提高细胞凋亡率、P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表达水平,且均呈浓度依赖性(P0.05)。丹参酮ⅡA联合CASC2明显降低SW579细胞的存活率、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2蛋白表达量,显著提高细胞凋亡率、P21、Caspase-3和E-cadherin蛋白水平(P0.05)。因此,丹参酮ⅡA联合CASC2可以抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,以及诱导细胞凋亡。     

人β-干扰素重组质粒在CHO-dhfr~-细胞中表达水平与MTX的关系

人IFNβ基因编码序列与pSC_7-dhfr~-载体重组构建的由SV_(40)早期启动子控制的组成性表达cDNA克隆,转染CHO-dhfr~-细胞,用氨甲喋呤(MTX)逐渐加压,观察其表达情况。二氢叶酸还原酶(dhfr)有一特性,其基因拷贝数可在MTX的选择压力下扩增,     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体在CHO细胞中的高效表达

构建了二氢叶酸还原酶(dhfr)选择基因启动子上游无增强子(cnhancer)的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr~-)。用氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10~(-7)mol/L MTX压力下,得到了表达水平达1500～2500IU/10~6细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。     

人β干挠素基因在SV40晚期启动子控制下在小鼠骨髓瘤细胞中表达

人成纤维细胞干挠素(Hu-IFN-β)基因的HindⅡ片段,插入载体pSV2-dhfr质粒中SV40晚期启动子(Lp)下游PvuⅡ位点处。用此重组质粒与带有黄嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因的质粒pSV2-gpt共转染次黄嘌吟核糖转移酶(HGPRT)基因缺陷的小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞。在含有霉酚酸和氨基喋呤的选择培基中,筛选出有效地组成性表达的细胞株。在未加氨甲喋呤压力倍增的条件下,Hu-IFN-β抗病毒活性为1275U/10~5细胞,1ml,48小时。