近年北京人偏肺病毒基质蛋白、小疏水蛋白和粘附糖蛋白的遗传变异特征分析

为了探讨北京地区儿童中流行的人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)结构蛋白基因特征,本研究着重对hMPV北京地区地方株的基质蛋白(Matrix protein,M)、小疏水蛋白(Small hydrophobic protein,SH)和粘附蛋白(Attachment protein,G)基因进行了基因特征的分析。本研究对2006年至2010年42株hMPV的M蛋白、49株SH蛋白和55株G蛋白基因特征进行了分析,进化分析显示北京地区流行的hMPV的这3个编码蛋白基因分别属于A2、B1和B2基因亚型。地方株M基因高度保守,A和B基因型之间存在7个氨基酸位点的变异(型内高度保守)。不同基因型(A和B)和不同基因亚型(A2和B1、A2和B2)之间的SH基因的氨基酸同源性在60.7%～64.4%之间,而同一基因亚型内的氨基酸同源性则在93.3%～100%之间;同一基因型不同基因亚型之间(B1和B2)的氨基酸同源性在84.7%～88.7%之间。不同年份不同基因亚型G蛋白具有遗传多样性,使用不同的终止密码、核苷酸缺失和插入导致其核苷酸长度不同,变异程度相当高。不同基因型和不同基因亚型之间的G基因的氨基酸同源性在34.0%～38.6%之间,同一基因亚型内的氨基酸同源性在81.5%～100%之间;同一基因型不同基因亚型之间的氨基酸同源性在64.3%～69.2%之间。2008年至2010年的B2基因亚型的毒株大多数在多个位点出现了相同的氨基酸突变,同时出现了2个氨基酸的插入或重复插入,这些毒株在B2基因亚型内形成了一个新的进化簇。抗原位点预测分析显示不同基因亚型的SH和G蛋白的抗原位点均存在差异。     

呼吸道合胞病毒B亚型分离株的G蛋白基因分析

对一株长春地区B亚型分离株(CC169)的G蛋白基因进行了 序列分析,结果表明：我国呼吸道合胞病毒(RSV)分离株CC169同RSV B亚型原型株CH18537的 核苷酸同源性为94%,核苷酸的有义突变率达65%。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为894%,氨基酸的变异全部发生在胞外区,并主要集中在一个高度保守区的两端,胞内区和跨 膜区保守不变。氨基酸的变异导致了分离株既有糖基化位点的改变,又有蛋白长度的变异。 此外还初步探讨了我国RSV B 亚型分离株CC169的G蛋白基因同原型株之间的变异与疫苗研制 中的意义。     

呼吸道合胞病毒北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中。经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率达６５％。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区和跨膜区相对保守。本文探讨了我国北京地区ＲＳＶ分离株的Ｇ蛋白基因同原型株之间的变异,在疫苗研制中的意义。     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因遗传变异特性研究

为了解北京地区人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）的遗传变异和分子流行病学特征,首次对北京地区2003～2004年63株HRSV分离株进行了G基因3’末端的第2个高度变异区的序列测定,并进行了基因分型和遗传变异的分析。使用不同的型特异性引物对GPA—F1和GPB-F1分别扩增A、B血清型HRSVG基因3’末端核苷酸序列,特异性扩增产物和随后的序列测定结果均显示,北京地区2003～2004年63株HRSV毒株中,96．8％（61／63）为A血清型,3．2％（2／63）为B血清型,说明北京地区在2003～2004年间存在HRSVA、B血清型共循环,但以A血清型病毒为主。分别对北京流行的A和B血清型病毒进行了基因亲缘性关系分析,结果提示,61株北京A血清型分离株全部为GA2基因型;2株B血清型分离株为GB3基因型。由此看来,GA2基因型是北京地区2003～2004年的优势流行基因型。北京61株GA2分离株之问核苷酸和氨基酸同源性分别在87．8％～100％和77．9％～100％之间;2株B血清型分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为94．7％和88．1％。这说明在2003年和2004年有很多个不同的GA2基因型HRSV毒株在北京地区共循环,北京地区的HRSV流行存在着许多由不同病毒株引起的传播链。B血清型分离株Beijing04-11于G基因3’末端含有一个60个碱基的重复序列,这是HRSV多聚酶易于重复复制限定序列的一个极端的例子,有可能是HRSV逃逸免疫压力而不断进化的一种方式。该研究首次对北京地区2003年和2004年流行的HRSV进行了基因分型和遗传变异的研究,对于了解北京HRSV流行株的基因特征具有重要意义,可以为北京乃至中国疫苗株的选择提供参考依据,从而指导HRSV的免疫预防控制。     

一株引起严重急性呼吸道感染病例的A亚型人呼吸道合胞病毒全基因组基因特征分析

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)是导致儿童急性呼吸道感染的最重要的呼吸道病毒之一。根据对单克隆抗体的反应,HRSV分为A、B两个亚型。为探讨严重急性呼吸道感染(Severe acute respi-ratory infection,SARI)病例中HRSV全基因组基因特征,本研究对2017年河南省漯河市住院SARI病例中检测到的1株HRSV A亚型病毒通过Sanger测序方法对其全基因组序列进行了测定和分析。通过Sequencher 5.4.5、MEGA 5.05、BioEdit 7.0.5等生物信息学软件进行序列拼接和比对,进行了基因亲缘性关系分析、氨基酸变异和糖基化位点分析。基于HRSV全基因组序列和11个单个蛋白基因序列构建的亲缘性关系分析结果提示本研究中检测到的这株HRSVA病毒(RSVAs/Luohe.Henan/CHN/42.17)属于ON1基因型,该型是我国近年流行的优势基因型。该病毒全基因组序列与35条全球代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别为92.69%～99.82%和93.63%～99.67%;G蛋白编码区氨基酸变异最高,而F蛋白相对保守。糖基化位点分析发现,该病毒的F蛋白有6个N-糖基化位点,未发现O-糖基化位点,此结果与原型株long株相同;G蛋白N-糖基化位点有6个,O-糖基化位点为82个,而原型株long株有11个N-糖基化位点,15个O-糖基化位点。本研究对2017年河南省漯河市SARI病例中一株HRSVA病毒全基因组序列进行了测定,与世界其他地区报道的HRSVA亚型病毒全基因组序列进行了对比分析,揭示了SARI病例中我国HRSV优势流行ON1基因型病毒全基因组的核苷酸和氨基酸变异特征,以及G蛋白和F蛋白编码区糖基化情况,丰富了我国HRSV基因数据库,也为HRSV的核酸检测方法的建立、疫苗研发和预防性单克隆抗体的评价提供了核苷酸和氨基酸的基础数据。     

西藏地区儿童急性呼吸道感染中呼吸道合胞病毒的初步研究

本研究为了解西藏地区儿童急性呼吸道感染中呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)及基因型别。首先采用直接免疫荧光法检测2011年4～7月西藏自治区人民医院儿科病房因急性呼吸道感染住院患儿的鼻咽分泌物标本中7种常见的呼吸道病毒及人类偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)的抗原。然后对RSV抗原阳性的标本分别提取RNA,用逆转录-巢式聚合酶链反应法(Nest-PCR)确定RSV型别,同时用实时荧光PCR(Real-Time PCR)方法进行验证。再通过对G蛋白基因PCR扩增产物序列测定确定RSV的基因型。通过与GenBank中不同地区RSV分离株的G蛋白基因序列比对,了解西藏地区RSV G蛋白的结构特点及变异情况。结果表明,从167例标本中检测出呼吸道病毒抗原阳性的为65例,总阳性率为38.9%(65/167),其中RSV 45例,占阳性标本的69.2%(45/65),对其中42例RSV阳性标本进行了PCR分型,其中40例为A亚型,2例为B亚型。对7株A亚型RSV G蛋白基因PCR产物测序结果显示,全部为GA2基因型。西藏RSV与RSV原型株A2株核苷酸的同源性为90.7%～91.8%,氨基酸的同源性只有86.5%～87.2%。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守序列的两端。7株西藏A亚型RSV G蛋白的核苷酸序列与GenBank中不同的RSV分离株相比同源性为90.7%～91.8%。西藏地区2011年春季小儿急性呼吸道感染的病毒病原主要为呼吸道合胞病毒,A亚型是2011年西藏地区的流行优势型别,其G蛋白胞外区基因具有较高的变异性。     

呼吸道合胞病毒在北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲＴ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中,经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率为６５％,由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％,氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区     

我国分离的盖塔病毒衣壳蛋白基因和3′非翻译区分子特征研究

对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒(GETV)(M1、HB0215-3和HB0234)进行衣壳蛋白基因和3′UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征。首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3′UTR片段,纯化后连接到载体中进行测序,然后用Clastal X和DNASTAR软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA软件绘制系统发生树。3株病毒衣壳蛋白基因分别由801、804和804个核苷酸组成,分别编码267、268和268个氨基酸,3株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性为97.6%~100%和97.8%~100%,与其他GETV分离株核苷酸同源性在95.4%~99.6%之间。3株病毒3′UTR分别由411、401和401个核苷酸组成,发现中国株存在10个(45~54位)核苷酸缺失和2个(64位、148位)特有的核苷酸位点。进化分析表明盖塔病毒之间的进化关系与分离年代相关,中国境内流行的盖塔病毒是相对独立的一个类群。     

急性弛缓性麻痹病例中ECHO11病毒的基因特征分析

该文首次分析了我国ECHO11病毒的分子流行病学资料。1999~2004年,ECHO11病毒是山东省急性弛缓性麻痹(AFP)病例中分离到的优势毒株,2003年从山东省482例AFP病例中共分离到11株ECHO11病毒,其中相关的10例病例分布跨越山东省大部分地区,但发病日期集中在7月和12月。该研究试图通过对VP1编码基因全序列的测定和分析,为探讨ECHO11病毒与AFP之间的病因关系提供线索。分子流行病学研究提示,11株E-CHO11毒株都位于同一传播链,核苷酸同源性为97.2%~100%,氨基酸同源性为99.6%~100%,其中7月和12月的分离株之间相差8~9个核苷酸,氨基酸序列一致。这说明山东省2003年7月和12月分别发生了ECHO11病毒流行,但这些毒株与AFP的病因关系尚需进一步研究。11株病毒组成了A基因型中的一个新亚型,在进化树上单独呈密切相关的一簇,与同基因型内的其它亚型的核苷酸同源性为82.2%~84.7%,氨基酸同源性为94.8%~97.6%。     

云南省登革3型病毒全基因组序列特征研究

为阐明云南省2013年和2016年登革3型病毒(DENV-3)流行株的全基因组分子进化特征及流行病学特点。采用C6/36细胞培养法从登革热患者血清中分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-3的全基因组序列,采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸和氨基酸同源性及系统进化分析。结果从云南省本地登革热患者血清中分离到10株DENV-3,其中西双版纳州2013年5株(简称版纳分离株),德宏州瑞丽市2016年5株(简称瑞丽分离株)。经RT-PCR和序列测定,获得这10株DENV-3的全基因组序列(10 707nt),其开放读码框(95~10 265)编码3 389个氨基酸。基于全基因组或各种结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化分析表明,版纳分离株均为基因II型(genotype-II),瑞丽分离株均为基因I型(genotype-I),并各自高度聚集为同一进化群并与东南亚流行株具有较近亲缘关系。版纳分离株间和瑞丽分离株间的全基因组核苷酸(氨基酸)同源性分别为99.75%~99.91%(99.40%~99.91%)和99.21%~99.68%(98.78%~99.57%),并与DENV-3原型株(H87)的核苷酸(氨基酸)同源性分别为94.21%~94.34%(97.88%~98.14%)和93.81%~93.98%(97.12%~97.67%)。与H87株比较,本次云南分离株结构蛋白和非结构蛋白分别存在26和63个氨基酸位点的改变。本研究证实,云南省西双版纳州2013年流行的DENV-3为基因II型,瑞丽市2016年流行的DENV-3为基因I型,它们的传播来源分别为老挝和缅甸北部边境地区。本次云南DENV-3分离株与H87株间存在明显差异,但决定病毒抗原性和毒力的关键位点未见明显变化。     

Isolation of Toxoplasma gondii from goats from Brazil

Goats are economically important in many countries, and little is known of caprine toxoplasmosis in Brazil. Antibodies to Toxoplasma gondii were assayed in the sera of 143 goats from 3 Brazilian states, using modified agglutination test (MAT titer > or = 1:25); 46 (32.2%) tested positive. Samples of brain, heart, diaphragm, and masseter of seropositive animals were pooled, digested in pepsin, and bioassayed in mice. Viable T. gondii specimens were isolated from tissue homogenates of 12 goats; the isolates were designated TgGtBr1-12. Ten of the 12 isolates killed 100% of infected mice, indicating that goats can harbor mouse-virulent T. gondii and, hence, can serve as a source of infection for humans.     

Guaianolides from two subspecies of Amphoricarpos neumayeri from Montenegro

Quantitative (1)H NMR measurements revealed delta(11(13)) sesquiterpene gamma-lactones as the main constituents ( >or= 1% per weight of dried plant material) in the crude extracts of the aerial parts of Amphoricarpos neumayeri ssp. neumayeri and ssp. murbeckii from mountains Orjen and Visitor (Montenegro), respectively. Preparative silica gel chromatography afforded thirteen guai-11(13)-en-12,6alpha-olides, named amphoricarpolides (1-13), with the same relative (1alphaH,4betaH,5alphaH,7betaH) configuration of the basic skeleton. The common structural feature of lactones 2-13 was 3beta,15-dioxygenation pattern. The only exception was 1 (3-deoxyamphoricarpolide), containing a single oxygen substituent (15-OH). Eight of them exhibited an additional oxygen substituent, 9beta-OH (5 and 6), 2alpha-OH (8-12), or 2alpha-OAc (13). Compound 7 was epoxydated at 10alpha(14)-position, whereas the remaining lactones contained a 10(14) double bond.     

Isolation of protein from humic acid extracted from soil

Summary Chromatography of humic acid in a phenol containing solvent system reveals, in the case of the three types of soil analyzed, the presence of humoprotein containing 11 per cent of nitrogen. Isolation of a humoprotein complex from humic acid, according to the method used by Kirby, followed by paper chromatography allowed the isolation of a protein fraction containing 14.8 per cent nitrogen. This fraction is not dialysable; it has a maximum absorption in ultraviolet light between 260–280 mµ, a small electronegative charge and gives rise to twenty different amino acids. This is the first time that a protein has been separated from humus. Thereby demonstrating that part of the nitrogen contained in humic acid is in the form of protein protected from decomposition.Research supported by the Institut pour l'Encouragement de la Recherche Scientifique dans l'Industrie et l'Agriculture (I.R.S.I.A.).     

Identification of trypanosomes isolated from reduviidae from north Chile

Examination of 54 Triatoma infestans from a village near the European Southern Observatory La Silla in Chile and of 9 Triatoma spinolai from the territory of the observatory showed that 10 T. infestans were infected with trypanosomatids. Mice were infected with in vitro cultures initiated with five different trypanosomatid isolates and treated with the immunosuppressive drug cyclophosphamide to increase the parasitemia of the flagellates. Evidence of the presence of T. cruzi was provided by a comparative biometrical analysis of blood trypomastigotes and the occurrence of intracellular amastigotes. Three methods for further identification were used: examination of kDNA ultrastructure, disc electrophoresis of soluble proteins and the Aaptos papillata II lectin induced agglutination. We obtained the following results for all isolates: (1) presence of a central band of the kDNA; (2) T. cruzi specific double bands of the protein patterns; (3) positive reaction with Aaptos papillata II. No differences between the five isolates from Chile and T. cruzi or T. cruzi-like strains from other countries could be observed. Based on these results an infection of the bugs with T. rangeli and T. conorhini could be excluded.     

Regeneration of peach plants from callus derived from immature embryos

Summary Peach plants were repeatedly regenerated from immature embryos but not from callus derived from mature embryos. A white, nodular, highly regenerative callus was obtained when friable, primary callus from immature embryos was transferred from medium containing 4.5 M 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 0.44 M benzyladenine (BA) to media containing 0.27 M -naphthaleneacetic acid (NAA) and 2.2 M BA. This callus retained its morphogenetic potential for a minimum of three subcultures. Green nodular callus, that lacked regenerative capacity, was produced from primary callus derived from mature embryos. Maximum regeneration of shoots occurred when highly regenerative callus was transferred to a medium in which the NAA concentration was reduced five times and the BA concentration was increased two times. Regenerated shoots were rooted in the dark on a medium containing 28.5 M indoleacetic acid. Cytogenetic analysis of regenerated plants indicated that all plants were diploid, 2n = 2x = 16. Phenotypic evaluation of regenerated plants, grown under field conditions, is now in progress.     

Plant regeneration from protoplasts isolated from cotyledons of Sesbania bispinosa

Protoplasts were isolated from cotyledons of Sesbania bispinosa (Jacq.) W.F. Wight. In a liquid-over-agar culture system with Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 1 mg l^-1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-d, 2 mg l^-1 benzyladenine (BA), 1 mg l^-1 glutamine and 0.5 and formed callus. The first division occurred after 3–4 days. Callus formed from the protoplasts differentiated shoots by organogenesis on MS medium with 1 mg l^-1 indolebutyric acid (IBA) and 1 mg l^-1 BA. These shoots developed into complete plantlets when excised and cultured on MS medium with 0.5 mg l^-1 IBA.