兔肌羧甲基甘油醛-3-磷酸脱氢酶的电子显微镜观察及其光学分析处理

本文首次报道用电子显微术观察兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)晶体及游离酶分子的结果,并进行了光学衍射分析和光学滤波处理。根据光学衍射图决定的二维投影晶胞参数为69.4A×67.6A(72°)。在电子显微镜下可以直接见到酶分子由四个亚基组成,这与生化分析及X射线衍射分析结果相一致。     

零模波导原理、制备及其在单分子荧光检测中的应用

单分子荧光检测作为一种能够表征分子个体性质及行为的分析方法,有助于揭示利用传统荧光检测方法无法得到的信息,在近年来受到人们的广泛关注。利用传统光学检测设备进行单分子荧光检测时,由于受到衍射极限的限制,同时为了保证在观测体积内只有单个荧光分子,仅能采用无限稀释溶液的方法实现单分子荧光检测。虽然这种方法可以满足单分子检测的要求,但是由于大部分酶分子正常工作时底物的生理浓度都非常高,底物浓度的大幅度降低会对酶分子的反应机制等方面造成影响。零模波导作为一种新型的单分子检测器件,通过纳米微孔结构突破了光学衍射极限的限制将观测体积降至仄升量级（10-21L）,使得在生理浓度范围内检测单分子荧光成为可能,在单分子荧光检测领域得到了广泛应用。因此,就零模波导的原理、制备工艺及其在单分子DNA测序、生物膜、生物大分子之间的相互作用及单分子反应动力学方面的具体应用进行综述。     

用定位突变方法对兔肌肉糖原磷酸化酶活性调控的研究

糖原磷酸化酶的活性可以通过酶分子中Ｓｅｒ１４的磷化及去磷酸化进行调控。Ｘ－射线衍射结构的结果已经推测在兔肌肉糖原磷酸化酶分子中Ａｒｇ６９对该酶磷酸化构型的发迹至关重要。定位突变这氨基酸残基,得到突变体Ａｒｇ６９→Ｇｌｕ,酶动力学分析显示磷酸化酶的活性,突变型酶比野生型酶大大降低,这与Ｘ－射线衍射结构的推测完全一致,也说明了Ａｒｇ６９在糖原磷酸化酶别构开关的分子构型上的重要作用。     

P.versicolor龙虾D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶的X射线晶体学研究——分子置换法结构测定

由P.versicolor龙虾尾肌提取的HOIO-D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),已长出可供Χ射线衍射用的晶体。初步Χ射线晶体学研究确定:此酶晶体属於C2空间群,不对称单位内含有半个分子,分子坐落在二重轴上。以Homarus Amercanus龙虾GAPDH结构为模型结构,应用分子置换技术进行了低分辨率Χ射线结构分析,结果表明:分子内亚基排列具有222对称性,分子Q轴平行于晶体学二重轴b,分子P和R轴分别平行于晶体学a和c轴。按分子置换法推出的结构模型算得5A分辨率的晶体学R因子为0.46。并获得了一套5A。分辨率的电子密度图。此酶的几种同晶型晶体,特别是荧光NAD衍生物晶体的较高分辨率的结构分析工作正在进行中。     

利用6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在低温条件下获得酶-底物复合物实际结构的方法

利用“酶晶体低温抑活底物固定”方法,在?20 ℃条件下,将6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (BglA) 晶体与底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸 (pNPβG6P) 进行浸泡试验,通过X射线进行衍射数据收集并处理,获得了完整的底物电子密度图。研究结果表明,在不突变酶中关键基团使酶失活,以及不选用底物类似物替代原有底物的情况下,通过上述方法,可以获得酶与底物复合物的实际结构。该研究结果可为今后低温酶学及复合物中间态的进一步研究提供帮助。     

芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子机制研究

[目的]分析芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型,并探讨其抑制的分子作用机制。[方法]采用Lineweaver-Burk双倒数方程,分析芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型;荧光光谱和分子对接阐述芹菜素抑制α-葡萄糖苷酶的分子作用机制。[结果]芹菜素对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争型抑制,抑制常数Ki=12.08μg/m L。芹菜素和α-葡萄糖苷酶的结合导致酶分子的内在荧光静态猝灭,不同温度(298 K、304 K、310 K)条件下荧光猝灭常数KA分别为0.859 4×104、0.617 7×104、0.486 5×104L/mol。酶分子中Tyr158、Ser240、Pro312、Phe314和Asn415等氨基酸残基为芹菜素与其结合的重要活性位点,芹菜素的A环5-OH和7-OH、B环4'-OH结构对其抑制活性起到关键作用。[结论]芹菜素是α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制剂,疏水作用力和氢键是其与酶分子间的主要作用力。     

Sortase A介导的(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体高效立体选择性转化(S)-苯基乙二醇

【目的】以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的sortase A为"分子订书机",用于(S)-羰基还原酶Ⅱ分子之间的连接,获得催化功能与稳定性增强的氧化还原酶寡聚体,高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯基乙二醇。【方法】从S.aureus基因组中克隆sortase A基因,在大肠杆菌中表达,通过镍柱和凝胶层析纯化重组酶,获得纯酶sortase A。通过基因工程手段在(S)-羰基还原酶Ⅱ的C末端添加GGGGSLPETGG序列,蛋白纯化获得(S)-羰基还原酶Ⅱ-GGGGSLPETGG,摸索了sortase A催化(S)-羰基还原酶Ⅱ-GGGGSLPETGG的分子连接,形成(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体的最佳条件,并研究了寡聚体酶学性质及生物转化(S)-苯基乙二醇的效率。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体比酶活力为38.5 U/mg,比原始型(S)-羰基还原酶Ⅱ提高了6倍,最适反应温度为50°C,最适pH为6.0,在50°C放置1 h后酶活仍旧保持90%以上;蛋白质变性实验结果显示,(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体的变性温度为60.1°C,比原始酶提高了10°C;生物转化结果显示(S)-羰基还原酶Ⅱ寡聚体在3 h内完全转化5 g/L 2-羟基苯乙酮,产生光学纯度为100%的(S)-苯基乙二醇,相比于重组大肠杆菌(S)-羰基还原酶Ⅱ全细胞催化时间缩短了16倍。【结论】本研究首次将sortase A应用于氧化还原酶的分子连接,显著提高了酶的催化效率和热稳定性,表明sortase在手性催化中有很大的潜在应用价值。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

龙虾肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶及其衍生物与NAD~+的结合

平衡柱层析法测得每分子龙虾肌羧甲基化甘油醛-3磷酸脱氢酶能结合3.9分子NAD~+,而每分子光照酶则只能结合2分子NAD~+。 由蛋白荧光淬灭法得到,在25℃、pH7.0的磷酸盐缓冲液中,全酶、羧甲基酶及光照酶与NAD~+结合时均呈负协同性。     

采用随机突变方法对β-琼胶酶YM01-3活性位点的研究

【背景】琼胶酶是一种多糖水解酶,在保健食品、医药、科研及化妆品等行业极具价值。本实验室发现来源自嗜琼胶卵链菌(Catenovulumagarivorans)的β-琼胶酶YM01-3具有较高的酶活性,在最适条件下的比酶活可达到1.14×10~4U/mg。【目的】探讨不同位点的突变对β-琼胶酶YM01-3酶活力的作用,发现影响其酶活力的新位点。【方法】通过易错PCR在短芽孢杆菌(Bacillus brevis)表达系统中构建随机突变文库,从约10 000个克隆中筛选出227株有效突变体,从中选取80株进行测序。【结果】对突变体序列进行分析和定点突变验证发现,137位和237位氨基酸发生突变后酶活力丧失90%以上。【结论】位于催化腔内的137位和237位氨基酸,对于维持β-琼胶酶YM01-3酶活力具有重要作用。该研究结果为β-琼胶酶的催化机理研究及分子改造提供了借鉴。     

恒河猴DNA类α-顺序的某些趋异现象

本文应用限制性内切酶酶切及分子杂交等方法对恒河猴的类α-顺序及其重组片段进行了分析,证实了在此类α-顺序的RM(Bam H1)-1片段中,在某些区域上碱基顺序已出现趋异的变化,即片段中HindⅢ酶切点的分布有四种不同的情况,形成了四个亚家族,而我们的分子克隆pMB1中的类α-顺序片段是属于其中的第一种亚家族。     

(R)-、(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位

【目的】将增强型荧光蛋白标记的(R)-和(S)-羰基还原酶于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)细胞中表达,分析荧光蛋白表达谱,确定两种酶在细胞中的功能分布和亚细胞定位。【方法】采用SOE-PCR法克隆出增强型荧光蛋白与(R)-和(S)-羰基还原酶的融合基因,构建到真核表达载体pYX212中,电击转化酵母细胞,以荧光蛋白为筛选标志,观察两种酶在酵母细胞中的表达和分布。【结果】激光扫描共聚焦显微观察表明(R)-和(S)-羰基还原酶多定位于细胞内膜和细胞质中稳定表达,少数成点状分布于细胞中央。根据荧光强度可知(S)-羰基还原酶的表达水平明显高于(R)-羰基还原酶。生物转化结果显示融合型(R)-和(S)-羰基还原酶催化底物2-羟基苯乙酮,分别获得(R)-和(S)-苯基乙二醇,前者产物的光学纯度和产率为86.6%和70.4%,后者产物的光学纯度和产率分别为92.3%和81.8%。【讨论】荧光蛋白与酶的融合没有改变靶蛋白的分子构象与生物活性,酿酒酵母工程菌较重组大肠杆菌具有更明显的生物功能优势,该研究为羰基还原酶蛋白的功能表达调控与亚细胞定位的可视化研究奠定了坚实的基础。     

细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶催化活性优化方法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一类专一降解β-葡聚糖的内切水解酶。高效β-葡聚糖酶在啤酒酿造工业上具有十分重要的应用价值。目前,研究较多的β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要来源于细菌。文中概述了细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分子生物学性质,并且从蛋白分子改造、表达调控和发酵条件优化三方面阐述了其催化活性提高的方法和成果。     

细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶分子改造和表达策略

β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为一种饲料和食品添加剂有着广泛用途。迄今在杆菌、梭菌、瘤胃细菌、真菌、高等植物中都发现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶。综述了细菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质、结构、分子改造与表达研究进展。     

甘油歧化为1,3-丙二醇的代谢及关键酶研究进展

微生物发酵生产1,3-丙二醇因对环境友好而成为研究热点。通过对发酵菌种、代谢途径、调节子和关键酶的分析,阐述了微生物转化甘油为1,3-丙二醇的分子机理。尤其对还原途径的限速酶-甘油脱水酶的分子结构及再激活因子进行了详细分析,为菌种的遗传改造提供了理论依据。     

甘油歧化为1,3-丙二醇的代谢及关键酶研究进展

微生物发酵生产1,3-丙二醇因对环境友好而成为研究热点。通过对发酵菌种、代谢途径、调节子和关键酶的分析,阐述了微生物转化甘油为1,3-丙二醇的分子机理。尤其对还原途径的限速酶-甘油脱水酶的分子结构及再激活因子进行了详细分析,为菌种的遗传改造提供了理论依据。     

高选择性不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺的重组氧化还原酶催化性质及其酶促转化

【目的】通过表达多种重组立体选择性氧化还原酶,分析其催化不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的性质,从而构建酶促合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)的反应体系。【方法】基于已有立体选择性氧化还原酶重组大肠杆菌,通过Ni离子亲和层析法纯化得到重组氧化还原酶,以DKTP为底物,考察不同重组氧化还原酶对DKTP的催化活性和选择性,进一步对高选择性酶促合成(S)-DHTP的重组酶CR2进行性质分析,并考察其在最适条件下不对称还原DKTP的过程。【结果】筛选获得产物构型为(S)-型的催化活性最高的酶为CR2,该酶米氏常数Km为0.135 mmol/L,kcat/Km为3.689 L/(mmol·s),最适p H 8.4(0.1 mol/L三乙醇胺缓冲液),最适反应温度为35°C,在10-45°C条件下和p H 7.5-8.5较为稳定,Zn2+离子对酶活有促进作用。CR2催化DKTP不对称还原反应6 h后,DHTP的产率达92.1%、光学纯度达99.9%。【结论】基于活性和选择性分析,获得不对称还原DKTP的目标酶CR2,其催化特性有利于高立体选择性还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,从而为进一步提高酶促不对称还原DKTP的转化效率提供研究基础。     

独脚金内酯信号感知揭示配体-受体作用新机制

植物激素在调控细胞与细胞及细胞与环境的相互作用中起着至关重要的作用。作为一种信号分子, 植物激素如何被植物细胞感知一直是植物生物学研究的热点。与底物-酶相互作用的结果不同, 激素分子与受体结合后会触发信号转导, 但激素分子一般不会被受体修饰, 信号转导起始后激素分子通常会从复合体中释放出来被重新利用或降解。近期, 我国科学家通过对独脚金内酯及其受体复合体(AtD14-D3-ASK1)的结构学解析, 发现独脚金内酯的生物活性分子CLIM (covalently linked intermediate molecule)是独脚金内酯被其受体水解后得到的中间分子。研究表明, CLIM与受体AtD14的催化中心以共价键相结合, 进而激活其信号转导。该研究揭示了一种全新的“底物-酶-活性分子-受体”激素识别机制。这种配体-受体作用新机制的发现为植物激素研究开拓了新的视野。     

人类食管癌γ-谷氨酰转肽酶性质的研究

 从人类食管癌组织、正常食管粘膜、以及正常肾脏组织部分提纯γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT),分析比较其生物化学及免疫化学性质,结果如下:(1)人类正常食管粘膜癌变后,γ-GT活性升高。(2)食管癌γ-GT的酶动力学性质(Km及最适pH)与正常组织相同。(3)4—20％线性梯度PAGE分析,食管癌γ-GT呈现100kD左右及380kD左右两个分子群,前者活性较高。正常食管粘膜γ-GT中,缺少100kD左右分子群,此分子群可能在癌变中有重要意义。(4)食管癌组织γ-GT,与正常组织γ-GT的抗原性相同。(5)食管癌γ-GT富含D-甘露糖、D-葡萄糖及N-乙酰-氨基葡萄糖,分子中的糖结构高度不均一,其与100kD左右分子群的关系,值得深入研究。