3α-羟类固醇脱氢酶的表达、纯化和酶学性质研究

从土壤中分离睾酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶（3α-HSD）基因。以质粒pET15b为载体,构建3α-HSD的原核表达系统。经IPTG诱导后,得到了具有酶活性的融合蛋白,细菌总蛋白的表达量为0.73g/L,其中融合酶蛋白占16.4%,活性达1.38×10.5U/L。利用融合蛋白N末端的Histag,经金属螯合亲和层析纯化后,得到了纯度较高的融合酶蛋白,酶蛋白的得率为68%,比活性为194.7U/mg。凝血酶切除Histag后,经质谱鉴定,重组蛋白的分子量为26.5kD,与理论推测值基本相同。25℃以雄酮为底物,以NAD+和thioNAD+为辅因子时,融合蛋白参与酶促反应的最适pH分别为10.5和9.4。37℃条件下酶促反应较快,25℃时的反应速度只有37℃时的52％,Q10（25℃～35℃）为1.7。25℃、pH105、以雄酮和各级胆汁酸为底物、NAD+为辅因子时,融合酶蛋白的动力学常数Km位于4.2～51.1μmol/L范围内。融合酶蛋白发挥催化作用并不需要金属离子的参与,而Fe3+、Fe2+、Zn2+则抑制酶活性,反应体系中加入EDTA也并不影响酶的活性。活性和纯度均较高的融合蛋白3α-HSD的获得及其生物学性质的研究,为血清总胆汁酸酶循环法测定的建立奠定了基础。     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

糖皮质激素对人绒毛膜滋养层细胞11β-HSD1的调节

目的：研究糖皮质激素对11β-羟基类固醇脱氢酶I型(11β-hydroxysteroid dehydiogenase type1,11β-HSD1)还原酶活性和mRNA表达的调节。方法：利用原代培养的人类绒毛膜滋养层细胞,运用免疫细胞化学染色方法、放射性酶活性测定及Northem印迹杂交技术,结合图像分析技术检测11β-HSD1 mRNA的表达量。结果：11β-HSD1和糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)免疫活性样物质共存于原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中,人工合成的糖皮质激素——地塞米松对绒毛膜滋养层细胞11β-HSD1还原酶活性和mRNA表达具有诱导作用,此诱导作用可以被GR阻断剂RU486所阻断。结论：糖皮质激素与GR结合后上调绒毛膜滋养层细胞11β-HSD1酶活性和mRNA表达。     

大鼠海马神经元内11β-HSD1和GR的共存及其意义

本研究旨在探讨糖皮质激素代谢酶-11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅰ型（11β-HSD1）和糖皮质激素受体（GR）在大鼠海马神经元内的共同分布及其意义。用免疫细胞化学方法研究显示,海马神经元内不仅存在11β-HSD1免疫反应物质,还存在GR免疫反应物质,而且11β-HSD1与GR共存于同一个海马神经元内,用Western印迹杂交和薄层层析（TLC）方法研究表明,地塞米松（DEX）可以促进11β-HSD1与GR共存于同一个海马神经元内,用Western印迹杂交和薄层层析（TLG）方法研究表明,地塞米松（DEX）可以促进11β-HSD1蛋白表达及其酶的活性,利用11β-HSD1基因启动子区序列构建的以CAT酶为报告基因的pBLCAT6质粒转染PC12细胞,证实DEX能够促进CAT酶的表达。以上糖皮质激素的作用均可为GR受体阻断剂RU38486所阻断,结果提示;糖皮质激素（GC）与GR结合后,可以作用于与其共存的11β-HSD1基因启动子区,使11β-HSD1表达增加,从而使更多的GC代谢产物转化为有活性的GC,此机制可能与保证GC在海马神经元内与亲和力较低的GR结合有关。     

3β-羟基类固醇脱氢酶在甾体激素生成组织中的功能

3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)是一类依赖于NAD+/NADP+接受质子的氧化还原酶。在胆固醇转化为类固醇激素中起限速酶作用,在体内广泛分布。3β-HSD催化环戊烷并多氢菲结构3号位CH-OH转化为C=O,是参与肾上腺糖皮质激素合成中唯一非细胞色素P450家族中的酶;3β-HSD催化孕烯醇酮生成孕酮、17α-羟孕烯醇酮转化为17α-羟孕酮、雄烯二醇生成睾酮等多步化学反应。3β-HSD通过参与细胞内甾体激素生成,进而在生殖系统中发挥功能。此外,3β-HSD在脑、脂肪组织中也有较强表达,本文就3β-HSD在甾体激素生成组织中的功能及其临床意义进行总结。     

小鼠17β-hsd10的克隆、表达及双抗夹心ELISA方法的建立

原核表达小鼠17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hsd10),制备抗17β-hsd10多克隆抗体,建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。采用RT-PCR技术克隆得到小鼠肝脏17β-hsd 10基因,构建原核表达体系p ET15b-17β-hsd10/Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并优化表达条件;目的蛋白用His融合蛋白纯化柱(His-Binding-resin)纯化并免疫BALB/c小鼠和新西兰大耳白兔,免疫血清总Ig G采用硫酸铵沉淀法纯化,用获得的高效价鼠源和兔源两种多克隆抗体,建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法。表达蛋白约为29.5 k Da,纯化后浓度为1.5 mg/m L,鼠源和兔源多克隆抗体效价分别为1.25×104和2.5×104,建立的检测方法对于多种羟基类固醇脱氢酶无交叉反应,特异性良好,可检出含量约为0.05-0.1μg/m L的阳性血清。建立的17β-hsd10双抗夹心ELISA方法,简便、快速、敏感,适合实验室研究科研广泛应用。并可能为检测阿尔茨海默病提供新思路和方法。     

全合成3α-羟类固醇脱氢酶基因密码子优化及酶性质研究

以NCBI报道的Comamonas testosteroni ATCC11996中3α-羟类固醇脱氢酶基因(3α-hydroxysteroid dehydrogenase gene,3α-hsd,AF092031.2)为模板,通过改变碱基序列但不影响酶的氨基酸序列,将该基因相对于大肠杆菌的密码子适用指数由0.78提高到0.87,GC含量由原来的63.17降低到56.46,大幅度减少了GC簇及寡聚A和T局域的存在,提高3α—hsd的可表达性。全合成基因定向克隆到pET28a载体中,并转化至大肠杆菌B121(DE3)中表达。采用乳糖诱导后,SDS—PAGE检测在约27 kD处有一高效表达的蛋白条带。采用Ni螯合柱分离纯化3α-HSD,获得了较高纯度及较高的产率。酶学性质初步分析表明,全基因合成表达的3α-HSD的性质与原始的3α-HSD基本相同。     

人17β羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)基因在家蚕系统中的表达(简报)

17β羟类固醇脱氢酶(17β-hydroxystero-id dehydrogenase,17β-HSD)能催化人体内类固醇性激素的形成和转化,例如它可以催化雌二醇与雌酮,雄烯二酮与睾酮之间的相互转化反应。人体内17β-HSD在胎盘组织含量最为丰富,催化17β-雌二醇等雌激素的生成,同时这些激素能够刺激乳腺瘤的增生。因此,如何抑制17β-HSD酶的过高活性,减少癌变发生的可能性,已成为目前这类癌症治疗的一个重要研究目标。目前,从胎盘组织中提取17β-HSD的方法,产量低,比活小,周期长,     

胎盘11β-HSD与病理妊娠的研究进展

病理妊娠包括胎儿生长受限、妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病等,是严重威胁母婴健康的疾病。对病理妊娠机制的深入研究,有助于我们在临床上更好的诊治。妊娠期间胎盘分泌的糖皮质激素代谢酶11β-羟基类固醇脱氢酶(11β-HSD,11β-hydroxysteroid dehydrogenase)的异常表达被认为与病理妊娠有关。11β-HSD分为11β-HSD1和11β-HSD2两种亚型。胎盘11β-HSD2为避免胎儿暴露于过量的糖皮质激素水平提供了屏障作用,保证胎儿正常生长发育。胎盘11β-HSD2表达和活性降低与胎儿生长受限有关。胎盘11β-HSD2的活性在妊娠期高血压疾病患者中是降低的,妊娠期高血压疾病也可导致胎盘11β-HSD2活性的进一步降低。胎盘11β-HSD1表达增加与胰岛素抵抗有关,可能参与妊娠期糖尿病的发病。针对胎盘11β-HSD的活性调节将是病理妊娠治疗的重要措施之一。     

反刍兽月形单胞菌β-木糖苷酶基因在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

β-木糖苷酶(β-xylosidase,酶编号EC 3.2.1.37)是木聚糖降解酶系中的重要组成部分。本研究以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主菌尝试表达反刍兽月形单胞菌Selenomonas ruminantium中的β-木糖苷酶基因Sxa。根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、mRNA二级结构、GC含量和稀有密码子,对Sxa基因进行优化;通过基因合成技术获得了全长基因mSxa并构建重组酵母表达载体pPIC9K-mSxa;以BglⅡ酶切重组载体pPIC9K-mSxa,电击转化将m Sxa基因导入毕赤酵母GS115中,获得的转化子经过表型和遗传霉素G418抗性筛选、PCR鉴定,得到表达β-木糖苷酶基因的工程菌GS115-pPIC9K-mSxa;通过活性测定获得高效表达β-木糖苷酶的重组酵母,并对重组β-木糖苷酶的酶学性质进行了初步研究。结果表明,重组β-木糖苷酶的分子量约为66 kDa。在发酵罐水平表达的酶活性达到了287.61 IU/mL。对酶学性质研究显示,该酶在温度为40-60℃,pH为5.0-7.0时较稳定,其最适反应温度和pH分别为55℃和6.0,专一性地作用于β-木糖苷键。Mn~(2+)和Ca~(2+)对该酶具有激活作用,而Fe~(3+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Mg~(2+)、EDTA及SDS抑制其酶活性。本研究首次将反刍兽月形单胞菌的β-木糖苷酶基因转化到毕赤酵母中获得表达,并具有较高活性,为进一步工业化应用奠定了基础。     

新型海洋源β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的表达与酶学性质

从海洋环境β-半乳糖苷酶基因出发,采用毕赤酵母表达体系,构建产β-半乳糖苷酶的基因工程菌,并对重组酶酶学性质进行表征。结果发现:海洋源β-半乳糖苷酶具有优良的乳制品用酶特性,该重组酶的最适pH为7.0~8.0,最适温度为45℃,在50℃以下孵育1 h可保持55%以上的活力,能耐受Fe~(2+)、Na~(2+)、K~(2+)、Ca~(2+)等多种金属离子。宽广的pH、温度、金属离子稳定性,以及低温活性赋予该酶良好的乳制品用酶特性。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中氧化17β-雌二醇的17β-羟甾类脱氢酶2及其转录调控因子AraC的鉴定

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2(17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水平;我们在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中异源表达了17β-HSD2和AraC基因,并利用金属离子亲和层析法纯化获得了重组蛋白;我们体外表征了17β-HSD2的酶学性质,利用高效液相色谱鉴定了其产物;通过电泳迁移转移法和DNase酶I足迹试验,我们鉴定了重组蛋白AraC的结合能力与结合位点。[结果]17β-HSD2和AraC可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对结果表明17β-HSD2含有短链脱氢酶/还原酶(SDR)和β-羟甾类脱氢酶的保守结构与残基。该酶以NAD+为辅助因子,在C17位点氧化17β-雌二醇,其Km值为0.082 mmol/L,Vmax值为56.26±0.02μmol/(min·mg);5 min内可转化97.4%以上的雌二醇。转录调控因子AraC可直接结合17β-hsd2基因启动子区的特异位点;雌二醇与雌酮可解除这一结合,启动17β-hsd2基因转录;过表达AraC蛋白可抑制17β-hsd2的转录。[结论]假单胞菌SJTE-1的17β-羟甾类脱氢酶2可高效催化17β-雌二醇转化,并受到转录因子AraC的直接调控。本工作可推进细菌的雌激素降解酶学机制与调控网络研究。     

马铃薯α-淀粉酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其酶学性质的研究

采用RT-PCR法扩增马铃薯夏波蒂的α-淀粉酶成熟肽基因,将其亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9k上,SacII线性化重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,构建重组酵母GS115/pPIC9k-amy,利用锥虫蓝法筛选获得高活性转化子(GSamyA5),以终浓度为0.5%甲醇诱导该重组菌表达α-淀粉酶,通过Ni~(2+)-NTA agarose亲和层析纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明:该酶的最适反应温度为45℃,40~50℃酶活较稳定,保温50 min,残留相对活力达92.6%;最适反应pH值为6.0,并在pH 6.0~7.0范围内酶活保持稳定。Ca~(2+)、K~+可促进酶反应,以Ca~(2+)影响为最,相对酶活力提高到125%;Cu~(2+),Fe~(2+),Fe~(2+),Zn~(2+)对该酶有显著抑制作用;Mn~(2+),Mg~(2+)对酶有微弱抑制作用,Li~+、Na~+对酶活影响不大。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中氧化17β-雌二醇的17β-羟甾类脱氢酶2及其转录调控因子AraC的鉴定（英文）

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2 (17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水平;我们在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中异源表达了17β-HSD2和AraC基因,并利用金属离子亲和层析法纯化获得了重组蛋白;我们体外表征了17β-HSD2的酶学性质,利用高效液相色谱鉴定了其产物;通过电泳迁移转移法和DNase酶I足迹试验,我们鉴定了重组蛋白AraC的结合能力与结合位点。[结果]17β-HSD2和AraC可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对结果表明17β-HSD2含有短链脱氢酶/还原酶(SDR)和β-羟甾类脱氢酶的保守结构与残基。该酶以NAD+为辅助因子,在C_(17)位点氧化17β-雌二醇,其K_m值为0.082 mmol/L,V_(max)值为56.26±0.02μmol/(min·mg);5 min内可转化97.4%以上的雌二醇。转录调控因子AraC可直接结合17β-hsd2基因启动子区的特异位点;雌二醇与雌酮可解除这一结合,启动17β-hsd2基因转录;过表达AraC蛋白可抑制17β-hsd2的转录。[结论]假单胞菌SJTE-1的17β-羟甾类脱氢酶2可高效催化17β-雌二醇转化,并受到转录因子AraC的直接调控。本工作可推进细菌的雌激素降解酶学机制与调控网络研究。     

山羊胎儿肝脏3β-羟基甾体脱氢酶/△~4-△~5异构酶(3β-HSD)cDNA的克隆(英文)

3β-羟基甾体脱氢酶/△~4-△~5 异构酶(3β-HSD)是哺乳动物体内广泛存在的一类参与甾体激素代谢的氧化还原酶, 且具有异构酶活性。3β-HSD 催化3β-羟基甾体的脱氢及随后的△~5-3-甾酮产物的异构化反应, 以产生α, β-非饱和酮, 3β-HSD 在甾体激素代谢中起着重要作用。本文以胎羊肝为材料, 首次获得了山羊胎肝的3β-HSD 的cDNA, 并进行了3β-HSD在肝脏组织的表达分析。参照牛、啮齿类的3β-HSD cDNA的高同源区设计引物。 以2～3月雌性胎羊肝脏mRNA为模板, 经RT-PCR获得416 bp cDNA片段 (Fig.1), 然后以其为探针筛选胎羊肝λgt 10 cDNA文库 最后获得3'-端缺失的3β-HSD cDNA 克隆,并推导了其氨基酸序列 (Fig.2)。同源分析表明山羊胎肝3β-HSD的氨基酸序列与牛卵巢、人Ⅰ型和小鼠Ⅰ型3β-HSD的同源性分别为96%、78%和73% (Fig.3)。提取雌性胎羊、雄性胎羊及母体羊肝脏的总RNA, 同时做RT-PCR,表明3β-HSD 在不同个体肝脏中的表达存在差异,雌性胎羊和母体孕羊肝脏中都有3β-HSD的表达,而在雄性胎羊肝脏中,则未检测到表达信号(Fig.4)。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中转化17β-雌二醇的3-酰基-ACP还原酶的鉴定与功能研究（英文）

【目的】假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚。本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶(ANI01589.1),并对其进行了功能研究。【方法】首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白。体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定了该酶的催化产物。【结果】3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6mg/L。蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶(SDR)的2个共有区域和多个保守残基。该酶以NAD~+为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其Km值为0.071 mmol/L, k_(cat)值为2.4±0.06/s~(–1),5 min内可转化超过95.8%的雌二醇。该酶的最佳反应温度为42°C,最佳pH为8.0。不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg~(2+)和Mn~(2+)可增强其酶活性。【结论】这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用。     

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的克隆与重组表达及其酶学性质研究

【目的】克隆嗜热脱氮土壤芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglB,在E.coli中异源表达,纯化并研究其酶学性质。【方法】利用PCR技术从嗜热脱氮土壤芽孢杆菌的基因组DNA中克隆得到bglB基因,将该基因克隆到表达载体pGEX-2TL上并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对纯化后的β-葡萄糖苷酶的酶学性质及寡聚状态进行分析。【结果】重组表达的β-葡萄糖苷酶最适温度为65°C,最适pH为7.0,能在pH 5-10、60°C下稳定存在4 h,并能在较高的离子强度(880 mmol/L K+)下发挥其功能。Al3+离子对其有强烈的激活作用,Co2+有一定的抑制作用。最适反应条件下该酶比活力为0.043 IU/mg。该酶具有多种寡聚体形式,这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。【结论】获得一个耐热耐盐的中性β-葡萄糖苷酶,为进一步研究β-葡萄糖苷酶的催化作用机理,提高其热稳定性提供一定的帮助。     

肾上腺皮质细胞的单层培养方法

目的: 体外单层培养大鼠肾上腺皮质细胞,以便为肾上腺皮质细胞的有关实验提供必要条件.方法: 采用胶原酶Ⅱ、透明质酸酶消化等步骤分离Wistar大鼠的肾上腺皮质细胞;分离的细胞于含15% NBS的DMEM培养基、37℃、5% CO2的环境中培养,3β-羟基类固醇脱氢酶特异染色鉴定.结果: 培养的肾上腺皮质细胞呈梭形,胞体较大、有少量突起,3β-羟基类固醇脱氢酶特异染色后胞体显著着蓝色.肾上腺皮质细胞不呈典型的"S"形增殖趋势,适于作原代培养.上皮样细胞和成纤维样细胞同时存在.结论: 通过细胞形态观察及特异酶染色鉴定,本文培养的细胞为大鼠肾上腺皮质细胞.     

溶藻弧菌中酯酶基因的克隆表达及其酶学性质研究

旨在克隆溶藻弧菌中的酯酶基因,并在大肠杆菌中异源表达,研究酯酶酶学性质。从溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)7S-1的基因组DNA中克隆得到酯酶基因est Z,将该基因连接入表达载体p ET28a,并在Escherichia coli BL21(DE3)中表达,对纯化后的酯酶蛋白进行酶学性质分析。结果显示,表达菌株E.coli BL21-28a-est Z可高表达具有活性的酯酶,在18℃添加0.4 mmol/L IPTG的LB培养基中诱导22 h,酯酶的比酶活可达5.42 U/μg;重组表达的酯酶Est Z最适反应温度为25℃,最适pH为9.0。10 mmol/L Na+和Mg~(2+)对其有较好的激活作用;Cu~(2+)、Ni~(2+)、Co~(2+)对该酶活性有较大抑制。该酶对多种有机溶剂及表面活性剂具有一定的耐受性,同时具有较高的耐盐性。对溶藻弧菌中的酯酶进行研究为该菌更好的应用于生物脱墨技术奠定了理论基础。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。