戈壁异常球菌Dgl5蛋白生物学功能研究北大核心CSCD

LEA5C(Group 5C Late Embryogenesis Abundant)家族蛋白参与非生物胁迫反应并以分子伴侣的形式保护细胞内生物大分子不受损伤。分离于新疆戈壁沙漠的戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)I-0具有极端的电离辐射、氧化、干燥等抗性。功能基因组注释表明Dgo_CA1605编码蛋白属于LEA5C家族,命名为Dgl5,对Dgl5生理功能展开研究。采用同源重组的方法构建Dgl5重组表达菌株。非生物胁迫实验结果表明,Dgl5能够显著增强表达菌株BL21盐胁迫抗性,最大限度地保护宿主菌免受反复冻融的损伤;体外生理生化实验结果表明在反复冻融条件下,Dgl5能够有效保护苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)酶学活性。因此推测,在冷冻、高盐胁迫条件下,Dgl5蛋白通过保护细胞体内相关酶类的活性,增强宿主菌抵抗外界复杂多变的极端环境。?     

耐辐射异常球菌dlp基因缺失突变株构建及其生物学功能研究

耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans,DR)因其具有对非生物胁迫超强的抵抗能力而备受关注。旨在了解该菌亲水蛋白Dlp在细胞耐受非生物胁迫中的作用,采用融合PCR和基因同源重组技术,获得了dlp基因缺失突变株Δdlp,对野生型DR及突变株Δdlp进行非生物胁迫。结果表明,dlp的缺失导致DR细胞对高盐和氧化胁迫敏感。体外检测氧化胁迫条件下Dlp蛋白对苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的保护,结果显示,Dlp蛋白的加入能缓解氧化胁迫条件下MDH、LDH酶活性的损失。由此表明,亲水蛋白Dlp增强了耐辐射异常球菌对非生物胁迫的抗性,并能以类似分子伴侣的形式保护胁迫条件下酶的活性。     

蒺藜苜蓿MtLEA5B的克隆和功能分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant protein,LEA protein)是一类参与植物抗逆性应答的亲水蛋白。旨在揭示异源表达LEA蛋白在非生物胁迫条件下对宿主的保护作用。从蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)幼苗中克隆到一个编码LEA_5蛋白的基因,命名为MtLEA5B,通过半定量RT-PCR分析MtLEA5B的表达模式。利用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组蛋白的耐热性和可溶性。构建原核表达载体,转化大肠杆菌过表达,检测大肠杆菌的生长存活情况。MtLEA5B的表达模式受到低温(4℃)、脱水、150 mmol/L NaCl胁迫和ABA处理的调控。SDS-PAGE蛋白电泳出现一条相比理论预测值较大,且沸水条件下可溶性未降低的条带。在大肠杆菌中过表达MtLEA5B蛋白能明显提升宿主菌在高温(55℃)和冷冻(-20℃)条件下的生存率。MtLEA5B是诱导性表达基因;MtLEA5B蛋白具有较高的亲水性和耐热性。在大肠杆菌中过表达可以明显提升其对温度胁迫的耐受性。     

百子莲ApSPI基因原核表达及其重组菌的抗逆性研究

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitor,SPI)通过抑制靶蛋白活性参与调节内源蛋白平衡,并在植物发育、防御机制中发挥重要作用。该研究利用RACE技术克隆获得百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)ApSPI基因全长序列,构建了E.coli Transetta(pET-32a-ApSPI)重组菌株,并检测重组菌株在不同非生物胁迫下的耐受性。结果显示:(1)ApSPI基因全长为652 bp,开放阅读框为366 bp,编码122个氨基酸。(2)ApSPI蛋白含有一个N端信号肽和一个典型的Kazal结构域,是一种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂。重组蛋白最佳诱导温度为37℃,诱导时间6 h,IPTG浓度为0.1 mmol·L~(-1),且主要以可溶性形式存在。(3)重组菌非生物胁迫耐受性研究发现,重组菌Transetta(pET-32a-ApSPI)对NaCl(200～400 mmol·L~(-1))、KCl(200～400 mmol·L~(-1))和PEG6000(5%)的耐受性明显高于对照菌株Transetta(pET-32a)。研究表明,过表达ApSPI蛋白增强了大肠杆菌对盐、干旱胁迫的抗性,为进一步研究ApSPI在植物抗逆中的作用奠定了基础。     

枳LEA基因家族鉴定及其对非生物胁迫的响应

为明确LEA基因在枳非生物胁迫中的作用,研究通过生物信息学方法对枳LEA基因家族进行全基因组的鉴定,并采用qRT-PCR技术分析其在不同非生物胁迫下的表达情况。结果表明:(1)枳基因组中鉴定得到57个LEA基因家族成员,编码蛋白的氨基酸长度在62~945 aa之间,分子质量在6.95~104.98 kD之间。(2)系统进化分析表明,PtrLEA基因可分为8个亚家族,LEA_1~LEA_6、dehydrin和SMP,LEA_2亚族家族成员最多。(3)顺式作用元件分析表明,PtrLEA启动子上存在大量的植物激素、胁迫响应以及生长发育有关的响应元件。(4)转录组数据分析结果显示,LEA基因家族具有组织表达特异性,PtrLEA 15、PtrLEA 17、PtrLEA 23、PtrLEA 51在所有组织中均有高表达,也发现有3个基因在所有组织中不表达。(5)实时荧光定量PCR结果显示:PtrLEA基因在低温、干旱和高盐胁迫处理条件下,与对照相比分别有6、2和6个基因上调表达,推测该基因家族参与多种非生物胁迫应答。     

脱落酸信号转导途径在植物应对非生物胁迫响应中的作用

脱落酸(abscisic acid, ABA)是植物用来抵抗外界威胁的一种重要激素,它通过影响其信号通路中下游调控因子的转录和转录后修饰,控制植物对生物和非生物环境胁迫作出响应,从而增强植物的抗性。其核心反应首先是脱落酸受体接受脱落酸分子信号后,变构抑制蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C, PP2C)的活性,从而减轻或消除PP2C对蔗糖非发酵相关蛋白激酶2(sucrose non-fermented related protein kinase 2, SnRK2)的抑制,增强SnRK2激酶对底物蛋白的磷酸化来调节植物脱落酸的总体反应。其次,当感知到外界威胁时植物通过激活编码脱落酸生物合成酶基因的表达,促进脱落酸的生物合成和积累,从而激活脱落酸信号通路中下游胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins, LEA)的表达,增多的LEA蛋白可以保护细胞膜的稳定性从而增进植物的抗逆性。另外,脱落酸在触发保卫细胞气孔关闭方面也起关键作用,脱落酸可以调节细胞离子通量,介导气孔闭合,减少水分流失。     

金发草LEA 3 基因两个剪接体转化酿酒酵母的抗非生物胁迫功能分析

对金发草(Pogonatherum paniceum)第3组LEA蛋白(PpLEA3)基因两个剪接体进行分析,并利用酿酒酵母表达系统分析两个剪接体在不同非生物胁迫的响应差异.以PpLEA3基因两个剪接体(PpLEA3.a和PpLEA3.b)的重组载体pMD19-T-PpLEA3.a和pMD19-T-PpLEA3.b为模板,PCR法构建酵母表达载体pYES2-PpLEA3.a和pYES2-PpLEA3.b,并转化酿酒酵母细胞得到重组菌INV-PpLEA3.a和INV-PpLEA3.b.通过比较重组菌和对照菌(转空载体pYES2)在NaCl、NaHCO3、低温、干旱、UV胁迫下的恢复生长状况,结果表明两种重组菌胁迫后的生长情况明显好于对照菌,两个剪接体对非生物胁迫抵抗力的大小为:PpLEA3.a＞PpLEA3.b.两个剪接体在核酸序列上的差异导致了在蛋白亲水性和结构上的差异,最终导致了在抗逆能力方面的差异.     

谷胱甘肽在乳酸乳球菌抵抗氧胁迫中的保护作用

为研究谷胱甘肽(GSH)在乳酸乳球菌NZ9000抗氧胁迫中的生理作用,以能够生物合成GSH的重组菌NZ9000(pNZ3203)为实验菌株进行了研究。结果表明,在较高H2O2胁迫剂量(150mmol/L H2O2,15min)下,前培养3h、5h和7h(即乳酸链球菌素诱导1h、3h和5h)时的重组菌细胞的存活率分别是处于相应生长时期对照菌NZ9000(pNZ8148)的1.8±0.1倍、2.6±0.1倍和2.9±0.3倍。表明GSH可以提高宿主菌NZ9000对H2O2所引发氧胁迫的抗性。GSH还可以提高宿主菌NZ9000对其它化学物质(如超氧阴离子自由基生成剂———甲萘醌)所引发氧胁迫的抗性。这表现在经20mmol/L甲萘醌处理60min后,前培养5h(即乳酸链球菌素诱导3h)时重组菌细胞的存活率是对照菌的6.2±0.1倍。由此表明,通过代谢工程手段在菌株NZ9000中引入GSH合成能力,可以提高宿主菌对氧胁迫的抗性。     

干旱胁迫下白沙蒿LEA基因的表达及序列分析

[目的]确定白沙蒿在干旱胁迫下起调节作用的LEA蛋白家族及其生物信息学特征。[方法]对在正常生长、中度胁迫和重度胁迫下的白沙蒿进行转录组测序,获得其LEA表达的差异性,对其中显著上调表达的基因进行序列分析。[结果]与多数报道的物种不同,白沙蒿在干旱胁迫时起调控作用的是第5家族LEA5蛋白。白沙蒿LEA的开放阅读框(ORF)全长264 bp,编码87个氨基酸。LEA5蛋白的分子量为9 406.74 Da,等电点为9.75,其序列与黄花蒿同源性最高(64%)。LEA蛋白为亲水性蛋白,定位于线粒体(73.9%),二级结构以无规则卷曲(59.77%)和α-螺旋(37.93%)为主,无信号肽和跨膜结构。[结论]白沙蒿在干旱胁迫下,LEA5参与了抗旱的调控,该基因的生物信息学特征分析为深入了解白沙蒿及蒿属其它固沙植物的抗旱机制提供一定的理论基础。     

DrwH类信号肽序列对其抗氧化功能的影响

耐辐射异常球菌疏水性LEA5C家族蛋白DrwH参与细胞耐受氧化和盐胁迫过程。前期研究发现,DrwH蛋白N端存在19个氨基酸组成的类信号肽序列,为探索该序列对DrwH发挥抗氧化功能的影响,本研究通过对DrwH蛋白进行分段截短,构建含有不同区段的重组大肠杆菌菌株,比较分析重组菌株在正常培养和氧化胁迫下的生长能力。结果表明,含有类信号肽序列的融合蛋白过量表达不仅抑制了大肠杆菌的生长,而且使DrwH蛋白失去抗氧化能力。荧光定量PCR显示经IPTG诱导后,含类信号肽全长蛋白DrwH和结构域蛋白WHy在转录水平大量累积,蛋白在过量积累条件下发挥其生物学功能。由此表明,类信号肽对全长蛋白DrwH表达及其发挥抗氧化功能具有重要影响。     

高粱LEA基因家族的鉴定及表达分析

有研究表明,干旱、低温和盐等环境胁迫能够诱导LEA基因的表达。为了探索LEA基因家族在高粱响应外界刺激过程中起到的作用,本研究通过生物信息学的方法对LEA基因家族在高粱全基因组水平进行鉴定和分析,于高粱全基因组中共鉴定出35个基因家族成员,不均匀地分布于高粱8条染色体上,结合系统进化树和保守结构域分析结果,将高粱LEA基因家族成员分为7组。亲水性分析和结构无序性预测表明高粱LEA蛋白绝大多数为亲水性且结构无序。基因结构分析显示了各分组基因结构上的保守性。高粱LEA基因的启动子分析发现了一些与激素和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。对激素和干旱胁迫下高粱LEA基因的表达分析发现外界胁迫能够诱导部分高粱LEA基因的表达。     

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)与植物抗逆性研究进展

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)在自然条件下主要在种子发育晚期大量积累,植物LEA基因也在多种非生物胁迫下诱导表达。植物LEA蛋白是植物应对失水胁迫(包括干旱、盐碱、冷冻等)逆境的一种广泛存在的亲水性应答蛋白,具有很强的热稳定性。本论文就LEA蛋白的结构、分类、功能及抗逆性分子机制进行了概述与总结,为分离新的LEA蛋白成员,进行功能分析以及进一步发掘其潜在应用价值提供参考。     

小麦TaDRLea3 2基因的克隆及胁迫诱导表达分析

胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白) 是植物体中广泛存在的一类与渗透调节相关的家族蛋白,植物受非生物胁迫会大量表达。该研究采用同源克隆技术,从干旱诱导的小麦品种‘郑引1号’ (Triticum aestivum L.)中获得1个新的LEA3家族基因（ TaDRLea3 2）,该基因全长668 bp,编码区为570 bp,编码189个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白为亲水性蛋白,二级结构以α 螺旋为主,含有9个由11个氨基酸组成的保守结构域,为典型的LEA3蛋白,存在3个磷酸化位点,无信号肽结构域及跨膜结构域,可能定位于细胞质中;实时定量PCR结果表明, TaDRLea3 2基因受干旱、高盐、低温诱导表达,同时也受外源ABA诱导,推测 TaDRLea3 2为ABA依赖型 LEA3基因,以不同机制参与小麦对非生物胁迫的应答过程,为深入分析小麦LEA3家族蛋白的抗逆机制奠定了基础。     

植物抗逆蛋白（LEA3）22-氨基酸耐盐结构域在酵母细胞中的鉴定

大豆PM2蛋白属LEA3 （late embryogenesis abundant 3）蛋白。本文构建了编码PM2全长及含22-氨基酸结构域多肽（PM2、PM2A、PM2B和 PM2C）的酵母表达载体。转化酵母得到四种重组菌。SDS-PAGE电泳和ESI-MS/MS或MALDI-TOF/TOF质谱结果表明,重组菌可表达目标多肽。测定对照菌及重组菌在无胁迫、高盐（1.5 mol·L^-1 NaCl）和高渗透（2 mol·L^-1山梨糖）下的生长曲线。结果表明,在高盐胁迫下,四种重组菌胁迫后的恢复明显好于对照菌。多肽对高盐耐受能力的大小为:PM2C>PM2B≈PM2A≈PM2。证明大豆PM2蛋白的表达可提高酵母耐盐性,且22-氨基酸基序为PM2蛋白的耐盐结构域。结合前文在大肠杆菌中的结果,为“LEA蛋白可以类似机制参与原核和真核生物耐盐保护作用”的假说提供实验支持。然而,在高山梨糖胁迫下,对照菌和酵母重组菌的生长情况无明显差异。     

LEA蛋白研究进展

LEA蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)是生物体中广泛存在的一类与渗透调节有关的家族蛋白,该蛋白的编码基因在植物种子胚胎发育晚期表达量丰富,而且在环境胁迫如干旱、低温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和NaHCO3等条件下LEA基因的mRNA也会大量累积.LEA蛋白显著的理化特性是具有很高的亲水性和热稳定性,即使在煮沸条件下也能保持水溶状态.LEA蛋白在细胞中可以稳定细胞膜结构,作为分子伴侣,具有结合离子和防止氧化等作用,被认为是在胁迫过程中对植物起保护作用的物质之一.针对这些重要特性,分别综述了LEA蛋白的分类、结构、编码基因和表达调节方式及其在植物生长过程中的作用.     

橡胶树HbMC2在酵母中的表达和抗逆性分析

Metacaspase介导的程序性细胞死亡在植物生长发育、抵御生物和非生物胁迫过程中发挥重要作用。前期研究发现橡胶树metacaspase基因HbMC2的表达受干旱和高盐等非生物胁迫调控。为明确HbMC2的功能,采用RT-PCR从橡胶树中扩增HbMC2编码区序列并将其插入到pYES2载体中,构建酵母表达载体pYES2-HbMC2。将pYES2-HbMC2质粒转化到酿酒酵母INVSc1菌株中,获得重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)。PCR及RT-PCR检测结果表明,HbMC2已成功转入重组酵母并能在半乳糖诱导下表达。与对照酵母INVSc1(pYES2)相比,重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)在氧化、干旱和盐胁迫下的生长受到抑制、细胞死亡率增加。结果表明酵母中表达HbMC2降低了对非生物胁迫的抗性,HbMC2是非生物胁迫抗性的负调节因子。     

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良, 构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌, 该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S. aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E. coli BL21(DE3)的lpxM位点, 改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间, 这样可使宿主核酸免受该酶“毒性”影响, 菌体裂解后, nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。     

盐穗木HcUKPP原核表达及重组菌非生物胁迫耐受性研究

该研究采用RT-PCR技术,从盐穗木cDNA文库中克隆获得未知功能多肽HcUKPP基因,构建了大肠杆菌Escherichia coli BL21∷pET30a-HcUKPP重组菌株,并检测了重组菌株在不同非生物胁迫下的耐受性。结果显示:HcUKPP基因开放阅读框为243bp,融合His的HcUKPP蛋白的分子量约为15kD。在37℃条件下,不同浓度的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h后His-HcUKPP融合蛋白均可表达,且E.coli BL21∷pET30aHcUKPP重组菌在不同浓度NaCl(100~900mmol/L)、聚乙二醇(2.5%~20%,PEG 6000)和甲基紫精(25~200μmol/L)胁迫处理下,其生长均具有明显优势。尤其是在500mmol/L NaCl、10%PEG 6000和75μmol/L甲基紫精胁迫12h后,重组大肠杆菌BL21呈现出极显著的优势,分别达到了对照菌的1.81、1.47和3.48倍。研究表明,盐穗木HcUKPP可以显著提高重组大肠杆菌对不同非生物胁迫的耐受性,证明HcUKPP是一类新发现的能够响应非生物胁迫的多肽。     

非生物胁迫下植物脱水素的研究进展

脱水素是LEA蛋白中的一类,广泛存在于植物的各个组织器官及植物胚胎发育后期.脱水素是植物在受低温、干旱和高盐等非生物逆境胁迫时合成的一类高亲水性保护蛋白,具有保护核酸、胞内蛋白和膜结构免受损害的功能.许多研究已经证实在非生物胁迫下,植物脱水素的表达与积累和植物抗逆性之间存在着紧密的联系.对脱水素的结构、亚细胞定位、基因表达模式及非生物胁迫下脱水素作用的最新研究成果进行了综述.     

小鼠核糖核酸酶抑制剂的高效可溶性表达与氧化抗性鉴定

核糖核酸酶抑制剂(Ribonuclease inhibitor, RI)是一种细胞内能够调节核糖核酸酶活性的胞浆蛋白,在分子生物学涉及RNA的实验中有广泛应用。商品化的小鼠RI(mRI)宣称其可能具有较高的氧化抗性。为获得mRI在大肠杆菌宿主中可溶性活性产物的有效重组表达,构建了含有mRI编码基因的重组质粒载体,在几种不同工程菌中进行了mRI蛋白的表达纯化,并观察了其氧化抗性特征。简单的组氨酸标签融合,即可在蛋白酶基因缺陷的BL21衍生的宿主菌中,经过适当诱导,获得较高水平活性产物的可溶性表达。纯化后产量在4~8mg/L水平,接近其他种属RI特殊优化表达系统的最高产量。该重组mRI与重组人RI(hRI)具有基本一致的核糖核酸酶抑制活性和抗氧化作用,与前人推测的抗氧化特征不同。