琥珀酸脱氢酶的研究——琥珀酸脱氢酶还原细胞色素c的性质

新鲜制备之水溶性琥珀酸脱氢酶能还原细胞色素c,此还原细胞色素c 之能力与其重组琥珀酸氧化酶系的能力呈平行关系,二者均很快减弱,数小时之内即全部丧失。还原细胞色素c 之能力受金属螯合剂如邻二氮菲,硫茂甲酰基三氟丙酮及组氨酸等试剂的抑制,抗霉素A 对它则无影响。除了能还原细胞色素c 之外,其他如氮蓝四唑、2,6-二氯酚靛酚均可作为受体,并且亦很快失活。泛醌-5不能被还原,以其他受体测活力时,泛醌-5亦无激活作用。经分析,其异咯嗪、非血红素铁以及不稳定硫之比为1∶(8～10)∶10。     

琥珀酸脱氢酶与线粒体内膜的结合——泛醌的影响

猪心肌制剂经含水4%丙酮抽提除去泛醌(Q)及部分脂后,其琥珀酸细胞色素c 还原酶活力丧失,但在反应系统中添加Q 可恢复此活力。去Q 制剂再经碱处理除去琥珀酸脱氢酶后,与新鲜制备的水溶性琥珀酸脱氢酶重组,其重组活力,包括结合的琥珀酸脱氢酶和琥珀酸细胞色素还原酶活力,与正常重组(未去除Q 的)相比,结果相似,指出Q 对琥珀酸脱氢酶与膜的结合无明显的影响,脂环境也不是重要因素。     

琥珀酸脱氢酶与线粒体内膜的结合——泛醌的影响

猪心肌制剂经含水4%丙酮抽提除去泛醌(Q)及部分脂后,其琥珀酸细胞色素c还原酶活力丧失,但在反应系统中添加Q可恢复此活力。去Q制剂再经碱处理除去琥珀酸脱氢酶后,与新鲜制备的水溶性琥珀酸脱氢酶重组,其重组活力,包括结合的琥珀酸脱氢酶和琥珀酸细胞色素还原酶活力,与正常重组(未去除Q的)相比,结果相似,指出Q对琥珀酸脱氢酶与膜的结合无明显的影响,脂环境也不是重要因素。     

琥珀酸脱氢酶与线粒体内膜的结合

1.从正丁醇抽提琥珀酸脱氢酶的pH曲线说明它与内膜结合的pK值为8.7;正丁醇的浓度有一临界值在3℃时约为8%;从抽提的温度曲线说明琥珀酸脱氢酶与内膜通过离子键结合的解离活化热甚低而通过疏水键结合的解离活化热在11℃以上时为26,000卡左右;抽提量与醇碳链长短没有直接关系。2.盐类如氯化钾、氯化钠抑制水溶性琥珀酸脱氢酶与碱处理心肌制剂的重组,醇类及非离子型去污剂则促进重组达130%左右,除了促进重组外,它们还明显地激活重组后的琥珀酸脱氢酶把电子递给细胞色素c的能力。3.硫茂甲酰基三氟丙酮(以下简称TTFA)对心肌制剂琥珀酸-细胞色素c还原酶活力的抑制作用受pH的影响。根据抑制百分数的pH曲线求得的pK值在5～10℃时约为8.5。4.通过以上三方面的实验结果说明琥珀酸脱氢酶主要以离子键与线粒体内膜结合而疏水键則起着辅助的作用。     

两种新呼吸链抑制剂对心肌制剂抑制作用的比较

用抑制剂作为分子工具研究呼吸链的电子传递机制已有相当长的历史,电子传递链各个区段均有酶专一的抑制剂被发现和使用.鉴于呼吸链中三个与泛醌反应相关的酶[还原辅酶Ⅰ:泛醌还原酶(NADH-Q reductase NQR)、琥珀酸:泛醌还原酶(succinate-Q reductase SQR)和泛醌:细胞色素 c 还原酶(QH₂-cytochrome c re-ductase QCR)]均催化同一底物反应,从酶学角度看应存在一类抑制剂能对三个催化泛醌反应的酶兼有抑制作用.经合成和筛选发现3-硝基-N-十二烷基水杨酰胺和2-羟基-3-N-十二烷基酰胺吡啶具备这类性质,它们对催化泛醌反应的三个酶都有抑制作用,而对与泛醌无关的末端氧化酶(cytochrome c oxidase)无任何作用.3-硝 基-N-十二烷基水杨酰胺对检测的心肌制剂各段酶活性的抑制能力均强于2-羟基-3-N-十二烷基酰胺吡啶.     

叠氮水杨酰胺类化合物对呼吸链琥珀酸-细胞色素c还原酶的抑制作用

合成了３－叠氮基－Ｎ－正癸烷基水杨酰胺和５－叠氮基－Ｎ－正癸烷基水杨酰胺并检测了它们对呼吸链酶系从琥珀酸到细胞色素ｃ段电子传递活性的抑制作用．两种化合物对琥珀酸－泛醌还原酶的抑制能力基本相同,而５位叠氮基取代物对泛醌－细胞色素ｃ还原酶的抑制能力较３位叠氮基取代物为强．它们与泛醌反应抑制剂３－硝基－Ｎ－正癸烷基水杨酰胺相比较,其抑制性质基本相似,只是抑制能力较后者为弱     

日本血吸虫琥珀酸氧化酶的研究

应用測压法和分光光度法証明了日本血吸虫含有琥珀酸氧化酶,琥珀酸脫氫酶,琥珀酸-細胞色素c还原酶和細胞色素氧化酶等完整系統。血吸虫的琥珀酸氧化酶活力与細胞色素c浓度有关,浓度增加,酶活力上升,在0.4×10~(-5)—2×10~(-5)M之間与酶活力成直綫关系。酶活力与磷酸盐浓度亦有一定关系,浓度愈低,酶活力愈強。在酶作用的最适条件下(琥珀酸鈉,0.02M;細胞色素c,2×10~(-5)M;磷酸盐緩冲液,0.01M,pH7.4)測定合抱成虫匀浆的酶活力,結果为:氧耗量Qo_2=30.3微升/小时/毫克氮量;琥珀酸耗量Q_S=322微克/小时/毫克氮量;延胡索酸产生量Q_F=157微克/小时/毫克氮量。当雌雄虫分別測定时,在等氮量基础上,雌虫酶活力比雄虫高。丙二酸鈉,二乙基二硫代氨基甲酸鈉(銅試剂)和氰化物都能強烈地抑制琥珀酸氧化酶活力。治疗血吸虫病常用的几种銻剂在2×10~(-3)M时,体外試驗,对此酶活力无明显的抑制作用。此外,氰化物除抑制細胞色素氧化酶外,还能抑制琥珀酸脫氫酶(用甲烯蓝方法測定)。与細胞色素c相似,維生素K_3亦能刺激匀浆的呼吸。此外,我們发現了日本血吸虫匀浆經过加热处理后,可以分离出一种耐热的“还原物貭”,对細胞色素c有化学的还原作用。本文还討論了血吸虫琥珀酸的代謝途径和細胞色素系統在呼吸鏈中可能占有重要地位。     

苯并噻唑醌类化合物对呼吸链酶系的抑制作用

合成了2-氯-5-正十二硫烷基-6-甲基-4,7-苯并噻唑醌(2-Cl-DMMDBT)和2-氯-5-正丁烷氨基-6-甲基-4,7-苯并噻唑醌(2-Cl-BAMDBT)两种化合物,研究了它们对线粒体呼吸链酶系的抑制作用.结果表明:2-Cl-DMMDBT和2-C1-BAMDBT对琥珀酸氧化酶及泛醌氧化酶的电子传递活性均表现一定的抑制作用,而对细胞色素氧化酶无作用,说明二者的抑制作用发生在泛醌反应区.二者对NADH氧化酶的抑制行为略有不同,2-Cl-DMMDBT是一个逐渐加强的过程,最终可致酶活性完全抑制,而2-Cl-BAMDBT则表现为瞬间抑制.比较了2-Cl-DMMDBT和2-Cl-BAMDBT对琥珀酸氧化酶的抑制能力,长侧链的2-Cl-DMMDBT比短侧链的2-Cl-BAMDBT抑制能力强很多.     

脂对泛醌细胞色素c还原酶的影响

用羟基磷灰石柱亲和层析法制备了高纯度的缺脂泛醌细胞色素c还原酶．脂的缺失使该酶活力丢失,部分细胞色素（约52.8％细胞色素b和82.5％细胞色素c₁）呈现还原状态．将缺脂泛醌细胞色素。还原酶与磷脂重组,可恢复其活性,同时那些呈还原状态的细胞色素也恢复到氧化态.此结果表明如此制备的缺脂泛醌细胞色素c还原酶仍保持着活力所必需的构象状态,细胞色素氧化还原状态随脂缺失的变化反映了脂与蛋白的相互作用.     

琥珀酸细胞色素c还原酶系中细胞色素b的多相氧化还原反应

呼吸链中从泛醌到细胞色素c一段一向受到人们的重视。尤其是细胞色素b的动力学行为,虽然文献上报道很多但结果却不一致。早在工929年Keilin就已经观察到细胞色素b的氧化还原速度比细胞色素系统其它组份都慢一些。1952年Chance也观察到这一现象。但他发现在不具氧化磷酸化能力的制剂中细胞色素b的还原速度才比c_1或c慢,而在具有氧化磷酸化能力的制剂中细胞色素b的还原速度并不比c_1慢。于是他认为也许是磷酸化系统受到损害而影响到细胞色素b的还原速度。Chance还发现b的还原在动力学上是快慢两相。后来有一些作者也都报道了b的两相还原现象。     

难肝黄嘌呤脱氢酶的研究

(一)和 Morell 的观察相同鸡肝黄嘌呤脱氢酶能还原辅酶 I,活力和用2,6-二氯酚靛酚作受体相近。次黄嘌呤同样也能作底料。(二)辅酶 I 氧化黄嘌呤的作用是可逆的,鸡肝黄嘌呤脱氢酶能接鉵还原辅酶 I 为尿酸所氧化的作用。(三)辅酶 I 明显地增加鸡肝黄嘌呤氧化酶系和黄嘌呤细胞色素 c 还原酶系的活力。(四)用辅酶 I 及用2,6-二氯酚靛酚作受体的二种黄嘌呤脱氢酶活力受氰化物作用失效的程度相同,两种活力的比例在提纯过程中基本上不变,因此认为二种活力由同一酶所接触。     

细胞色素c与呼吸链多酶系统重组合的进一步研究

用缺c心肌制剂进行实验,在低磷酸浓度下,细胞色素c对琥珀酸氧化酶系及NADH氧化酶系的米氏常数都很小(K_m=0.4μM),比高磷酸浓度时低50倍左右,与测定条件下内源细胞色素c的浓度接近。血清白蛋白,组氨酸及某些金属螯合剂如:乙二胺四乙酸钠、8-羟基喹啉、邻二氮菲以及焦磷酸等均可以提高重组合琥珀酸氧化酶系在低磷酸测定系统中的活力,达到高磷酸浓度下细胞色素c饱和时的水平,但是并不影响细胞色素c与这二个酶系的结合能力。在适当条件下,外源细胞色素c可以重新掺入缺c的心肌制剂,并且重组合的心肌制剂似不再与氰化钾反应。     

琥珀酸脱氢酶的研究——Ⅳ.若干螯合剂对重组合的作用

(一)观察了若干金属螫合剂对于SD与AHMP重组成琥珀酸氧化酶系的影响,发现它们都有明显的抑制作用。(二)粗氨酸与OP能抑制SD与AHMP的结合,而氰化钾不抑制它们的结合,但影响组成的琥珀酸细胞色素c还原酶系的电子传递。(三)从螯合剂对重组合的抑制作用可看出SD的铁在重组合中是有功用的。(四)SD与AHMP结合后,以正铁氰化钾为受体测出的琥珀酸脱氢酶活力较之结合前增加3—5倍。关于这有趣现象的原因曾加以讨论,但肯定的解释尚有待于进一步的研究。     

琥珀酸脱氢酶的研究Ⅰ.分离、提纯及性质

琥珀酸脱氢酶的性质,辅基以及它与细胞色素系统的联系等问题,在近些年来有很多的争论。Bach,Dixon与Zerfas;Ball,Anfinsen与Cooper,以及Pappenheimer与Hendee等人的意见认为琥珀酸脱氢酶等于细胞色素b。本文作者之一在用氰化物使琥珀酸脱氢酶失效作用的试验中说明它与细胞色素b并不相同。Chance用完全不同的实验方法也得到了同样的结论。Axelrod,Potter与Elvehjem用缺乏核黄素     

磷脂对琥珀酸-细胞色素c还原酶的作用

琥珀酸细胞色素c还原酶除去90％以上的磷脂后活力丧失约95％。将去脂琥珀酸细胞色素c还原酶与磷脂和辅酶Q_2保温,可恢复其活性。活力恢复程度依赖于磷脂的组成。当磷脂酰胆碱(PC):心磷脂(CL):磷脂酰乙醇胺(PE)=2:2:1时活力恢复最高,比大豆磷脂的效果更为明显,单组分PC,PE或CL恢复活力较差。与酶蛋白紧密结合的CL和PC在活力可逆恢复中有重要作用。     

3-硝基-N-甲基水杨酰胺对琥珀酸细胞色素c还原酶的抑制作用

 我们发现3-硝基-N-甲基水杨酰胺对猪心线粒体呼吸链的琥珀酸细胞色素c还原酶活力有抑制作用。抑制部位在呼吸链中PMS和DCPIP的电子给体之间。抑制性质表现为可逆非竞争性。     

血红素对一些黄酶的抑制作用

血红素对一些黄酶都具有强烈的抑制作用,并且血红素过老化以后对一些黄酶活力的抑制程度因受体不同而有显著差别。在相同的抑制剂浓度下,心肌制剂琥珀酸及NADH氧化酶系中以氧气、细胞色素c和PMS为受体时的活力没有影响,但对以正铁氰化钾、DGPIP和细胞色素b为受体时的活力则有明显抑制。对水溶性琥珀酸脱氢酶、黄递酶和NADH-细胞色素c还原酶以不同受体进行反应时的抑制情况也与上述结果相似,说明抑制作用点直接与琥珀酸脱氢酶及NADH脱氢酶有关。老化血红素对黄嘌呤氧化酶的抑制作用不同,它不影响DCPIP为受体时的活力而却抑制细胞色素c的还原。老化血红素对胆硷氧化酶系及α-甘油磷酸氧化酶系的抑制行为与NADH及琥珀酸氧化酶系相似,看来胆硷和α-甘油磷酸脱氢酶可能也都是黄酶。老化血红素对以上黄酶的抑制都是可逆的,并且从检查6个酶系的结果知道这些抑制皆属竞争性类型。     

輔酶細胞色素還原酶系的研究——Ⅰ.還原輔酶Ⅰ与琥珀酸的同時氧化

(一)本報告提供了一個從輔酶Ⅰ,用酶還原法製備還原輔酶Ⅰ的方法。我們所製得的還原輔酶Ⅰ鈉鹽乾粉,可以在低温保存數月而不被氧化。 (二)與心肌製劑中顆粒相結合的輔酶Ⅰ細胞色素還原酶系,和用乙醇抽出的水溶性的輔酶Ⅰ細胞色素還原酶的性質頗不相同。其中比較重要的不同點是對於細胞色素c的親力,前者遠大於後者,其米氏常數僅約為後者的十二分之一。 (三)用一心肌顆粒製劑作為材料,無論用氧或過量之細胞色素c作為氫受體,還原輔酶Ⅰ與琥珀酸同時氧化時的總速度,不等於二者分別氧化時速度之和,而僅等於其中氧化較快者單獨氧化時之速度。但如用[2,6]二氯靛酚作為氫受體時,二者共同氧化時之總速度完全等於二者分別氧化時速度的和。 (四)當用氧或過量之細胞色素c作為氫受體時,琥珀酸與還原輔酶Ⅰ能彼此互相抑制對方氧化的速度。有足夠的實驗材料說明,還原輔酶Ⅰ對於琥珀酸氧化的抑制,不是由於草醯乙酸聚集的緣故。 (五)如果在反應混合物中同時含有琥珀酸脫氫酶的專一抑制劑,丙二酸,則琥珀酸對於還原輔酶Ⅰ氧化作用的抑制即被解除。 (六)根據以上的實驗結果,可以認為,還原輔酶Ⅰ及琥珀酸先通過一個共同的因子與細胞色素c作用。這個共同的因子在一般情形之下,也是這兩個酶系統的速度限制因子。應該指出在我們的實驗中,並未使用任何可能影響酶系統結構的條件,因此我們的結果是在一個比較接近於生理狀態的情形之下獲得的。 (七)應該着重指出,從本報告的結果可以看到,一個用人為的方法從複雜酶系上溶解下來的酶的性質,有時並不能代表這個酶在有組織的酶系統中的真實情况。 (八)我們相信,本報告所說明的兩酶系競爭一個共同因子的一些現象,將为研究複雜酶系之間的相互關係,提供一個新的方法。     

[α]甘油磷酸氧化酶系的組成部份

(一) 在經徹底冲洗的兔骨骼肌製劑中,[L-α]甘油磷酸和琥珀酸的氧化彼此干涉。琥珀酸對[L-α]甘油磷酸氧化的抑制作用能因加入抑制琥珀酸脫氫酶的焦磷酸而解除。 (二) 當用細胞色素c作受體時[L-α]甘油磷酸,還原輔酶I和琥珀酸三者同時氧化時總氧化速度僅相當其中氧化速度最高者即還原輔酶I單獨氧化的速度。[L-α]甘油磷酸氧化酶系也因[2,3]二氫硫基丙醇的處理而失效。 (三) 當用[2,6]二氯酚靛酚作受體時[L-α]甘油磷酸和琥珀酸同時氧化時速度完全等於二底料單獨氧化時速度的和。[L-α]甘油磷酸的氧化不受苯代氨甲酸乙酯的影響。 (四) 本文結果說明[L-α]甘油磷酸的氧化不通過細胞色素b而通過中間因子和細胞色素c連接。     

鼻硬结克雷白氏杆菌细胞色素b-563的研究——Ⅱ.细胞色素b-563的物理、化学性质和生物活力

用正铁氰化钾-亚铁氰化钾系统,测得在pH7.0,30℃时鼻硬结克雷白氏杆菌(Klebsiella rhinoscleromatis)细胞色素b-563的氧化还原电位为+0.127伏。纯化的细胞色素b-563含铁置为0.28%,依此计算得最低分子量为20000。还原型α、β及Soret带吸收峰的毫克分子消光系数分别为35.2、20.1和197.5mM~(-1)厘米~(-1)。细胞色素b-563能自身氧化,一氧化碳和氰化钾对细胞色素b-563的吸收光谱没有影响。细胞色素b-563在鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂存在下,能被还原辅酶Ⅰ.乳酸、甲酸及琥珀酸还原,相对还原速度依次为1.6、1.5、1.24和1.0,说明纯化细胞色素b-563具有一定的生物活力。细胞色素b-563可用盐酸-丙酮方法将辅基分离。经光谱、纸层析及重组合等试验,证明辅基为氯正铁血红素。细胞色素b-563可以酶蛋白及氯正铁血红素重组合,重组合细胞色素b-563在光谱上和原细胞色素完全相同。酶蛋白和氯正铁血红素之重组合不受对氯汞苯甲酸的抑制,说明两者可能不是通过巯基相联。重组合的细胞色素b-563仍能为鼻硬结克雷白氏杆菌颗粒酶制剂及乳酸在厌气下还原,说明仍具部分生物活力。