金针菇信息素信号通路基因在子实体发育过程中的差异表达

【背景】子实体是食用菌的主要商品部位,也是真菌生殖生长的重要结构,其发育受到多种信号途径的调控。【目的】以金针菇(Flammulina filiformis)为材料,对转录组和基因组数据的信息素信号通路基因进行分析获得差异表达的基因,并对其在菌丝生长和子实体发育过程中的表达情况进行分析,以期为研究食用菌子实体发育提供参考。【方法】基于已有的金针菇基因组数据,注释了金针菇信息素信号通路。进一步通过转录组测序鉴定了该通路中参与金针菇子实体发育的关键基因,并对关键基因进行荧光定量PCR验证。【结果】cdc24和ste12基因在子实体发育不同时期的5个样品(原基、伸长期菌柄、伸长期菌盖、成熟期菌柄和成熟期菌盖)中的表达具有显著差异,使用荧光定量PCR技术进行验证与上述结果一致。【结论】cdc24和ste12这2个关键基因可能参与了金针菇子实体发育过程中的组织分化调控机制。     

金针菇菌柄发育的转录组与蛋白组分析

菌柄是金针菇等食用菌的主要商品部位,但其生长机制仍不明确。本研究对金针菇伸长期和成熟期菌柄进行了转录组联合蛋白组分析,结果显示,两样本显著性差异表达基因和蛋白分别为721个和61个,均以上调表达为主。GO（gene ontology）功能聚类分析表明：有72.41%的差异表达基因富集在催化活性（catalytic activity）条目下。细胞组分（cell part）和绑定结合（binding）条目同时富集了较多的差异表达基因和蛋白。KEGG通路富集分析显示：碳水化合物代谢通路（carbohydrate metabolism）和氨基酸代谢通路（amino acid metabolism）富集的差异表达基因较多。差异表达蛋白富集较多的通路是单环菌素生物合成（monobactam biosynthesis,ko00261）、链霉素生物合成（streptomycin biosynthesis,ko00521）和有机含硒化合物代谢（selenocompound metabolism,ko00450）等。内质网蛋白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum,ko04141）和MAPK信号通路（MAPK signaling pathway-yeast,ko04011）在转录组和蛋白组的KEGG富集分析中均为差异通路。本研究联合转录组和蛋白组数据筛选了40个金针菇菌柄发育中差异表达基因,为深入研究揭示食用菌菌柄发育过程提供候选基因。     

金针菇HMG-box转录因子鉴定及一个候选基因的差异表达分析

食用菌的原基形成受到环境因子和内源基因的共同调控,转录因子在其生长发育过程中能够起到关键作用。本研究在已测序金针菇单核菌株L11全基因组中鉴定到29个高速泳动蛋白（high-mobility-group box,HMG-box）转录因子编码基因。基于金针菇双核菌株H1123各发育时期转录组数据,筛选到一个与金针菇原基形成相关的HMG-box转录因子基因Fv-hmg。通过同源比对发现Fv-hmg的DNA序列在6个不同金针菇菌株中十分保守,一致性为98.38%,有92个SNP位点。克隆分析表明,该基因长度为1 517bp,含有一个内含子。该基因编码489个氨基酸残基的蛋白序列,含有一个HMG-box结构域。通过实时荧光定量PCR和转录组测序共同分析表明,该基因在金针菇原基时期的表达量比双核菌丝时期高达4倍以上,具有显著性差异（P<0.01）,由此推测该转录因子参与调控金针菇的原基形成。HMG-box转录因子Fv-Hmg在金针菇原基形成过程中的作用仍需进一步研究。     

金针菇几丁质合成酶基因家族鉴定及其表达分析

【背景】几丁质是真菌细胞壁的重要成分,由几丁质合成酶（chitin synthase,CS）催化合成。几丁质合成酶编码基因在大型食用真菌金针菇中的数量及表达规律尚不明确。【目的】探究几丁质合成酶基因在金针菇中存在的数量及其在子实体不同发育时期的表达规律,为其在大型真菌子实体生长发育过程中的功能研究提供基础。【方法】基于已有的金针菇菌株L11基因组数据,结合NCBI其他真菌CS序列鉴定金针菇中几丁质合成酶编码基因的数量,并对其进行生物信息学分析。进一步根据金针菇F19转录组数据以及实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术分析金针菇CS基因家族的表达规律。【结果】在金针菇单核体菌株L11的基因组中鉴定到9个几丁质合成酶基因,系统发育分析表明它们在子实体发育过程中的表达模式可分为4类（皮尔森相关系数=0.85）。【结论】金针菇CS基因家族表达模式在金针菇不同生长发育时期均存在差异,可能参与了子实体发育不同时期和组织的形态建成。     

MADS-box转录因子编码基因Vvrin1在草菇不同发育时期的表达分析

草菇是我国土特产出口的主要种类之一,而采后易开伞问题限制了草菇的贮藏及运输。MADS-box转录因子对植物的成熟衰老和真菌的子实体发育起到重要的调控作用。目前尚未见草菇MADS-box转录因子的相关报道。本研究通过生物信息方法及分子生物学的手段对草菇的基因组、转录组数据进行分析,获得了草菇MADS-box转录因子基因Vvrin1。该基因全长1 392bp,含2个内含子,编码419个氨基酸残基。该转录因子含有一个MADS-box结构域,序列与双孢蘑菇Agaricus bisporus、斑玉蕈Hypsizygus marmoreus和灰盖鬼伞Coprinopsis cinerea的MADS-box转录因子相似性分别为71%、67%和61%。通过表达谱数据及荧光定量PCR分析表明Vvrin1基因在草菇子实体伸长期菌柄的表达量出现高峰,具有极显著性差异（P<0.01）,推测该转录因子参与调控草菇菌柄的伸长,菌盖的开伞。这些结果为草菇成熟衰老（特别是开伞）的调控研究提供数据支持。     

甘蓝型油菜热激转录因子的克隆及表达分析

以甘蓝型纯系油菜为试材,用RT-PCR和RACE方法首次从油菜种子中获得油菜热激转录因子的cDNA全长序列,命名为BnHSFA4a,GenBank登录号为HQ435241。结果表明:该cDNA长1 667bp,编码1个具有389aa的蛋白质,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥热激转录因子AtHSFA4a编码的氨基酸序列间相似度为82%。对34条编码不同热激转录因子的氨基酸序列进行多重比对,结果在100～190aa处序列间氨基酸总相似性超过60%,显示出较高的保守性。构建原核表达载体并成功表达出预期蛋白。半定量RT-PCR结果显示,该基因的表达先于油菜肌醇半乳糖苷合成酶(BnGOLS1)基因,符合该基因调控BnGOLS1的假设。推测AtHSFA4a基因可能通过调控BnGOLS1的表达量进而在油菜种子脱水耐性获得过程中发挥一定的作用。     

海岛棉GbHCT基因克隆及生物信息学分析

克隆海岛棉木质素合成关键酶基因GbHCT全长cDNA序列,分析其在纤维不同发育时期的表达情况。根据海岛棉转录组数据中的HCT序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,通过生物信息学方法分析GbHCT的cDNA序列和氨基酸序列。通过分析转录组数据研究GbHCT在纤维不同发育时期的表达。从海岛棉中克隆了1个编码HCT的基因GbHCT,开放阅读框长度为1311bp,编码436个氨基酸,蛋白质分子量为48.58kD,等电点为6.03。GbHCT氨基酸序列中含有HTLGD和DFGWG2个保守基序。GbHCT氨基酸与陆地棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉HCT一致性较高,与其他植物中的HCT氨基酸的一致性为55.7%-60.7%。转录组数据分析发现GbHCT在纤维不同发育阶段都有表达,在5DPA的纤维中表达量最高,表明该基因可能参与棉花纤维的发育。     

金针菇细胞色素c过氧化物酶基因（ffccp）及其在菌柄伸长的差异表达初步分析

细胞色素c过氧化物酶（cytochrome C peroxidase,CcP）是细胞内H₂O₂的主要降解酶,参与真菌的氧化应答过程。本研究基于基因组数据获得一个金针菇细胞色素c过氧化物酶编码基因,命名为ffccp。该基因全长1 913bp,包含一个1 098bp的完整开放阅读框,编码365个氨基酸。生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白质（FfCcP）无跨膜结构和信号肽,不形成二硫键结构,亚细胞定位于线粒体上,具备血红素结合蛋白的保守位点。序列比对和进化分析结果显示,金针菇与糙皮侧耳Pleurotus ostreatus等大型真菌的CcP序列高度相似（相似度均超过70%）,属于CcP家族蛋白。RT-qPCR的检测结果显示,氧化胁迫和损伤胁迫均能诱导ffccp基因上调表达,但两种胁迫对ffccp表达的调控机制可能并不相同。进一步检测ffccp在子实体发育过程中的差异表达情况,发现ffccp在伸长期菌柄出现显著上调表达,且表达量与菌柄伸长速度的相关性达到0.998,为极强正相关。推测ffccp的上调表达可能有利于菌柄的伸长。     

油茶长链脂肪酰基CoA合成酶基因1(CoLACS1)分子特征与表达分析

长链脂肪酰基Co A合成酶(LACS)在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用。本研究以油茶(Camellia oleifera Abel)国家审定品种华硕(Camellia oleifera Huashuo)种仁转录组数据为基础,根据LACS基因Unigene序列设计引物,分离克隆了油茶LACS1基因全长c DNA序列,命名为CoLACS1(Gene Bank登录号:KJ960228),全长2114 bp,开放阅读框2088 bp,编码695个氨基酸;生物信息学分析显示CoLACS1具有3个B1ock,从分子特征可判断CoLACS1属于LACS家族;氨基酸同源比对显示与其他物种的LACS氨基酸序列具有较高的相似性,其中与拟南芥LACS7相似性为78%,与麻风树、大豆、毛果杨等物种LACS6(peroxisomal)相似性可达80%以上;对CoLACS1进行原核表达分析,构建的p ET30a-CoLACS1载体成功转化至BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达,菌液检测获得预测的目的蛋白(分子量约为76 k D);分析转录组数据中CoLACS1的Unigene序列RTKM值并对CoLACS1进行实时荧光定量PCR分析,结果表明CoLACS1在油茶华硕种子发育各时期平稳表达,表达丰度变化不大,荧光定量结果变化规律与转录组数据分析一致;同时分析华硕种仁不同时期含油率和脂肪酸成分变化,双变量统计分析发现CoLACS1表达模式与油茶油脂积累规律呈显著相关性。本研究为进一步研究油茶油脂积累与代谢的基因调控提供理论依据。     

甘薯苯丙氨酸解氨酶基因IbPAL的克隆与表达分析

本研究基于甘薯(Ipomoea batatas(L.) Lam.)与绿原酸合成代谢相关的转录组数据克隆了苯丙氨酸解氨酶基因Ib PAL,通过蛋白序列比对、系统进化分析、二级和三维蛋白结构预测、跨膜结构域以及启动子分析,对该基因的氨基酸序列和启动子序列的结构特征进行了解析;通过qRT-PCR技术分析该基因在不同甘薯品种的根、茎、茎尖和叶中的表达情况,并对其进行亚细胞定位验证。结果显示,Ib PAL的CDS序列全长2130 bp,编码709个氨基酸。其氨基酸序列与已知物种的氨基酸序列同源性在80%以上。Ib PAL蛋白以α螺旋和随机卷曲为主,具有1个可能的跨膜螺旋区。该基因启动子中包含多个顺式作用元件。表达模式分析结果表明,Ib PAL主要在茎和茎尖中表达,其在甘薯品种‘EC16’4个组织器官中的表达量均显著高于其他品种。亚细胞定位结果显示该基因在细胞膜和细胞核上均可以表达。     

金针菇外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因鉴定及在不同发育时期的差异表达

金针菇具有很高的营养与保健价值,菌柄长短决定金针菇的产量与品质,而菌柄伸长的相关作用酶及分子机理尚不清楚。前期草菇中发现外切-β-1,3-葡聚糖酶基因（exg2）可能与菌柄伸长相关,但在金针菇中尚没有exg基因的相关报道。本研究首先在金针菇全基因组中鉴定到3个外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因（分别命名为：Ffexg1、Ffexg2、Ffexg3）,并进行了克隆验证。进一步采用定量PCR对3个基因在金针菇不同发育时期及组织部位的差异性表达进行了分析。结果显示：Ffexg1只在菌柄中高表达,Ffexg2与Ffexg3在菌柄中表达量先上升后下降,在菌盖中呈逐渐上升趋势。3个Ffexg基因均在菌柄发生伸长的部位表达量较高,且在菇体水平放置后菌柄弯曲程度较大的部位表达量较高。结果显示金针菇exg家族3个基因存在时空差异性表达,在菌柄中伸长较快的时期及部位伴随着Ffexg基因的高表达。结合其功能预测,Ffexg家族基因可能作用于细胞壁成分β-1,3-葡聚糖链,从而在金针菇菌柄及菌盖发育中起作用。     

茶树单萜合成酶CsTPS基因的克隆及表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以‘铁观音’茶树品种的芽叶为供试材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树的1条单萜合成酶(TPS)基因全长cDNA序列,命名为CsTPS(GenBank登录号为KY829105)。CsTPS基因全长2 077bp,其开放阅读框(ORF)为1 752bp,编码583个氨基酸。CsTPS基因编码蛋白含有单萜合成酶蛋白特有的2个天冬氨酸富集基序及RRx8W、RxR保守基序,N端具有一段叶绿体转运肽。同源比对分析显示,CsTPS氨基酸序列与多种植物的单萜合成酶序列相似性较高,与黄胡萝卜α-松油醇合成酶、白簕柠檬烯合成酶、蓖麻单萜合成酶相似性分别为74%、71%和66%。系统进化树分析表明,CsTPS属于TPSb亚家族类型。荧光定量PCR结果显示,在白茶萎凋、乌龙茶做青、红茶发酵等加工过程中,CsTPS基因的表达量均有上调,推测CsTPS基因的表达与茶叶加工过程中茶叶香气形成密切相关。     

独行菜种子bHLH类转录因子基因家族及幼苗laICE1表达对冷胁迫的响应

该研究在转录组数据基础上,以独行菜(Lepidium apetalum Willd.)种子耐受和不能耐受低温萌发的2组样本为材料,对其bHLH转录因子家族成员进行分析,并对该家族成员表达差异极显著的laICE1基因进行克隆、序列分析、结构预测,以探讨独行菜幼苗中laICE1基因表达对低温胁迫的响应特征。结果表明:(1)萌发中的独行菜种子,至少有83个bHLH转录因子序列表达,相对于低温萌发停滞组,在低温萌发耐受组的独行菜种子中,有10个下调、13个上调、60个表达差异不显著。其中表达量极显著下调的序列c20009_g1具有1 503bp开放阅读框,GO注释到ICE1基因,该基因命名为laICE1。(2)laICE1基因编码500aa,蛋白分子量为54 635.19kD,理论等电点为5.45,分子式为C2364H3742N688O758S22;该蛋白具有保守结构域bHLH。(3)定量分析表明,laICE1基因在非低温胁迫的独行菜种子中的表达量显著低于一直处于低温胁迫中不能进行萌发的独行菜种子,这与转录组数据库中该序列表达情况一致;而laICE1基因在独行菜幼苗期经低温处理后,其表达量显著上调,表明laICE1基因可能在独行菜幼苗耐受低温生长中具有一定的作用。     

金针菇戊糖磷酸途径的关键基因表达分析

生物细胞主要依靠戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway, PPP)产生还原力,该途径也是细胞内各种单糖分子相互转变和不同结构糖分子合成的重要方式。PPP途径能够在生物的不同生长发育或代谢活动中发挥重要的作用。本研究基于金针菇单核体菌株W23基因组数据,使用KEGG数据库注释了与金针菇PPP途径相关的22个基因。进一步结合生物信息学分析手段,研究了两个限速酶:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase, G6PDH)与6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)基因结构,并利用金针菇不同发育时期的不同组织转录组数据,分析了这两个限速酶编码基因的表达模式。结果表明,两个基因编码蛋白均具有行使其功能的保守结构域,定位在细胞质中,包含多个磷酸化位点。G6PDH系统发育分析表明该基因较为保守,进化与物种分类地位相一致。基因g6pdh与6pgdh的表达量呈高度正相关(相关系数为0.99),两个基因在菌丝阶段的表达量均高于子实体阶段,并且在菌盖中表达量高于菌柄,显示了PPP途径在金针菇不同发育阶段的活跃程度。本研究能够为金针菇生长和发育过程研究提供理论参考。     

金针菇高表达基因的密码子偏好性及特征分析

为探究金针菇的密码子偏好性,挖掘高表达基因的特征信息,以金针菇基因组及转录组数据为材料,分析金针菇的密码子偏好性及其影响因素,并对发育阶段高表达基因进行功能注释和顺式元件分析。分析表明,金针菇高表达基因表现出较强的密码子偏好性,且其偏好密码子多以胞嘧啶(C)结尾,此外在高表达基因中存在6种氨基酸的最优密码子较为保守。在进化过程中,金针菇高表达基因密码子偏好性受到自然选择压力的影响较大。功能注释分类表明,高表达基因多为核糖体通路相关的基因,与蛋白质翻译和生物合成相关。顺式元件分析表明,高表达基因启动子区域大多存在MeJA响应元件、ABA响应元件、光响应元件及MYB转录因子结合元件。研究结果可为提高金针菇异源表达效率和挖掘强启动子提供理论基础和思路。     

慈竹BeSUS1基因克隆与表达分析

从慈竹转录组数据库中克隆得到了一个SUS基因,命名为Be SUS1,进行了生物信息学分析和组织表达分析。本研究表明,该基因该序列长为2 536 bp,ORF框长度为2 451 bp,编码816个氨基酸,具有N端的蔗糖合成功能域和C端的糖基转移功能域,Be SUS1属于单子叶SUS一簇,与绿竹、水稻、玉米等氨基酸序列,理化性质以及蛋白结构具有高度的同源相似性。组织表达分析显示Be SUS1在慈竹各个部位均有表达,但在各组织中表达具有一定差异,其在未展开叶中表达较低,而在成熟叶与茎段组织中表达较高。     

棉花腺苷酸核糖基化作用因子1(arf1)的结构特征、替换剪接和遗传表达分析

用已建立的新型染色体步移技术同尾酶反向PCR和快速分离目的基因cDNA 5′未知序列方法从陆地棉品种Y18中分离到腺苷酸核糖基化作用因子1(arf1)的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长4360bp,具有6个内含子和7个外显子,在第一个内含子处存在替换剪接现象,使该基因在棉花中分别形成1026、1103和1544bp的3种mRNA。该基因编码181个氨基酸,转录起始位点上游具有转录起始子、TATA盒、CAAT盒、GC盒、多个正向重复序列和反向重复序列,在转录起始位点下游具有富含AT序列和回文结构等启动子特征序列。Southern杂交结果表明：该基因在棉花基因组中有两个拷贝。Northern杂交结果表明：该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。     

龙眼DlPSY基因在根和叶中的表达及其生物信息学分析

为研究八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase)基因在龙眼类胡萝卜素合成途径中的作用机制,该文从龙眼转录组数据中筛选获得一个PSY基因,命名为DlPSY,采用生物信息学方法对龙眼PSY蛋白的一级结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、亲疏水性、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、卷曲螺旋、蛋白质结合位点、系统进化树、蛋白质互作等进行分析和预测,并同时运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对DlPSY基因在龙眼根和叶中的差异表达进行分析。结果表明:龙眼DlPSY基因长度为1 260 bp,编码420个氨基酸;生物信息学预测DlPSY蛋白具有Isoprenoid Biosyn C1超家族结构,含有信号肽,为分泌性蛋白,无跨膜结构,是一种可溶性亲水蛋白,定位于膜外; DlPSY蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,具有卷曲螺旋。Ramachandran评估结果表明应用SWISS-MODEL构建的蛋白质三级结构模型可靠,其配体结合位点为344Phe和347Lys。RT-qPCR分析结果表明DlPSY基因在龙眼根和叶中均有表达,叶中表达量高于其在根中的表达量。该研究结果为下一步采用遗传学方法提高龙眼中类胡萝卜素的含量奠定理论基础。     

菘蓝牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶基因(IiGGPPS1)的克隆及其表达特性分析

本研究通过分析菘蓝转录组数据库得到一条牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)的编码序列,利用RT-PCR扩增得到其全长,命名为Ii GGPPS1,利用生物信息学方法对该基因及其编码的蛋白进行分析,并对该基因的功能、表达特性进行了研究。研究结果表明:Ii GGPPS1的c DNA序列全长为1 086 bp,开放阅读框长1 080 bp,编码359个氨基酸。Ii GGPPS1蛋白与其它植物GGPPSs高度保守,蛋白N端含有叶绿体信号肽,二级结构主要由螺旋和无规则卷曲组成,同源建模结果显示Ii GGPPS1蛋白是个同源二聚体。组织特异表达分析表明该基因在叶片中的表达量最高,根中次之,茎中最低,且受虫害颜色浅的叶片中该基因表达量显著低于正常叶片中的表达量,推测该基因可能与二萜化合物叶绿素的合成相关。该结果将为进一步研究菘蓝牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶基因(Ii GGPPS1)的功能及其表达调控奠定理论基础,也可为菘蓝的生长、发育调节与品质改良积累研究资料。     

甘草Pht1基因家族鉴定与表达分析

Pht1家族磷酸盐(Pi)转运体介导植物中磷(P)的吸收和再动员。为探讨甘草Pht1基因的结构及表达模式,该研究利用生物信息学方法对甘草Pht1(GuPht1)基因家族进行分析,结合转录组数据和实时荧光定量(qRT-PCR)分析GuPht1在非生物胁迫下的表达,并采用RT-PCR克隆4个GuPht1基因。结果显示：(1)甘草中有8个Pht1家族成员(GuPht1;1—GuPht1;8),都位于细胞膜上,且具有12个跨膜结构,属于MFS超家族,氨基酸长度介于521～570 aa之间,含有Pht1保守的特征序列GGDYPLSATIMSE。(2)系统进化分析显示,甘草GuPht1基因家族成员与豆科植物亲缘关系较近;启动子区含有与磷饥饿有关的W-box、G-box、PHO-like和P1BS元件;甘草GuPht1基因家族在Scaffold定位分布均匀,三级结构均为单体。(3)转录组数据分析显示,GuPht1响应干旱、盐、激素等胁迫,且表达有组织特异性。qRT-PCR结果表明,低磷胁迫下GuPht1基因有明显的时空表达差异性,GuPht1;1/1;6/1;8在根中表达明显上调,GuPht1;5/...