双峰驼重链抗体组库的基本特征研究

目的:利用二代高通量测序技术,了解双峰骆驼循环B细胞重链抗体(HCAbs)组库的组成和基本特征。方法:通过分离骆驼外周血单核细胞(PBMC),提取m RNA,利用多重PCR和Illumina Mi-seq高通量测序技术对三头双峰骆驼的重链抗体可变区进行深度测序,分析了重链抗体组库V、J基因组成、重排时末端基因删除数和V-J基因配对率,以及CDR3的长度、香农多样性指数(Shannon index)、氨基酸组成分布等基本特征。结果:鉴定出平均每头骆驼130000条有效数据和67561条独特CDR3序列,HCAbs含量较高的V基因为IGHV1S45、IGHV1S50和IGHV1S52,J基因为IGHJ4和IGHJ6,所对应的V-J基因配对含量大于40%;CDR3的长度主要分布在10-30个氨基酸之间,含量较高的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸;CDR3区域70%以上的平均长度为20个氨基酸长度,其中V基因长度为3 bp,J基因长度分布在1-18 bp。结论:双峰骆驼B细胞重链抗体组库由巨大的、不均匀分布(以少数VJ基因克隆占大多数)的和具有高度多样性的多克隆抗体构成,较长CDR3和富含丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸是HCAbs的重要特征。     

RNA剪接体辅助激活诱导的胞苷脱氨基酶作用

体细胞高频突变和类别转换重组增加抗原激活B细胞中合成的免疫球蛋白的亲和力和多样性。Neuberger及其同事鉴定了一种RNA剪接因子CTNNBL1,可以特异性地与激活诱导的胞苷脱氨基酶（activationinduced deaminase,AID）相互作用,继而影响体细胞高频突变和类别转换重组。AID可以在编码免疫球蛋白的基因片段上将脱氧胞嘧啶脱氨基,从而触发抗体的多样化。CTNNBL1（又称为nuclear—associated protein,NAP）可以识别AID中由39～42氨基酸构成的片状结构。     

Asia 1型口蹄疫病毒抗原表位突变株的构建及其生物学特性分析

为了研制口蹄疫抗原表位突变标记疫苗,本研究以含有Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)c DNA全长的感染性克隆p Asia 1-FMDV作为骨架,将3D蛋白中第27位氨基酸的H和31位的氨基酸N分别突变成Y和R,从而突变3D蛋白的一个抗原表位,将构建的带有突变表位的重组质粒转染BHK-21细胞,成功拯救出一株突变FMDV。经比较后发现,重组病毒的生物学特性与亲本毒株相似。病毒中和试验结果显示,抗重组病毒的血清与亲本病毒有良好的反应性。Western blotting结果表明重组病毒诱导的抗体能与突变的表位合成肽反应而不与野生型病毒的表位合成肽发生反应,从而区分重组病毒与亲本病毒。综上所述,这株抗原表位突变FMDV有望作为口蹄疫标记疫苗候株进一步评估。     

扎伊尔型埃博拉重组糖蛋白GP-Fc基因疫苗构建及免疫原性研究

本实验将基于埃博拉病毒表面糖蛋白抗原GP基因序列,按照哺乳动物密码子使用频率优化,并与人IgG恒定区构建融合蛋白GP-Fc基因序列,重组蛋白序列插入基因疫苗载体pVR中,构建重组蛋白基因疫苗pVRmodGP-Fc。通过基因疫苗导入系统免疫小鼠,用间接ELISA和间接免疫荧光对抗体效价进行评估。实验结果显示,重组蛋白GP-Fc的基因疫苗可以很好的刺激小鼠产生特异性抗体,免疫周期结束后,小鼠血清中结合效价终点达到高剂量组1∶300 000及低剂量组1∶180 000,同时血清中的抗体可以很好地结合表达GP抗原的细胞表面,表现出很强的荧光信号。通过该研究我们验证重组蛋白基因疫苗pVR-modGP-Fc可以很好地诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的抗原特异性IgG,具有较好的免疫原性。     

急性弛缓性麻痹病例中Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒变异株基因特征分析

研究Ⅱ型脊髓灰质炎(脊灰)疫苗变异株的基因特征,为我国使用口服脊灰减毒活疫苗/脊灰灭活疫苗使用策略,维持无脊灰状态和全球最终消灭脊灰提供科学依据。根据型内鉴定的检测结果,从2000~2001年AFP病例分离到的Ⅱ型脊灰疫苗变异株中选取有聚集性的5株病毒进行全基因组序列测定(贵州省3株、山东省2株),并进行核苷酸、氨基酸同源性分析。贵州省3株病毒全基因组序列完全一致,但与SabinⅢ型病毒发生重组,重组区域在3A区(nt5343~5353);与疫苗株相比,Ⅱ型区域变异10个碱基,其中VP1区变异4个,与SabinⅡ型株核苷酸同源性为99·56%,氨基酸同源性99·34%;Ⅲ型区域变异9个碱基。山东省2株病毒全基因序列共享16个突变位点,没有发生重组,与SabinⅡ型株相比,VP1区分别变异7个和4个碱基,核苷酸同源性分别为99·22%和99·56%,氨基酸同源性分别为99·0%和99·67%。上述5株病毒在重要的减毒位点nt481、nt2909均发生突变。此研究中5株病毒分属于两个不同的传播链,但是共享nt481、nt2909、nt2992三个突变位点,这3个突变位点不在重组区域内,他们的共同作用可能是影响病毒传播力的重要因素,但目前尚无证据证明脊灰疫苗病毒型间重组会增加病毒的毒力及传播力。     

鸡体内疫苗抗体选择压对H9N2亚型禽流感病毒内部基因演化的影响

在我国,接种疫苗是防控H9N2亚型禽流感(Avain influenza,AI)流行的主要措施。为了解H9N2亚型禽流感病毒(Avain influenza virus,AIV)在疫苗抗体选择压下的遗传变异情况,本研究选择A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2,F/98)禽流感病毒分别在有和没有疫苗抗体选择压的SPF鸡体内连续传代。为了减少混合病毒对研究结果的干扰,我们建立了三个独立传代系列。结果表明,母本病毒在经过有和没有疫苗抗体选择压下连续传代后,两种模式下的传代病毒的内部基因都发生了基因突变。与没有疫苗抗体选择压下的传代病毒相比,有疫苗抗体选择压下的传代病毒氨基酸突变数量明显减少(P0.05),肺组织分离到的传代病毒的突变氨基酸数量显著多于相同传代条件下气管中分离到的传代病毒的氨基酸突变数量(P0.05)。此外,疫苗抗体选择压下的传代病毒V9L和V9T有4个特有突变:PB2(H366Q、A322E)和M(P154A、A246Q),没有疫苗抗体选择压下的传代病毒N9L和N9T有9个相同突变:PB2(I298Q、E526R)、PB1(T348A)、PA(L336M)、NP(G52A、L187G)、M(H23I)和NS(S81L、H85S),所有第9代次的传代病毒相同的突变有2个:PB2(R327K、Y369S)。值得注意的是,相比母本病毒没有疫苗抗体选择压下的传代病毒对鸡胚的感染力显著提高(P0.01),而有免疫选择压下的传代病毒对鸡胚的感染力相比母本病毒变化不大(P0.05),但丧失了致死鸡胚的能力。本研究对了解禽流感病毒在疫苗的选择压力下的演化规律,以及理解疫苗对病毒进化的影响具有重要参考意义。     

云南省昆明地区番茄斑萎病毒核衣壳蛋白和运动蛋白变异分析

为了明确对番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)免疫的番茄YNAU335自交系表现出TSWV感病症状(抗性被打破)的原因,在排除YNAU335自交系不纯和或混杂其它感病番茄材料的因素外,选取96172I(感病)和YNAU335(抗性被打破)自交系感病植株,进行TSWV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因的RT-PCR检测,并对阳性克隆进行基因测序分析。结果表明:(1)2个自交系中均克隆出TSWV的NP和MP基因,共获得5条NP(登录号:MK628735～MK628739)和3条MP(登录号:MK883723、MK883724和MK887284)多态性基因序列。(2)96172I感病材料中克隆出以上所有基因序列,YNAU335感病材料中克隆出其中的3条NP和1条MP基因序列。(3)对YNAU335中TSWV特有的NP和MP氨基酸突变位点进行分析,结果发现4个特异突变位点可能与打破YNAU335抗性有关,4个突变位点分别为:NP 18位氨基酸G突变为V,36位T突变为I,39位L突变为R,MP 274位E突变为K。(4)系统发育分析显示,5条NP和3条MP与云南省已登记的NP和MP聚类在不同的分支,表明云南省昆明地区TSWV存在丰富的遗传多样性。     

流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短),pET32a(+)/NA(截短),pGEX4T-1/HA,转化大肠杆菌BL21/Rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果显示,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western blotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,可为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供参考。     

2021年海南省2例轻型新冠肺炎病例相关新冠病毒德尔塔变异株的分子特征分析

本文对2021年海南省2例感染引起本土轻型新冠肺炎病例的新冠病毒进行全基因组测定和序列分析,研究该病毒的分子特征和分子进化规律。通过荧光定量RT-PCR法检测ORF1ab和N靶基因,应用Illumina公司的MiSeq深度测序平台进行全基因组序列测定,使用MEGA 10.1.8和DNASTAR 7.0.1生物信息学软件进行多序列比对和分析,并采用邻位归并法（Neighbour-joining）绘制系统进化树。2例新冠病毒（HN0801和HN0802）均属于德尔塔变异株,与武汉参考序列（NC＿045512）基因序列相似性分别为99.7%和99.8%,系统进化树显示它们位于同一进化分支（B.1.617.2）的不同簇上,共有45个核苷酸突变位点,引起38个氨基酸位点改变,其中34个错义突变、6个同义突变、4个氨基酸位点缺失;刺突（S）糖蛋白发现B.1.617.2谱系共同突变特征L452R、T478K,以及T19R、G142D、D614G、P681R、D950N、R158G关键变异位点。HN0801同2021年7月江苏省南京市代表株基因序列100%相似,而HN0802与南京市疫情代表株基因组相...     

三个HIV-1广谱中和表位与HBV S抗原融合表达可诱导小鼠特异性抗体应答

为了增强HIV-1交叉中和表位的免疫原性,本研究使用PCR克隆技术将HIV-1三个具有一定广谱中和活性的线性抗原表位ELDKWA(简称2F5)、NWFDIT(简称4E10)和GPGRAFY(简称447-52D)基因分别融合到HBV S基因的3味端,构建了分别表达这三种融合基因的天坛株重组痘苗病毒疫苗RVJ1175S-2F5、RVJ1175S-4E10和RVJ1175S-447-52D,使用这三种重组痘苗病毒感染的细胞培养上清液经分离纯化制备了三种相应的蛋白亚单位疫苗PS-2F5、PS-4E10和PS-447-52D,对重组痘苗病毒和亚单位疫苗中三种融合抗原的生物学及免疫学特性进行了比较研究.PCR和测序结果表明,三种融合基因序列正确重组到痘苗病毒TK区,HBsAg的ELISA检测表明三种融合蛋白有效表达并分泌到细胞培养上清液中,SDS-PAGE凝胶电泳显示三种纯化后的融合蛋白均含分子量为23kD和27kD两种典型HBsAg条带,Western blot证明这两个条带均能与HBsAg抗体反应,并分别能与三种表位相应的HIV-1单抗2F5、4E10和447-52D反应.小鼠免疫结果显示,三种重组痘苗病毒疫苗和三种蛋白亚单位疫苗均能诱发较高水平的HBsAg抗体和相应HIV-1交叉中和表位抗体,蛋白亚单位疫苗诱生的这两类抗体均明显高于对应的重组痘苗病毒疫苗.这些结果为进一步研究三种表位抗体的中和活性和通过不同类型疫苗联合免疫进一步增强其免疫效果研究奠定了基础.     

4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析

根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析.序列比较显示,不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守,它们相互间氨基酸序列的同源性在96.5%～99.7%之间.4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变;3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变,这两处点突变是国内近几年分离株所特有的,国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化.分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性,但是这些规律性还有待进一步研究.     

SARS-CoV-2毒株S蛋白突变及其影响的生物信息学分析

2019年12月,由SARS-CoV-2感染引起新型冠状病毒肺炎在武汉暴发。世界卫生组织(WHO)于2020年3月11日宣布新冠肺炎疫情已构成全球性大流行,给世界各国造成了巨大的人员伤亡和经济损失。SARS-CoV-2的S蛋白是核衣壳表面的刺突蛋白,介导病毒与细胞受体结合及膜融合,是疫苗、治疗性抗体的研发以及临床诊断的关键靶点。为了分析SARS-CoV-2表面S蛋白的突变情况,我们以武汉分离株Wuhan-Hu-1(GenBank登录号:MN908947.3)为标准株,利用生物信息学方法,对SARS-CoV-2 S蛋白的突变位点及其对蛋白质结构和功能的影响进行分析。截至2020年4月17日,GenBank数据库中有1 002株SARS-CoV-2毒株,其中仅有12株病毒S蛋白氨基酸序列发生了突变。其中一些突变可影响S蛋白的理化性质和二级结构。R408I位氨基酸位于受体结合结构域(RBD)内且位于蛋白表面,突变可能会影响RBD结构。48、74、181、221、655位突变氨基酸位于预测的B细胞线性表位内,其中74、181、655位氨基酸突变对B细胞线性表位结构和性质产生较大影响。分离自人、...     

1996～2005年中国H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶基因特性分析

测定了1996~2005年间在中国分离并保存的395株H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列,应用生物信息学工具进行了分析。结果表明:NA基因序列的进化树表现为一主要进化主干伴随多侧分支进化,同一年份的毒株可以分为几个分支存在;疫苗株在NA基因序列进化树上存在明显的滞后现象;NA没有氨基酸的丢失与插入;抗原决定簇大部分位点保守且各抗原决定簇之间的变异情况各有特点,其中197~199位、431~434位和339~347位点的变异频率最高,而153位、328~336位、367~370位、400~403位抗原决定簇的氨基酸变异频率相对比较小;除了抗原决定簇外还有些氨基酸位点的变异频率很高,它们分别是18、23、30、93、143、208、216、221、249、265、267、307、385、437位氨基酸,其中143位和267位这两个位点的变异频率高于抗原决定簇位点,具体生物学意义还需要进一步研究;NA蛋白的酶活性中心位点高度保守;二硫键和糖基化位点保守。NA基因的这些特点为流感的预防、控制以及NA抑制剂药物的应用提供了一定的参考依据。     

基于易错PCR技术的红酵母D-氨基酸氧化酶的定向进化

采用易错PCR技术对来源于红酵母Rhodotorula gracilis的D-氨基酸氧化酶基因(RgDAAO)进行突变,构建并优化了突变株文库;结合48深孔板的高通量筛选方法,获得突变株M3217,其V_(max)相对于野生型提高了16.8%。对测序结果进行分析,发现突变酶基因序列中有5处点突变,其中3处发生了氨基酸置换,分别为:D242V/Q253R/D304V。利用Swiss-Model对突变株M3217进行三维结构模拟,结果显示所有突变位点都不在催化活性中心的附近,特别是V304的位置在连接F5和F6两个β折叠股的长loop环上。推测D304V这一突变位点很可能增强了RgDAAO二聚体形态的稳定性,或是增强了与辅酶FAD的结合能力,从而间接提高了全酶的催化活力。     

阿尔茨海默病重组4Aβ15-TF亚单位疫苗的免疫原性研究

目的:研究重组嵌合抗原4Aβ15-TF的免疫原性,评估其作为亚单位疫苗的可行性。方法:设计合成了重组融合蛋白4Aβ15-TF的基因序列,插入原核表达载体p TIG-Trx中,用大肠杆菌表达并纯化重组嵌合抗原4Aβ15-TF,与铝佐剂配制成亚单位疫苗免疫C57BL/6小鼠以研究其免疫原性。结果:重组嵌合抗原4Aβ15-TF免疫小鼠后刺激其产生了抗β淀粉样蛋白(Aβ)42的特异性抗体,抗体滴度4次免疫后达到较高水平,抗体亚型主要为IgG1型,并且伴随着少量的IgG2b,T淋巴细胞增殖实验证明免疫后产生了针对辅助性T细胞表位的T细胞免疫反应,不产生针对Aβ42的T细胞免疫反应。结论:大肠杆菌表达的重组嵌合抗原4Aβ15-TF具有良好的免疫原性,能够刺激产生高滴度的抗Aβ42抗体,并且产生的免疫反应主要为Th2型,无Aβ42特异的T淋巴细胞增殖反应。提示它可作为候选疫苗用于预防或免疫治疗阿尔茨海默病。     

4例乙肝表面抗原阴性乙肝病毒DNA阳性标本结果分析

目的 探讨4例乙肝病毒HBV-DNA阳性标本乙肝表面抗原(HbsAg)阴性的原因.方法 4例HbsAg阴性HBV-DNA阳性标本和1例HbsAg阳性HBV-DNA阳性标本,碱裂解法提取乙肝病毒基因组,采用巢式PCR扩增s基因全长片段,T-A克隆后测序,根据s基因序列推导氨基酸序列,分析乙肝表面抗原α决定簇区域的氨基酸变异情况.结果 与参考株比较,5例血清中HBV-DNAs基因均出现不同位点碱基突变,导致乙肝表面抗原α决定簇区域的氨基酸突变主要为:1号标本R122K、I126A、S143T;2号标本R122K、I126N、Q129N;3号标本R122K、I126S、T131N、M133T;4号标本R122K、I126S、T131N、M133T及5号标本的R122K.结论 乙肝表面抗原α决定簇区域126位氨基酸突变可能会影响HbsAg的检测结果.     

羊抑制素α亚基N端1-33序列肽段多聚体的构建及其表达纯化

为了提高短肽的免疫原性以制备短肽基因工程疫苗 ,将羊抑制素α亚基N端 1-33氨基酸残基片段的基因序列插入表达质粒pRSET A的BamHⅠ \SacⅠ位点之间构建重组质粒pR INH ,然后利用质粒中的一对同尾酶位点BamHⅠ \BglⅡ和下游的另一酶切位点HindⅢ ,经过简单的酶切后 ,将产物按各种组合连接 ,构建了抑制素串联 2至 6聚体基因。含3至6聚体基因的重组质粒pR 3INH、pR 4INH、pR 5INH和pR 6INH经IPTG诱导均能在大肠杆菌 (E .coli)BL21(DE3)中表达目的蛋白 ,分别占菌体蛋白的 6 %、6 %、7%和 8% ,且都以包涵体形式存在。结果说明 ,利用同尾酶切技术可以快速正确地构建短肽片段的串联多聚体重组质粒 ,为构建短肽半抗原的高免疫原性基因工程疫苗提供了新的思路。     

枯草芽胞杆菌BSD-2中ybfB基因敲除及生物信息学分析

在前期突变体库研究中发现,ybf B缺失的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis BSD-2丧失了其抑真菌活性。本研究通过敲除并恢复BSD-2中ybf B基因,进一步确认其缺失对菌株生物活性的影响,并利用生物信息学手段对其基因序列和编码蛋白质序列进行了预测分析。本研究成功敲除BSD-2菌株的ybf B基因,构建突变株B-Y-k,并成功构建其回复突变株B-Y,平板对峙实验结果显示突变其ybf B基因该菌株失去其抗真菌活性,回复突变株抗真菌活性恢复,表明该基因与其抗真菌相关。生物信息学分析显示该基因全长1 251 bp,编码416个氨基酸,具有12个跨膜螺旋区,为疏水性蛋白,推测该蛋白为疏水性跨膜转运蛋白,可能参与活性物质的转运。     

专访B细胞免疫学领域青年学者——孟飞龙研究员

多样化的免疫受体是适应性免疫系统“以万变应万变”识别外界各种各样抗原的分子基础。脊椎动物进化出V(D)J重排、抗体类型转换、体细胞高频突变及基因转换等多种受体基因多样化策略,构筑了全面的免疫屏障。在免疫细胞中,程序性DNA损伤在特定发育阶段集中发生并伴随多套应答通路的协同合作,最终将单一的抗体基因转变为无穷尽的DNA编码序列组合。     

利用定点突变法研究精氨酸脱亚胺酶活性的影响机制

精氨酸脱亚胺酶(ADI)是一种针对精氨酸缺陷型癌症(如:肝癌、黑素瘤)的新药,目前处于临床三期试验。文中通过定点突变技术分析了精氨酸脱亚胺酶的特定氨基酸位点对酶活力的影响机制。针对已报道的关键氨基酸残基A128、H404、I410,采用QuikChange法进行定点突变,获得ADI突变株M1(A128T)、M2(H404R)、M3(I410L)和M4(A128T/H404R)。将突变株在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,并对纯化获得的突变蛋白进行酶学性质研究。结果表明,突变位点A128T和H404R对ADI最适pH的提高,生理中性(pH 7.4)条件下的酶活力和稳定性的提高,以及Km值的降低均具有显著的作用。研究结果为阐明ADI的酶活力影响机制和蛋白质的理性改造提供了一定的依据。