油松雌性不育系球果蛋白质双向电泳技术的建立

本文建立了油松雌性不育系雌球果蛋白质组研究中的双向电泳技术.第一向采用固定pH值梯度(IPG)胶条在IPGphorTM等电聚焦仪上进行等电聚焦,第二向在恒功率且恒温条件下于Ettan-DALTTMⅡ高通量电泳仪上进行SDS-PAGE电泳,以银染和考马斯亮蓝两种方法染色.通过对全蛋白的提取、胶条pH值和胶条肿胀等技术环节的优化和比较,得到了重复性很高,分离效果良好的蛋白质双向图谱.     

粘虫中肠总蛋白质双向电泳体系的优化方法

为了今后更好的利用双向电泳技术研究不同处理后粘虫Mythimna separata中肠蛋白表达差异,本研究比较了不同的蛋白提取方法、IPG胶条、二硫苏糖醇(DTT)浓度和等电聚焦条件,建立了适用于粘虫中肠总蛋白质的双向电泳体系。结果表明:采用Tris-饱和酚法提取蛋白质,选取p H为5-8的线性IPG胶条进行第一向等电点分离,按照DTT浓度I和等电聚焦程序II进行双向电泳分离,获得了蛋白质点数多、背景清晰、分辨率高的蛋白质双向电泳图谱。     

油松雌性不育系球果蛋白质双向电泳技术的建立

本文建立了油松雌性不育系雌球果蛋白质组研究中的双向电泳技术。第一向采用固定pH值梯度（IPG）胶条在IPGphorTM等电聚焦仪上进行等电聚焦,第二向在恒功率且恒温条件下于Ettan-DALTTMⅡ高通量电泳仪上进行SDS-PAGE电泳,以银染和考马斯亮蓝两种方法染色。通过对全蛋白的提取、胶条pH值和胶条肿胀等技术环节的优化和比较,得到了重复性很高,分离效果良好的蛋白质双向图谱。     

小麦低分子量麦谷蛋白亚基组成研究

利用改良的两步一向SDS—PAGE(two—step one—dimensional SDS—PAGE)分析了几种小麦低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)组成。70％热乙醇提取总谷蛋白,11％分离胶进行第一步SDS—PAGE分离．电泳1h后切取顶端1cm胶条并置于巯基乙醇溶液进行还原,还原后的胶条于11%～16．5％的梯度胶进行第二步SDS—PAGE分离。结果显示。两步一向SDS—PAGE可以彻底除去清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白对LMW—GS分离的背景干扰。提高LMW—GS的分辨率。对几种小麦低分子量麦谷蛋白亚基分析表明：LMW-GS组合比HMW—GS更为丰富,每种小麦含有2～5种B亚基,2～4种C亚基．B、C亚基的总数量为4～8种。     

小麦苗期地下茎蛋白质双向电泳技术体系的优化

以东农冬麦1号为材料,对苗期地下茎处的蛋白提取方法、蛋白溶解、上样量、胶条的转移等方面进行了试验.结果表明:在蛋白提取方面,TCA/丙酮法(T法)和尿素/硫脲法(N法)相比T法能减少低丰度蛋白的损失得到蛋白点数更多的图谱.在蛋白溶解方面,经过两次水化液溶解的蛋纯度较高,在等电聚焦时能保持8000伏较高电压.上样量方面,10mg粗蛋白溶于两次水化液能得到清晰、分离效果好、蛋白点数较多的图像.胶条转移方面,先向胶面中加入400μl0.3%普通琼脂糖溶液后,用200μl的电极缓冲液冲洗胶条支撑膜会使胶条顺利转移到第二向胶面上且胶条与胶面间不会产生气泡.     

血清样本双向电泳操作条件的优化

为建立分辨率高、重复性好的血清样品双向电泳技术,本文从血清样品的水化、等电聚焦、胶条的平衡、胶条的染色等几个方面对双向电泳操作条件进行了分析。结果表明采用以下的操作过程可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳结果：样品水化2小时（25℃);胶条泡涨12-16小时(25℃);17cm胶条的等点聚焦程序采用 250V线性1小时/1000V线性1小时/4000V线性2小时/8000V线性3小时/8000V线性10小时/500V快速0.5小时/,11cm的胶条的等点聚焦程序采用250V慢速4小时/1000V快速2小时/4000V快速1小时/8000V快速2.5小时/8000V快速7小时/500V快速30分钟;两次平衡各15-20分钟;银染条件为固定两小时或过夜,敏化50-60分钟,定影30-40分钟,显影10分钟左右,终止10分钟）。这一研究对利用双向电泳分析血清蛋白具有很好的参考价值。     

小鼠黑质双向凝胶电泳技术的优化

为了优化小鼠黑质双向凝胶电泳(2-DE)技术,比较了不同样品预处理方法、不同胶条和不同上样量对凝胶电泳结果的影响。研究发现,两种样品预处理方法均可顺利升至最高等电聚焦(IEF)电压(10000V)。与Clean-upkit法相比,TAC/丙酮沉淀法预处理后蛋白得率较低,同时丢失了样品中的部分中、小分子蛋白质。pH3-10L胶条中蛋白点主要分布在中间区域;pH3-10NL胶条对中间区域的蛋白点的分离有所改善;pH4-7胶条中蛋白点分布均匀,横条纹较少。80μg上样量的图谱背景干净,但点数最少(411);180μg上样量的图谱蛋白点较多(883),且圆润、清晰,背景干净,分辨率高;300μg上样量的图谱蛋白点虽然最多(904),但背景较深,部分蛋白点融合,横条纹也较多。研究表明,对于小鼠黑质蛋白质,使用Clean-upkit法对样品进行预处理,选取pH4-7的胶条,采用180μg的上样量能获得背景干净、分辨率高的双向电泳图谱,为帕金森病的生物标志物和药物靶点的研究打下了基础。     

小菜蛾血淋巴蛋白质双向电泳技术体系的建立及优化

采用不同方法对小菜蛾Plutella xylostella(L.)血淋巴进行双向电泳研究,建立了一套适用于小菜蛾血淋巴蛋白质组分析的双向电泳体系。从样品处理方案、等电聚焦时间、染色方法等因素对小菜蛾双向电泳结果的影响进行了分析和优化。结果表明,TCA/丙酮沉淀法提取蛋白损失少,图谱均匀清晰,分辨率和重复性更高。不同长度胶条的最佳上样量不同,胶条长度为7、17、24cm时,最佳上样量依次为20～50μg、50～300μg、100～500μg,而聚焦时间则分别以24000、50000、65000vhr为宜。第二向聚丙烯酰胺凝胶的浓度以12%为宜,电泳后蛋白点呈均匀分布。银染的灵敏度明显高于考马斯亮蓝染色,可以检测出更多的蛋白点,但考马斯亮蓝染色在后续蛋白点质谱鉴定中具有优势。     

沙漠小球藻的蛋白双向电泳分析

为建立适用于小球藻(Chlorellasp.TLD6B)蛋白质组分析的双向电泳体系,该研究比较了TCA/丙酮沉淀法和Trisol提取法对小球藻蛋白的提取效果,不同pH梯度IPG胶条(pH3~10和pH4~7)、不同蛋白质上样量、不同聚焦程序对小球藻蛋白的分离效果。结果表明:(1)采用Trisol提取法可获得较高纯度蛋白,当选择24cm pH 3~10的线性IPG胶条时,上样量为500μg,聚焦80 000Vh效果最佳,可分辨蛋白点达726个;当选择24cm pH 4~7的线性IPG胶条时,上样量为1 000μg,聚焦80 000Vh效果最佳,可分辨蛋白点达1 230个。(2)该实验随机挑选了10个胶内蛋白点进行MALDI-TOF/TOF-MS鉴定分析表明,其中8个蛋白点鉴定成功,进一步说明Trisol提取法可适用于小球藻双向电泳分析。     

中枢神经蛋白质组分析中双向电泳技术的建立

建立和优化了中枢神经组织蛋白质组分析所需的双向电泳及相关技术.由于中枢神经组织结构的特殊性,样品处理非常困难.对样品液组成、样品处理、上样方式、上样量、IPG胶条和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法和保存等相关技术进行了比较研究和条件优化后,以固相pH梯度等电聚焦为第一向和SDS均一胶（T=12.5%）的水平电泳为第二向,成功地得到了神经组织双向电泳图谱.     

小麦地下茎双向电泳技术体系的优化

以东农冬麦1号为材料,对苗期地下茎处的蛋白提取方法、蛋白溶解、上样量、胶条的转移等方面进行试验,结果表明：在蛋白提取方面,TCA/丙酮法（T法）和尿素/硫脲法（N法）相比T法能减少低丰度蛋白的损失得到蛋白点数更多的图谱;在蛋白溶解方面,经过两次水化液溶解的蛋白纯度较高,在等电聚焦时能保持8000伏较高电压;上样量方面,10mg粗蛋白溶于两次水化液能得到清晰、分离效果好、蛋白点数较多的图像;胶条转移方面,先向胶面中加入400μl 0.3％普通琼脂糖溶液后,用200μl的电极缓冲液冲洗胶条的支撑膜会使胶条顺利转移到第二向胶面上且胶条与胶面间不会产生气泡。     

低温冰箱保存细胞的经验介绍

用作为培养细胞的保存方法,国内外多用液氮保存,但有些实验室则采用低温冰箱保存。至于后者保存细胞的有效性(细胞存活效果),由于细胞种类的不同,则有不同的结果。现将本单位采用低温冰箱保存细胞的有关经验及效果报道于后。 细胞有二倍体人胚肺细胞(HEL),传代细胞系Hep-2、Hela、MA 104(恒河猴胚肾细胞传代株),按常规将细胞用胰酶消化,生长     

2DE中IPG胶条转移到SDS-PAGE中的技术改进

2-维凝胶电泳(Two—dimensional gel electrophoresis,2DE)因其高通量、高分辨率等特点,被广泛用于蛋白质组的分离．然而,在蛋白质从第一向一固相(Immobilized pH gradients,IPG)胶条转移到第二向一十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(Sodium dodecyl sulfate,SDS;Polyacrylamide gel electrophoresis．PAGE)时,常会引起蛋白质的损失．尤其是当将IPG胶条放入浓缩胶上时,在胶面不平、技术不熟练等情况下,常会在IPG胶条下引入气泡,导致蛋白质更多的损失．现将IPG胶条转移过程进行改进：先在第二向的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶上加上薄薄的一层(约1～2mm厚)琼脂糖溶液,然后将IPG胶条转移上去,最后再封住胶条的上面．这样的转移不会引起气泡,可以大大提高实验的成功率及重复性,有利于蛋白质的转移(尤其是相对分子质量大于40kDa的蛋白质)．提高质谱鉴定的准确性．此法操作简便,可以减少因操作不熟练而带来的麻烦．     

一种简便经济的薄层凝胶电泳保存方法——滤纸转移自干法

在分析性聚丙烯酰胺凝胶电泳特别是平板等电聚焦电泳中,薄层凝胶越来越被广泛采用,它有节省试剂、加样量少、电泳时间短、分辨率高及冷却效果好等优点。分析者都希望能将电泳染色后的凝胶理想地保存下来,目前所采用的方法均是直接将凝胶干燥在玻璃板或凝胶支持膜上(由于凝胶太薄不能转移),或者使用专用的透明保存膜,有时还要用真空干燥器干燥。     

蝴蝶兰叶片蛋白质提取及双向电泳体系优化

通过对蛋白质提取、IPG胶条选择、上样量、水化方式、聚焦条件等方面的优化,建立蝴蝶兰叶片蛋白质的双向电泳体系。结果表明,采用酚抽提法提取蝴蝶兰叶片蛋白质的纯度较高,复溶较完全;双向电泳优化体系选用24 cm pH 3～10 NL的IPG胶条,被动水化,上样量为1.35 mg,B1程序进行等电聚焦,12%分离胶进行第二向电泳,考马斯亮蓝G-250染色。该方法获得分辨率较高、重复性较好的蝴蝶兰叶片双向电泳图谱,蛋白数点多达1163个,可以满足蝴蝶兰蛋白质组学研究和分析。     

一种适用于双向电泳分析的高效真菌线粒体提取及蛋白质制样方法

用液氮冷冻研磨法破碎真菌菌丝细胞,通过差速和蔗糖密度梯度离心分离纯化板栗疫病菌线粒体,所得线粒体产率(质量比)约为1/10~4。电子显微镜观察和蛋白印迹表明,所制备的线粒体完整性好,没有检测到其它细胞成分的污染。使用膜蛋白裂解液溶解线粒体制备蛋白样品,将蛋白样品200μg上样于pH3~10,24cm的非线性胶条进行等电聚焦,电聚焦后再进行第二向SDS-PAGE电泳分离,经银染获得重复性好、背景清晰、分辨率高(680±15个蛋白质点)的凝胶图谱。随机选择10个蛋白质点进行质谱分析,9个获得有效注释,均为线粒体特异性蛋白质,表明所制备的蛋白样品非常适合双向电泳分析及其后续的质谱鉴定。     

微生物的保存方法(续五)

<正> (九)非冻干的其他干燥保存法 如前所还,冻干法的基本特征是首先使试料冻结,继而使冰升华。所以,同液态干燥法相比,具有下列优点:(1)可防止发生气泡;(2)操作的全过程可在低温下进行;(3)在干燥过程中保持着多孔状态,不会形成皮膜或干燥不均匀;(4)能保持原形不变,加水后容易溶解。所以,冻干法可以说是微生物干燥保存的主要方法。 但是,冻干法并非在任何情况下总是最好的方法。例如,试料的予冻就有可能对于某种微生物具有极大的伤害。因此,人们又设计了几种不通过结冰进行干燥的方法。这一节就介绍此类干燥保存方法。 用土、砂等也是一种干燥方法,是一向应用甚广的主要的微生物保存方法,即前述的载体保存法。     

獭兔(Oryctolagus cuniculus)肌肉总蛋白双向电泳体系的建立

獭兔(Oryctolagus cuniculus),即力克斯兔,享有"兔中之王"之称,为皮肉兼用型兔。目前研究多在獭兔皮的利用和肉的营养成分等方面,而对獭兔肉质的蛋白组研究目前较少。本研究通过对双向电泳的上样浓度、IPG胶条pH值和长度、第一向聚焦方式和强度、第二向SDS-PAGE等条件进行优化,采用Image Master Platinum 7.0凝胶软件分析系统进行分析。研究表明獭兔肌肉合适的IPG胶条pH值为3～10,长度为24 cm,SDS-PAGE的凝胶浓度为12.5%,主动水化30V、13h,聚焦强度为60000Vhr,上样量为247.5μg,硝酸银染色,能够有效的分离獭兔肌肉总蛋白。本研究建立了适合獭兔肌肉分离的双向电泳条件,为獭兔肌肉蛋白组学研究提供依据。     

被SDS变性的蛋白质的电泳

LKB医药公司声称,在水平电泳系统中,采用该公司的预制Excel Gel~(TM)SDS(梯度为8～18)和Excel Gel~(TM)SDS缓冲胶条,可以不必做胶、配制缓冲液和切胶,就能在75分钟内高效地分离被SDS变性的分子量为6500～300000的蛋白质。凝胶的大小为110mm×245mm×0.5mm。薄层凝胶和冷却系统可加快分离、染色和脱色等过程,并提高蛋白带的分离度,在一块胶上可以走52个样,也可进行双向电泳。凝胶用塑料板支持,便于操作、分析和保存。Excel Gel SDS产品主要是与LKB医药公司的Multiphor~(TM)和Ultrophor~(TM)系统配合使用,但也可与FBE-3000和其他适当的水     

适用于黄瓜叶片、根系和果实总蛋白的双向电泳体系的建立

通过对上样量、分离胶浓度、等电聚焦参数三方面条件的优化,采用三氯乙酸/丙酮法提取黄瓜叶片总蛋白,初步建立了适用于黄瓜叶片总蛋白的双向电泳体系。进一步发现此优化条件结合蛋白的酚提取法,也适用于黄瓜根系和果实总蛋白的双向电泳。具体优化条件为:选用24 cm pH 4~7线性固相化pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)胶条,上样量为800μg,分离胶浓度为12.5%,按聚焦程序Ⅱ聚焦,采用胶体考马斯亮蓝方法染色。采用该优化的体系可以同时进行黄瓜叶片、根系和果实总蛋白的双向电泳,并获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。。