串联亲和纯化标签分类与优化

质谱技术高速发展,检测灵敏度不断提高,但区分特异性与非特异性相互作用仍然是研究相互作用蛋白的瓶颈,获得高纯度的蛋白复合体是鉴定相互作用蛋白的限制性因素。近年来串联亲和纯化（TAP）技术的产生和发展有效解决了相互作用蛋白鉴定中的特异性问题。TAP技术是将N端或C端TAP标签与目的蛋白融合并导入靶细胞进行表达,裂解细胞释放融合蛋白,在接近生理状态下利用标签两步特异性亲和洗脱得到蛋白复合体。其中,TAP标签蛋白的选择和优化是该技术成功的关键。     

用亲和纯化方法筛选与gankyrin相互作用的蛋白质

目的：作为一个新发现的癌蛋白,gankyrin在肝癌细胞的发生和形成中发挥重要作用。筛选与gankyrin相互作用的蛋白质,从而进一步探讨gankyrin的作用机制。方法：采用亲和纯化技术及质谱鉴定筛选与gankyrin相互作用的蛋白质。结果：初步筛选出了6个与gankyrin发生相互作用的蛋白质,经与MSDB或NCBInr数据库比对,这6个蛋白质均是26S蛋白酶体的组成部分,其中proteasome（prosome,macropain）26S subunit,ATPase,4为已报道的蛋白质,证实结果的可靠性。结论：采用亲和纯化的方法可以有效地筛选出与gankyrin相互作用的蛋白质,为进一步研究gankyrin的作用机制及生物学功能奠定了基础。     

地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶基因的克隆与序列分析

以地衣芽孢杆菌２７０９染色体ＤＮＡ为模板,应用聚合酶链反应方法扩增了碱性蛋白酶基因,ＰＣＲ反应产物在１％琼脂糖凝胶上表现为１条１．１ｋｂ的条带。该片段经电泳纯化后被克隆于大肠杆菌质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ上,获得ａｐｒＬ＾＋克隆株。ＤＮＡ序列分析表明,它与枯草杆菌蛋白酶Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ具有很高的同源性,同样由编码信号肽、前导肽及成熟蛋白的３个部分构成。     

短小芽孢杆菌2080碱性蛋白酶的纯化与性质

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）2080碱性蛋白酶的发酵液经超滤、硫酸铵沉淀、CM Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得到了纯化的组分。SDS-PAGE电泳分析显示其分子量约为61kDa。酶学性质研究表明,该纯化酶的最适pH为10．5,最适温度为50℃。     

地衣芽孢杆菌JF-UN122碱性蛋白酶的分离纯化与性质

地衣芽孢杆菌JF—UN122的发酵液,以硫酸铵分段盐析得粗酶,再经DEAE—Sephadex A—50吸附色素、CM—Sephadex C-50离子交换及Sephadex G—75柱层析等步骤获得电泳纯的碱性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量为31．6KDa。以酪蛋白为底物时,酶的Km为5．26μg／min,Vm为20．8μg／min。酶的最适pH为9．0,最适温度为55℃,pH5～11,55℃以下酶较稳定,对1mol／LH2O2具有一定的耐氧化性。PMSF对酶抑制,二硫苏糖醇(DTT)有保护作用,钙离子、EDTA、SDS、尿素等对酶无明显影响。     

串联亲和纯化技术及其应用

串联亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)是一种能快速研究体内蛋白质相互作用的新技术,经过两步特异性亲和纯化,可快速得到生理条件下与靶蛋白质存在真实相互作用的蛋白质。TAP方法最初用于酵母中,因其具通用性、高效性、高纯度及假阳性低等特点得到了快速发展,至今已成功运用于许多其他生物。现主要介绍TAP方法的原理、TAP标签及其在不同物种中的应用。     

碱性蛋白酶基因在Bacillus licheniformis 2709中的整合和扩增

将含有去掉启动子的枯草杆菌碱性蛋白酶基因和Ｃｍ抗性基因的整合质粒ｐＭＰ以原生质体ＰＥＧ法转化Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ２７０９在１０ｕ／ｍｌＣｍ平板上筛选整合子,并通过不断提高整合子的抗氯霉素能力来扩增染色体碱性蛋白酶基因,最终选到一株产酶比生产菌２７０９提高６０％的高表达整合菌ＢＬ－２０３,该菌在无选择压力下遗传性状相当稳定。     

串联亲和纯化原核表达载体的构建

【目的】构建串联亲和纯化原核表达载体,用于研究细菌中(生理状态或接近生理条件下的)蛋白-蛋白相互作用。【方法】设计并合成两条串联亲和标签序列,分别可以在靶蛋白N端和C端融合Protein G和链亲和素结合肽(Streptavidin binding peptide,SBP)标签;以pUC18载体为骨架,去除原有的阻遏蛋白基因,构建组成型表达载体pNTAP和pCTAP。【结果】成功构建N端和C端标签表达载体pNTAP和pCTAP,它们在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、肠出血性大肠杆菌O157:H7和痢疾杆菌福氏5型M90T菌株中都可以实现表达。【结论】本实验构建的两个串联亲和纯化表达载体可以在部分革兰氏阴性细菌中表达,为研究细菌内蛋白-蛋白相互作用及致病菌毒力蛋白的作用机制奠定了基础。     

重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化的应用进展

重组蛋白质技术作为蛋白质研究的重要手段之一,在生物化学与生物物理学研究领域,扮演着极其重要的角色.亲和纯化作为最为方便与快捷的重组蛋白质纯化手段,日益得到广泛的应用.由于各种亲和标签,纯化介质层出不穷,性质各异.应根据自身研究对象具体情况选择合适的亲和纯化标签.近年双亲和标签进行串联亲和纯化日益成为蛋白质相互作用研究的重要方法.多种亲和标签的搭配已得到成功应用,部分已进入商业化,并在各种模式生物中得到广泛的应用,本文就重组蛋白质亲和标签的选择与串联亲和纯化作一综述.     

地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶基因的克隆、序列测定及其表达

以克隆的地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶编码序列的PCR扩增片段为探针。通过原位杂交从2709基因文库中筛选出两个含有完整的2709碱性蛋白酶基因的阳性克隆：Psci和Psc7。对Psc7中的插入片段构建若干亚克隆后测定了其全部DNA序列,结果显示该插入片段含2709碱性蛋白酶及其信号肽与导肽(Pro—peptide)在内的全部编码序列(1140碱基对)及长度分别为299和832碱基对的上、下游序列,该序列同M．Jacobs等克隆的地衣芽孢杆菌NcIB 6816的subtlisin Carlsberg基因序列显示了极高的同源性。通过枯草杆菌-大肠杆菌穿梭质粒Pbe2将克隆的2709碱性蛋白酶基因转入到蛋白酶缺陷型的枯草芽孢杆菌DB104中,结果表明2709碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中得到了明显的表达。     

HIV-1蛋白酶的表达、纯化及其抑制剂体外筛选方法的建立

从HIV-1IIIB病毒RNA经RT-PCR得到HIV-1蛋白酶编码序列,克隆到pet28a质粒中构建HIV-1蛋白酶表达载体。阳性克隆转染E.coliBL21DE3,经IPTG诱导,蛋白酶以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白量的40%。包涵体经TritonX-100洗涤后溶解于8M尿素,溶解后的蛋白溶液经sephacyls-200H.R分子筛柱纯化后纯度达到90%以上,收集蛋白酶峰稀释复性并通过超滤进行浓缩。经检测,纯化的蛋白酶具有较高的活性。用荧光标记的蛋白酶底物检测不同浓度indinavir对蛋白酶活性的影响,表明该方法可以用于蛋白酶抑制剂的筛选。     

碱性蛋白酶工程菌发酵条件及重组酶的纯化和性质的研究

在5L发酵罐中对重组碱性蛋白酶工程菌株BP071高产碱性蛋白酶的条件进行了研究,通过提高通气量和改变搅拌转速,BP071可在发酵40 h内达到产酶高峰,酶活力最高可达24480 u/mL。利用快速蛋白液相层析（FPLC）技术,建立了快速高效纯化碱性蛋白酶的方案。发酵液通过硫酸铵沉淀、DEAE-A-50脱色及聚乙二醇浓缩得粗酶,再经过CM-Sephadex-C-50、Sephadex-G-75柱层析后得到了单一组份的重组碱性蛋白酶,酶纯度提高了76.2倍。SDS-PAGE显示重组碱性蛋白酶分子量为28 kD。酶学性质研究表明,酶的最适作用pH为11,最适作用温度为60℃,具有良好的pH稳定性和热稳定性。Ca²⁺、Mg²⁺对酶的稳定性有促进作用,Hg²⁺、Ag⁺、PMFS和DFP能强烈抑制酶的活力。SDS和Urea对酶的活力无影响。     

Purification and Characterization of an Alkaline Protease from the Marine Yeast <Emphasis Type="Italic">Aureobasidium pullulans</Emphasis> for Bioactive Peptide Production from Different Sources

The extracellular alkaline protease in the supernatant of cell culture of the marine yeast Aureobasidium pullulans 10 was purified to homogeneity with a 2.1-fold increase in specific protease activity as compared to that in the supernatant by ammonium sulfate fractionation, gel filtration chromatography (Sephadex™ G-75), and anion-exchange chromatography (DEAE Sepharose Fast Flow). According to the sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis data, the molecular mass of the purified enzyme was estimated to be 32.0 kDa. The optimal pH and temperature of the purified enzyme were 9.0 and 45°C, respectively. The enzyme was activated by Cu²⁺ (at a concentration of 1.0 mM) and Mn²⁺ and inhibited by Hg²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Zn²⁺, and Co²⁺. The enzyme was strongly inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride, but weakly inhibited by EDTA, 1–10-phenanthroline, and iodoacetic acid. The K _m and V _max values of the purified enzyme for casein were 0.25 mg/ml and 0.0286 μmol/min/mg of protein, respectively. After digestion of shrimp protein, spirulina (Arthospira platensis) protein, proteins of marine yeast strains N3C (Yarrowia lipolytica) and YA03a (Hanseniaspora uvarum), milk protein, and casein with the purified alkaline protease, angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activities of the resulting peptides reached 85.3%, 12.1%, 29.8%, 22.8%, 14.1%, and 15.5%, respectively, while the antioxidant activities of these were 52.1%. 54.6%, 25.1%, 35%, 12.5%, and 24.2%, respectively, indicating that ACE inhibitory activity of the resulting peptides from the shrimp protein and antioxidant activity of those produced from the spirulina protein were the highest, respectively. These results suggest that the bioactive peptides produced by digestion of the shrimp protein with the purified alkaline protease have potential applications in the food and pharmaceutical industries.     

串联亲和纯化（TAP）技术在蛋白质组学中的应用

蛋白质是各种生命活动的主要执行者,因此构建蛋白质相互作用的网络图对于准确理解蛋白质功能、揭开各种细胞活动的奥秘十分重要.串联亲和纯化（TAP）,是近年来发展出来的一种能够快速研究在生理条件下蛋白质相互作用,揭示蛋白质复合体相互作用网络的新技术,已成为研究蛋白质组学的一个重要工具.随着该技术的不断完善,TAP技术在认识蛋白质相互作用的过程中必将发挥越来越重要的作用.     

Purification and Characterization of a Thermo- and Organic Solvent-Tolerant Alkaline Protease from Bacillus sp. JER02

Bacillus sp. JER02 is a bacterial strain that can be grown in a medium containing organic solvents and produce a protease enzyme. JER02 protease was purified with a yield of 31.9% of total protein and 328.83-fold purification. K _m and V_max of this protease were established as 0.826 µM and 7.18 µmol/min, respectively. JER02 protease stability was stimulated about 80% by cyclohexane. It exhibited optimum temperature activity at 70°C. Furthermore, this enzyme was active in a wide range of pH (4-12) and showed maximum activity at pH 9.0. The nonionic detergents Tween-20 and Triton X-100 improved the protease activity by 30 and 20%, respectively. In addition, this enzyme was shown to be very stable in the presence of strong anionic surfactants and oxidizing agents, since it retained 77%, 93%, and 98% of its initial activity, after 1 hr of incubation at room temperature with sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium perborate (1%, v/v) and H₂O₂ (1%, v/v), respectively. Overall, the unique properties of the Bacillus sp. JER02 protease suggested that this thermo- and detergent-stable, solvent-tolerant protease has great potential for industrial applications.     

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达

目的:获得碱性蛋白酶基因。方法:用PCR的方法从枯草芽孢杆菌A-109中扩增碱性蛋白酶基因(apr),并进行测序分析,构建表达载体,最后转化大肠杆菌BL21,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该基因的表达情况。结果:apr基因片段含1092个碱基对。该基因片段核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens subtilisin DFE precursor有99%的同源性,对应的氨基酸序列与Bacillussp.DJ-4有99%的同源性。apr基因在大肠杆菌BL21中获得表达,并表现出蛋白酶活性。结论:获得了具有活性的新的碱性蛋白酶基因。     

Purification and characterization of an extracellular protease from Flavobacterium arborescens

An extracellular protease from Flavobacterium arborescens has been purified to an apparent homogeneity and characterized. The enzyme is most active at pH 8-10.5, requires no metal cofactor, and is inhibited by diisopropyl fluorophosphate. The protease is nonspecific, is active at temperatures up to 60 degrees C, and is completely free of nucleases. The ease of purification and freedom from nucleolytic contaminants make the protease a useful deproteinizing agent in DNA and RNA manipulations.     

丝氨酸蛋白酶抑制剂Ea的表达纯化与活性分析

Ea是一种植物来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂,分子量为18kD。利用其与丝氨酸蛋白酶家族成员的结合特性,可用于丝氨酸蛋白酶的结构与功能研究,也可作为亲和层析的配体而用于丝氨酸蛋白酶的纯化。将Ea基因插入大肠杆菌表达载体pET11a,在BL21(DE3)菌中以包涵体形式表达出重组蛋白质,表达量可占菌体蛋白质总量的30%。将包涵体变性、复性,得到具有天然抑制活性的rEa。经两步纯化所得rEa的纯度达到967%以上。活性分析表明,rEa对胰蛋白酶和人组织型纤溶酶原激活剂均有抑制作用。制备成rEaSepharose亲和柱可有效结合胰蛋白酶。