有机磷水解酶及其在传感器应用中的研究进展

有机磷农药的大规模使用对环境造成了严重污染, 同时由于其残留严重威胁着人类健康。有机磷水解酶是一种广泛存在于生物体内的可以催化各种有机磷化合物水解的酶。利用有机磷水解酶制成的生物传感器能够有效检测有机磷农药的残留。文章分别从有机磷水解酶的结构、重组表达以及在生物传感器应用等方面进行了综述, 旨在为有机磷农药的检测和降解提供参考。     

一种纯化细菌有机磷水解酶的简便方法

Cibacron blue T_3GA与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联后,产生一种能有效地分离有机磷水解酶的吸附剂。用0.15mol/L MgCl_2溶液从黄杆菌P3—2细胞抽提出的粗酶液通过柱层析分离,即可得到纯化8倍、酶活性回收率为269.4％的纯酶制品。该酶制品用凝胶电泳测是均一的。     

纳米水解酶的研究进展

水解酶由至少200种单独的蛋白质组成,可催化一系列独特化学键的水解.但是天然酶的固有缺点,如易变性、成本高、制备费力和回收困难,极大地限制了它们的实际应用.为了克服这些缺点,研究人员长期以来致力于探索人工水解酶模拟物.自从2007年发现Fe₃O₄纳米颗粒可以作为过氧化物酶模拟物,关于纳米酶的研究不断涌现.与天然酶相比,纳米酶具有制备简单、可大规模生产、环境耐受性强、制备及储存成本低廉、可重复使用等优势.纳米水解酶是指具有水解酶活性的纳米材料,金属有机框架材料、碳基纳米材料和金纳米粒子等的水解酶活性均已被报道.近年来,纳米水解酶研究领域进入蓬勃发展期,然而至今尚未见关于纳米水解酶的综述.本文首先根据水解底物的不同对纳米水解酶进行分类并分别讨论其催化机理,之后对影响纳米水解酶活性的因素及纳米水解酶的应用进行总结,最后概述和讨论纳米水解酶的当前挑战和未来前景.     

有机磷水解酶的挖掘、改造及应用

有机磷化合物是一类广泛用作杀虫剂、增塑剂、阻燃剂的有毒化学品,由于难以降解而在农产品、水体和土壤中逐渐累积,容易引发严重的食品安全和环境污染问题。有机磷的酶促降解具有反应速度高和绿色环保等优点,是当前的研究热点。本文综述了近年来在有机磷水解酶的挖掘、改造及应用方面的研究进展,提出了进一步发展所面临的挑战和未来的研究方向,旨在为有机磷化合物的生物降解研究提供参考。     

甲基对硫磷水解酶基因的高效表达及酶活性分析

假单胞菌WBC 3的甲基对硫磷水解酶基因mph在大肠杆菌系统AD494(DE3) pET32a ( + )中实现了高效可溶性融合表达。表达的重组酶能够有效地被亲合层析纯化。酶学性质分析表明 ,重组酶对底物乙基对硫磷水解能力较野生酶相比有近 4倍的提高 ,对甲基对硫磷和杀螟松的水解活力无明显变化。以融合蛋白形式存在的重组酶在室温及 4℃下的贮存稳定性明显优于野生型酶。     

有机磷水解酶的表面显示技术研究进展

有机磷化合物在农业中的广泛应用,给农作物带来增产的同时对环境造成污染,严重威胁着人类的健康,其生物解毒已受到高度重视.有机磷水解酶(OPH)是目前处理有机磷化合物最有效的水解酶类,而通过基因工程手段获得高表达、高降解效率的OPH,尤其是OPH的表面显示技术是近年来的研究热点.主要综述了大肠杆菌、假单胞菌、酿酒酵母的OPH表面显示技术研究及应用进展和发展趋势.     

一种pH和热稳定的联苯水解酶的纯化及其特征

【目的】通过联苯水解酶的表达,纯化,化学修饰以及酶学性质研究,以期了解水解酶的结构和功能,为其定向改造,获得高效的和能够拓宽底物范围的新突变酶奠定基础。【方法】将水解酶基因在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中进行异源表达,表达产物经离子交换层析以及凝胶层析后进行酶学特性研究,同时通过圆二色谱法对该酶二级结构与热稳定性之间的关系进行分析。【结果】经Q Sepharose和Sephacryl S-300两步纯化获得了电泳纯的联苯水解酶(biphenyl hydrolase,BphD),SDS-PAGE鉴定其单体为31 kDa,Sepharose 12凝胶柱层析分析其为四聚体。该酶最适反应温度和最适pH分别为80℃和9,在pH4-11的缓冲液中酶活相对稳定。该酶在60℃温浴1 h,酶活剩余90%,而在70℃温浴时,半衰期为1 h,是迄今为止在红球菌中报道的唯一一例热稳定性高的水解酶。圆二色谱显示该酶以α-helix占主导地位,当温度升高到70℃时,其二级结构发生了明显的变化,75℃和80℃时BphD的结构已经遭到严重的破坏。序列比对表明:Ser,His,Asp以及Trp残基在几种同源水解酶中相对保守。化学修饰表明Ser,His,Asp在R04水解酶催化底物水解过程中担任重要角色,Trp残基可能位于酶的活性中心,并作为关键氨基酸参与底物的水解过程。【结论】获得了电泳纯的BphD,其pH稳定性以及耐高温特性在同源水解酶中较为罕见,色氨酸关键氨基酸的地位也为进一步了解该酶转化底物的机制奠定了一定的基础。     

糖基化对蛋白质稳定性的影响研究进展

蛋白质的糖基化修饰是广泛存在于真核细胞中的蛋白修饰形式之一,在决定蛋白质的多种生物学功能并且能保护蛋白质免受热力学降解方面发挥重要作用。蛋白质的糖基化修饰包括N-糖基化和O-糖基化,本文简要介绍体内糖基化的过程,并结合近几年文献就糖基化对蛋白质稳定性的影响做一综述。     

聚乙二醇修饰对酶活性和稳定性的影响

经氰尿酰氯和对硝基苯碳酸酯活化过的甲氧基聚乙二醇分别用来对枯草杆菌蛋白酶进行化学修饰．修饰后的酶在水溶液和有机溶剂中均保持活性．酶在水溶液里的k_cat增加,K_m不变.酶对温度和pH的稳定性都显著升高,但最佳反应温度不变．     

纳米抗体的稳定性及其结构基础研究进展

驼类纳米抗体结构简单、易于改造,且具有低免疫原性、高稳定性、高特异性、高亲和力等特点,因而具有广泛的应用前景。纳米抗体的优势之一在于其具有较高的稳定性,比常规抗体更易于储藏和运输,甚至在高温、化学和压力等极端条件下变性后仍可有效地重折叠并恢复其抗原亲和力。本文综述了纳米抗体稳定性与其结构基础方面的研究进展,阐述了纳米抗体氨基酸序列、二硫键、结构域等与其稳定性的关系,揭示了高度稳定性的纳米抗体普遍具有的结构特征。基于这些结构特征,讨论了几种纳米抗体的稳定性优化策略,包括共有序列驱动的序列修复、替换易于修饰的氨基酸、净蛋白质电荷的改变、非天然二硫键的引入以及CDR超变区的移植。预期对纳米抗体的稳定性调控提供理论指导,以拓展其作为治疗药物、诊断试剂和生物传感器等方面的应用。     

Metabolic engineering of Pseudomonas putida for the utilization of parathion as a carbon and energy source

Pseudomonas putida KT2442 was engineered to use the organophosphate pesticide parathion, a compound similar to other organophosphate pesticides and chemical warfare agents, as a source of carbon and energy. The initial step in the engineered degradation pathway was parathion hydrolysis by organophosphate hydrolase (OPH) to p-nitrophenol (PNP) and diethyl thiophosphate, compounds that cannot be metabolized by P. putida KT2442. The gene encoding the native OPH (opd), with and without the secretory leader sequence, was cloned into broad-host-range plasmids under the control of tac and taclac promoters. Expression of opd from the tac promoter resulted in high OPH activity, whereas expression from the taclac promoter resulted in low activity. A plasmid-harboring operons encoding enzymes for p-nitrophenol transformation to beta-ketoadipate was transformed into P. putida allowing the organism to use 0.5 mM PNP as a carbon and energy source. Transformation of P. putida with the plasmids harboring opd and the PNP operons allowed the organism to utilize 0.8 mM parathion as a source of carbon and energy. Degradation studies showed that parathion formed a separate dense, non-aqueous phase liquid phase but was still bioavailable.     

脱氧核糖核酸对机体内超氧化物岐化酶和过氧化物酶活性影响初步研究

超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）是机体内重要的抗氧化酶系之一,其作用在于消除体内的自由基,防止自由基对细胞结构的损伤。它们的活性随增龄而下降,因此自由基不断损伤细胞结构,累积最终导致细胞衰亡和动物机体衰老,老龄小鼠服用DNA一段时间后,其体内SOD和POD的活性均显著提高,因而其衰老速度可能得到一定程度的延缓。     

反应介质对脂肪酶稳定性的影响

脂肪酶Ｌｉｐｏｚｙｍｅ~（ＩＭ）在有机溶剂中的热稳定性显著提高。在水溶液中,热处理温度高于５０℃后,其催化甘油三酯水解的活力迅速下降。温度升到６０℃时,水解活力仅残存１３．６％。温度高于７０℃该酶完全失活。而在有机溶剂正庚烷中,温度高达８５℃仍表现出较高的活性。反应介质的疏水性越强,酶抗超声辐射变性作用的能力越强。经同样的超声辐射处理后,正己烷中Ｌｉｐｏｚｙｍｅ~（ＩＭ）的酯水解活力仅损失ｌｌ．８％,而在水溶液中其活力却损失了９５．９％。     

土壤渍涝对芝麻根系生长及抗氧化物酶活性的影响

在渍水条件下芝麻根系生长速度下降,干物质积累减少,根系的抗氧化物酶--超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性先增后下降,POD活性下降较缓慢,超氧自由由基(O·-2)产生速率和丙二醛(MDA)含量随淹水时间的延长而升高.     

Activity and Stability of Native and Modified Subtilisins in Various Media

The activity and stability of native subtilisin 72, its complex with poly(acrylic acid), and subtilisin covalently attached to poly(vinyl alcohol) cryogel were studied in aqueous and organic media by hydrolysis of specific chromogenic peptide substrates. Kinetic parameters of the hydrolysis of Glp-Ala-Ala-Leu-pNA by native subtilisin and its complex with poly(acrylic acid) were determined. Based on the comparative study of stability of native and modified subtilisins in media of various compositions, it was established that covalent immobilization of subtilisin on poly(vinyl alcohol) cryogel is the most effective approach to improve enzyme stability in water as well as in mixtures with low water content.     

The Low Affinity Dopamine Binding Site on Tyrosine Hydroxylase: The Role of the N-Terminus and In Situ Regulation of Enzyme Activity

Tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme in catecholamine biosynthesis, is inhibited in vitro by catecholamines binding to two distinct sites on the enzyme. The N-terminal regulatory domain of TH contributes to dopamine binding to the high affinity site of the enzyme. We prepared an N-terminal deletion mutant of TH to examine the role of the N-terminal domain in dopamine binding to the low affinity site. Deletion of the N-terminus of TH removes the high affinity dopamine binding site, but does not affect dopamine binding to the low affinity site. The role of the low affinity site in situ was examined by incubating PC12 cells with L-DOPA to increase the cytosolic catecholamine concentration. This resulted in an inhibition of TH activity in situ under both basal conditions and conditions that promoted the phosphorylation of Ser40. Therefore the low affinity site is active in situ regardless of the phosphorylation status of Ser40.     

A Screening Method Tuned for mRNA Processing Factors in Human Cells by Evaluation of the Luciferase Reporter Activity and the Subcellular Distribution of Bulk Poly(A)+ RNA

Screening of mRNA export factors in Saccharomyces cerevisiae and Drosophila melanogaster has identified a number of mRNA processing factors involved in multiple mRNA processing steps. However, only limited information is available on human cells. Here we established a screening system searching for mRNA processing factors in human cells by combining the luciferase reporter system and fluorescence in situ hybridization, which evaluates the nuclear/cytoplasmic distribution of bulk poly(A)⁺ RNA. This system makes it possible to search for the compounds affecting mRNA processing from the various resources.