014 脂多糖抗原诊断钩端螺旋体病相关性葡萄膜炎

钩端螺旋体(简称钩体)病是一种广泛流行的动物源性疾病,尽管目前已有多种商业试剂盒用于诊断系统性钩体病,但试剂盒中起作用的具体抗原的性质仍不清楚。钩体病相关性葡萄膜炎是系统性钩体病的一种晚期并发症,该研究目的在于验证并评估钩体脂多糖(LPS)抗原作为钩体病相关性葡萄膜炎的临床辅助诊断的意义。     

抗脂多糖纳米抗体的筛选及其五聚体的制备

目的：筛选抗脂多糖（LPS）纳米单域抗体,并制备抗LPS纳米抗体五聚体。方法：以LPS为抗原,从驼源天然单域重链抗体库中筛选抗LPS纳米抗体,利用分子克隆技术将抗LPS单域抗体基因组装入志贺杆菌样毒素B亚基蛋白结构域（VTB）的五聚体特异性表达载体中进行可溶性表达,并用ELISA法鉴定所获抗体的抗原结合活性和特异性。结果：获得抗LPS纳米单域抗体及LPS纳米抗体五聚体;经鉴定,LPS纳米抗体五聚体的抗原结合活性优于抗LPS单域抗体。结论：利用驼源天然单域重链抗体库制备了抗LPS纳米单域抗体及抗LPS纳米抗体五聚体,为脓毒血症的分子诊断、预后判断及寻找生物治疗新靶点奠定了基础。     

钩端螺旋体脂多糖非特异性抗感染的研究II.非特异性保护作用的机制

对钩端螺旋体脂多糖提高机体非特异性抗感染力的作用机制进行了研究。试验结果表明,L—LPS和E—LPS均能增强豚鼠腹腔巨噬细胞的非特异性吞噬功能。两者激活小鼠腹腔巨噬细胞,使胞体增大,并提高细胞内酸性磷酸酶的含量与活性。L—LPS可能对酶的合成具有较强的作用,而E—LPS相对增强酶的活性。两者具有免疫调节作用。小鼠在免疫3d后接受L—LPS,产生免疫佐剂作用,而在免疫前24h给予L—LPS,却导致免疫抑制。     

钩端螺旋体抗原研究进展

<正> 现已知致病性钩端螺旋体(以下简称钩体)有大约19个血清群共180个血清型。如此众多的血清型很难从形态、生化及培养特性上区分开来,但它们具有不同的抗原性,这对钩体的分类,钩体病的血清学诊断及钩体疫苗的研制均有重要意义(1)。本文仅就近年来国外有关钩体抗原研究的部分文献作一复习。     

钩端螺旋体在复方明胶培养基中长期传代培养的抗原性分析

本文报道了钩端螺旋体(简称钩体)在复方明胶培养基中经过三年的传代培养,用显微镜凝集试验、对流免疫电泳及SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳(PAGE)分析,同Korthof培养基的钩体抗原比较。结果证明:(1)钩体抗原的组成是非常复杂的,SDS-PAGE可显示20多条抗原带;(2)两种培养基所培养的钩体,未发现抗原性变异。说明钩体在复方明肢培养基中长期传代培养过程中,其抗原组成是相对稳定的。这对进一步探讨钩体长期在综合培养基中培养以后的抗原稳定性,具有一定的理论及实际意义。     

钩端螺旋体聚Beta羟基丁酸(PHB)生物合成途径分析

【目的】致病型问号钩端螺旋体(问号钩体, Leptospira interrogans)和腐生型双曲钩体(L. biflexa)能够大量合成菌体内贮藏物, 这可能是钩体在营养贫瘠环境中长时间存活的主要原因之一。本研究对钩体聚Beta羟基丁酸(PHB)贮藏物进行定性定量测定, 通过基因组分析补充定义PHB合成主要功能基因, 并采用分子生物学方法初步证明PHB合成途径的完整性, 为进一步研究PHB合成与钩体抗逆能力的关系奠定基础。【方法】采用脂类特异性尼罗红染色法和浓硫酸氧化-紫外分光光度计测定法, 对问号钩体和双曲钩体的PHB贮藏物进行定性定量测定; 采用生物信息学方法(BLAST和InterProscan/InterPro2Go), 通过同源性分析和功能结构域搜索寻找钩体基因组中的PHB合成相关基因; 最后采用克隆测序和定量RT-PCR技术检测相关基因表达情况, 初步验证生物信息学预测结果。【结果】尼罗红染色和氧化后比色定量实验证明钩体合成细菌常见贮藏物PHB, 问号钩体合成量为菌体干重的42%?45%, 双曲钩体合成量为64%?68%。尽管已公布的多个钩体基因组中均没有定义完整的PHB合成途径, 但本研究通过综合生物信息学分析, 在问号钩体和双曲钩体中鉴定了PHB合成途径的主要功能基因(phbC)。克隆测序和定量RT-PCR证实钩体转录表达大部分PHB合成相关基因(phbA/B/C), 说明钩体内该生物途径基本完整, 且部分高水平表达基因可能是钩体主要的PHB合成相关基因。【结论】问号钩体和双曲钩体均可合成PHB贮藏物, 且具有基本完整的PHB合成生物途径。     

青霉素对患者血内钩端螺旋体的消减

为了研究青霉素治疗中患者体内钩端螺旋体(简称钩体)的动态变化,我们于1974年7—9月检测了23例疑似钩体病患者,在青霉素治疗过程中进行钩体分离培养,获得8例阳性,现将分离情况报告如下。     

国内外钩端螺旋体活菌苗研究动态

钩端螺旋体(以下简称钩体)死菌苗,已广泛用于预防人类和各种动物的钩体病,并已取得肯定的效果。然而,在用于动物时,不少学者相继发现,死菌苗虽可防止钩体病临床症状的出现,但尚不足以制止免疫动物肾脏带菌或尿中排菌。White等认为,制备死菌苗时,由于使用了福尔马林(以下简称福尔马林菌苗)或其它杀     

天花粉对钩端螺旋体生长的促进作用

为了提高钩端螺旋体(以下简称钩体)的检出率,我们从多种中药中筛选出对钩体有促进生长作用的天花粉。实验结果如下: 各型钩体在添加0.1％天花粉柯索夫培养基的生长情况:将添加0.1％天花粉的柯索夫培养基与常规使用的柯索夫培养基各1ml,接种1/1000稀释度钩体培养物0.1ml,混匀,置28℃温箱培养。从第3天到第7天,每天用3mm直径接种环挑取培养物一环,置载玻片上,用暗视野     

问号钩端螺旋体属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答

为了确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型,为OmpL1s用于研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒抗原提供依据。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区156份钩体病人血清标本。用PCR和核苷酸序列分析,了解中国流行的钩体主要血清群ompL1基因型。采用常规基因工程技术构建ompL1/1和ompL1/2主要基因型原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rOmpL1/1和rOmpL1/2。采用胶体金免疫电镜技术,对OmpL1s进行膜定位。建立了基于rOmpL1s的ELISAs,检测钩体病人血清中特异性抗体水平及其类型。试验结果表明,黄疸出血群钩体仍然是四川地区最主要的优势钩体血清群。中国流行的钩体主要血清群ompL1基因可有ompL1/1和ompL1/2两个基因型,两者核苷酸和氨基酸序列相似性之间有较明显的差异。OmpL1s是位于钩体外膜表面的蛋白分子。不同稀释度的156例钩体病人血清标本中,rOmpL1/1和rOmpL1/2特异性IgM阳性率分别为67.9%～79.5%和75.0%～75.6%,特异性IgG阳性率分别为71.8%～79.5%和75.0%～76.9%。上述试验结果提示,OmpL1s是位于钩体表面属特异性蛋白抗原。自然感染钩体时,rOmpL1/1和rOmpL1/2均可诱导机体体液免疫应答并产生IgM和IgG两类血清抗体,且两者之间有广泛的抗原交叉反应。rOmpL1/1和rOmpL1/2可作为研制通用性钩体基因工程疫苗和检测试剂盒的候选抗原。     

流感病毒识别糖链受体分子机制的研究进展

近年来,由于流感病毒(influenza virus)不可预测的局部流行和有可能引发全球大流行,其一直是研究的热点课题之一．流感病毒表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)特异识别宿主细胞表面的糖链受体是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的生物学基础．影响流感病毒宿主特异性的两个主要因素是HA自身的变化(包括基因突变、重组、糖基化位点数量和糖基化位置的变化)和宿主细胞表面糖链受体的变化(包括糖链受体的类型、分布和分子构象的改变)等．因此准确掌握这些信息有助于人们进一步加强对流感病毒的防控．本文主要从糖组学角度概述了流感病毒识别糖链受体的分子机制,重点介绍流感病毒宿主细胞表面糖链受体的研究进展．     

采用小白鼠分纯钩端螺旋体菌株

近年来,随着钩端螺旋体病的调查研究工作的广泛开展,在实验诊断方面,除进行大量血清学试验外,对钩端螺旋体菌株(以下简称钩体菌株)进行培养,作好菌群鉴定,对生物制品和制订防治措施提供参考。但往往由于在采集标本及实验操作过程中无菌操作不严格,而使分离出的钩体菌株发生污染。用常规方法     

豆壳过氧化物酶的盐酸胍变性与化学修饰研究

研究了盐酸胍对豆壳过氧化物酶(soybeanhullperoxidase,SHP,EC1.11.1.7)构象与活力的影响,发现去辅基SHP的盐酸胍变(复)性及荧光变化关系与SHP全酶分子的盐酸胍变(复)性及荧光变化关系明显不同。应用过碘酸氧化法去除SHP分子表面糖链,研究糖链去除对酶性质的影响,则证实了SHP分子表面的糖链去除导致酶热稳定性下降。应用不同的蛋白质侧链修饰剂对SHP进行化学修饰则表明,巯基、酪氨酸和色氨酸残基为酶活力非必需,而羧基、组氨酸和精氨酸残基为酶活力所必需。     

网状内皮系统吞噬功能在钩端螺旋体病中的作用

用小白鼠和豚鼠对动物的实验性钩端螺旋体(简称钩体)感染的研究结果表明,网状内皮系统吞噬功能起着重大的作用。用墨汁封闭网状内皮系统(RES),可使小白鼠出现以全身广泛出血为特点的典型钩体病变,并致死亡,对豚鼠则可大大加重感染严重程度。以卡介苗激活RES吞噬功能,则可明显提高动物对钩体的抵抗力,延迟死亡时间,减轻病变程度,降低,E亡率。上述结果提示激活RES功能有可能在防治人类钩体病及其肺大出血上具有一定的意义。本文墨汁封闭RES小白鼠的实验性钩体感染还可作为一个较好的钩体病实验模型而用于药物防治的研究。     

问号钩端螺旋体中一个新的OmpA家族蛋白抗原性及保守性研究

目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans)黄疸出血群赖型赖株中一个新的外膜蛋白(Omp)A家族基因LA0301,研究LA0301编码蛋白的抗原性和在15个钩端螺旋体(简称钩体)血清群代表株中的保守性,探讨其在疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测LA0301的特征。构建原核表达重组体pQE31-LA0301,经IPTG诱导后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹检测其免疫反应性和在不同血清型钩体中的保守性。酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹检测兔抗钩体全菌血清中的LA0301编码蛋白的抗体。结果生物信息学预测结果显示,LA0301具有OmpA家族的结构域。克隆表达了重组质粒pQE31-LA0301,重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体,效价为1:32000。在兔抗钩体全菌血清中检测到特异的LA0301蛋白抗体,并在15个血清群的代表株钩体中均可检测到LA0301蛋白。结论LA0301蛋白是问号钩体中一个新的OmpA家族蛋白,具有良好的抗原性和保守性,并且能在钩体感染的过程中刺激机体产生相应的抗体。为进一步研究钩体新型疫苗候选基因奠定了基础。     

犬用钩端螺旋体抗体ELISA检测实验研究

通过对犬用钩端螺旋体病(钩体)ELISA检测方法的研究,建立了犬用ELISA钩体抗体检测方法。实验的最佳方案:包被抗原蛋白质含量为20μg/mL,酶结合物稀释度为1∶10 000,检测血清稀释度为1∶160。经10份犬免疫血清验证,均为阳性。此研究为犬用钩体抗体检测提供了一种简便快速的方法,具有重要的实用价值。     

问号钩端螺旋体基因组DNA芯片的研制

目的 研制并初步评估问号钩端螺旋体(简称钩体)赖型赖株的基因组DNA芯片。方法 利用Primegens引物设计软件筛选出问号钩体赖型赖株全基因组中的特异性基因进行引物设计。对成功设计出相应引物的3 290个基因用聚合酶链反应方法进行扩增,以纯化后的产物点样制备芯片。并用双色荧光杂交策略对芯片质量进行了初步平估。结果 共获得3 290个基因产物用于点样。参考株自身杂交实验结果表明:该芯片有较高的点一致性、信噪比和较低的假阳性率。结论 成功制备了包含问号钩体赖型赖株3 290个目的基因的基因组DNA芯片,并可用于基于该芯片的问号钩体比较基因组学的研究。     

寄生性与腐生性钩端螺旋体之间的共同属特异性红细胞致敏物质(ESS)的探讨

寄生性钩端螺旋体(以下简称钩体)各血清(?)(型)间具有共同的属特异性红细胞致敏物质(ESS),已为大家公认。但寄生性与腐生性钩体之间的共同属特异性ESS关系如何,尚未见报道。现将笔者的有限试验资料整理报道于下,供参考。     

胰岛素B链N端和C端缩短对其与胰岛素抗体结合力的影响

本文研究了B链N端和C端缩短的若干胰岛素类似物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明:去B链C端五肽胰岛素(DPI)分子中B_1-Phe去除后其与胰岛素抗体结合力明显下降,这与去B_1-Phe胰岛素与胰岛素抗体结合力下降的趋势相似;去B链C端六肽胰岛素(DHI)与胰岛素抗体结合力与DPI非常接近,都为胰岛素的70%左右。而去B链C端七肽胰岛素(DHPI)与胰岛素抗体结合力与去B链C端六肽胰岛素(DHI)相比,其结合力下降了一个数量级。说明胰岛素B_1-和B_(24)-Phe残基对组成和维持胰岛素分子的抗原决定簇起着重要作用。去B链九肽胰岛素(DNI)与胰岛素抗体的结合力与去B链C端八肽胰岛索(DOI)及DHPI相似。本文对上述结果进行了讨论。     

钩端螺旋体疫苗的接种反应和血清学效果观察

为统一中国钩体疫苗的菌数 (浓度 ) ,保障人群预防接种的安全与有效 ,用上海、武汉和成都生物制品研究所生产钩体疫苗 ,观察了 4种不同菌数、4种不同接种剂量 8个不同组别对 2 0 37人的免疫效果。所有接种者全身反应轻微 ,中强反应不超过 3%。局部反应各所间有差别 ,上海所最轻 (9.6 8% ) ,武汉所居中(17.93% ) ,成都所最重 (38.78% )。血清阳转率和GMT水平 1个月达高峰 ,3个月似有下降。随着钩体疫苗接种总量的增大 ,人群抗体的阳转率和GMT水平有所提高 ,尤其是赖型抗原。 3个所疫苗的抗体阳转率和GMT有明显差别 ,以成都所为最高。根据实验结果 ,建议 :① 5价 (含 5价 )以下钩体疫苗 ,每型菌数不低于1.5亿 /mL ;② 6价 (含 6价 )以上 ,每型含菌数不应低于 1亿 /mL ,但疫苗的总菌数不超过 12 .5亿 /mL ;③全程接种 2次 ,首次 0 .5mL ,再次 1mL ,间隔 5～ 7d。该建议已被 1990版《中国生物制品规程》(钩体疫苗制检规程 )所采纳 ,并一直沿用至今。