β-TCP三维支架用于骨髓间充质干/基质细胞的研究最新进展

β-TCP(β-磷酸三钙)是一种近年来研究渐热的人工合成生物陶瓷材料,该原料制备的生物载体具有高生物相容性、良好生物吸收性、自发诱导骨细胞分化和扩增等优势,因此多用于骨损伤修复领域。将β-TCP作为三维支架材料的主料进行体外扩增骨髓间充质干/基质细胞(MSC)并进行成骨分化检测或移植修复骨损伤的研究已取得一定进展。无论是以β-TCP为支架影响MSC成骨分化的因素和工艺基础研究;还是在移植修复骨损伤方面;甚至三维灌注进行工业化扩增,均显示该材料颇具应用价值。拟围绕上述领域简要介绍和评述国内外近年来的最新研究进展。     

骨形成蛋白2/珍珠层粉/壳聚糖支架制备及生物性能研究

目的:制备骨形成蛋白2/珍珠层粉/壳聚糖复合多孔支架,观察支架生物性能。方法:采用冷冻干燥法制备骨形成蛋白2/珍珠层粉/壳聚糖多孔支架。用光学显微镜和扫描电子显微镜观察支架表面形貌及孔径大小,用比重瓶法检测支架孔隙率,热重分析探讨支架的热稳定性,用微力试验机进行压缩性能测试,并将支架与兔骨髓间充质干细胞共培养检测细胞黏附性能,将支架埋置大鼠皮下观察其炎症反应。结果与结论:制备的骨形成蛋白2/珍珠层粉/壳聚糖支架孔径大小为100~300μm,孔隙率为91.64%,压缩应力达3.37MPa,与细胞共培养贴附较好,有良好的组织相容性,提示该支架可做为组织工程支架材料应用于临床上骨组织缺损的修复。     

类人胶原蛋白-丝素蛋白血管支架的制备及性能表征

为了提高血管支架的力学性能,将生物相容性良好的新型生物材料类人胶原蛋白(基因工程技术、高密度发酵生产)与丝素蛋白以质量比9:1、7:3、5:5复合,采用真空冷冻方法制备管状血管支架。研究了不同配比血管支架材料的表面结构、表面元素组成、力学性能、降解和生物相容性。结果表明:当类人胶原蛋白与丝素蛋白的质量比为7:3混合时,类人胶原蛋白-丝素蛋白管状支架具有均匀的多孔结构,孔径为(60±5)μm,孔隙率达到85%以上;获得了较理想的力学性能:应变为50%±5%,应力为(332±16)kPa;具有相对慢的降解速率;提高了细胞的黏附与增殖,具有良好的生物相容性。     

多孔β-TCP用于构建长骨组织的实验研究

探索新型的多孔β-磷酸三钙(β-TCP)作为组织工程骨支架材料的应用效果。分别应用单纯β-TCP(对照组)和骨髓间质干细胞（bone marrow stem cells, BMSCs）、β-TCP复合物(实验组)修复狗尺骨2cm的骨缺损,术后通过X光片、核素扫描、大体观察和组织学观察判断长骨骨缺损的修复效果。X片观察：3月时,实验组尺骨缺损由内植物较好的桥接,内植物边缘模糊,管腔及内植物与缺损断端之间有新生骨形成;对照组尺骨缺损处的内植物明显变形,出现密度不均的裂解颗粒,其与缺损断端连接处有新生骨形成。6月时,实验组尺骨缺损被伴有骨髓腔的新生骨连接,有皮质骨形成;对照组尺骨缺损被高密度影连接,没有骨髓腔和明显皮质骨形成,尺骨远端直径明显细于实验组。核素扫描的延迟相骨显像：1月和2月时两组之间有显著性差异,3月时两组之间无显著性差异。大体观察：3月时可见,对照组尺骨直径明显小于实验组,实验组的骨缺损处新生物的体积明显大于对照组;对照组的内植物周围有纤维组织紧密包裹,难于分离。6月时可见,实验组新生骨色泽红白相间,明显已被塑形;对照组新生骨体积、形状不完整。HE观察：3月时,实验组β-TCP的孔隙中,可见新生骨在表面贴附生长;对照组β-TCP的孔隙中有类骨质形成,充填着大量核深染的巨核细胞和毛细血管。6月时,两侧的β-TCP都完全消失,都有新生骨形成,但对照组新生骨量和骨结构明显差于实验组。复合骨髓基质干细胞的多孔β-TCP能够修复长骨骨缺损。     

β-TCP三维支架用于骨髓间充质干细胞原位冻存研究

目的:探索骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)三维扩增原位冻存策略实践性及其对传代迁徙和成骨分化能力的影响.方法:制备β-TCP三维支架,相对2D平板考察三维扩增细胞数,冻存后以CCK-8染色计数考察收获冻存效率,迁徙率,并以ALP染色考察总体成骨分化水平和比分化活力.结果:与2D平板相比,3D培养速率提升7倍,原位冻存细胞收获存活效率由传统消化吹打方式的55.9%提升为81.3%;冻存处理后其迁徙率传代效率下降无统计学意义(P>0.05),比ALP活性经冻存处理非但未下降,反而在迁徙传代支架上显著性提升.结论:利用β-TCP三维支架扩增、传代MSC并进行原位冻存不影响传代迁徙能力,对成骨分化水平反而有贡献作用,具有较好的科研及工业生产应用前景.     

3D技术制备骨修复生物材料的功能和安全性评价

配制PLGA/HA复合生物材料,应用3D打印技术制造可移植入体内的骨支架,通过体外物理和生物学方法检测其性能,最后通过动物体内实验对其进行安全性评价。方法:使用3D打印技术打印PLGA/HA复合物立体支架生物材料,参照GB/T 1040和GB/T 9341检测支架材料的拉伸强度和弯曲强度,验证其支持h MSC的增殖及分化能力,并按照医疗器械生物学评价标准(GB/T16886)对支架材料进行体外和体内生物相容性及生物安全性评估。结果:成功制作了PLGA/HA复合材质的多孔3D支架材料;复合材料的机械拉伸强度和弯曲强度分别为38MPa和42MPa,是正常人软骨的5.35倍和5.25倍;体外细胞试验证明3D支架可支持h MSC增殖和分化为软骨细胞,生物安全性试验结果表明支架符合国家医疗器械生物学评价标准。     

可注射型纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料骨水泥的研究

为制备可满足临床需要的可注射磷酸钙骨水泥,以自制纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料作为骨水泥的固相粉体,将柠檬酸、醋酸等按一定比例配置成溶液作为液相,设计正交试验以简化实验,从凝固时间和抗压强度两方面来确定该骨水泥体系的最佳配比。再通过转靶X射线衍射仪、傅立叶变换红外光谱仪、扫描电子显微镜手段分析了各个组分对凝固时间和抗压强度的影响。此外,还通过细胞培养实验评价了最优条件下骨水泥的生物相容性。     

整体填充和颗粒填充β-TCP植骨材料对修复腔隙性骨缺损的影响

目的:探讨不同植骨方法对于β-TCP(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)植骨材料修复兔股骨腔隙性骨缺损的效果.方法:24只成年家兔,被随机分为整体填充组(12例)和颗粒填充组(12例).以膝关节外侧切口入路,在双侧股骨髁部制备6mm(直径)×10mm(深度)骨缺损,按照事先随机分组结果,分别进行整体填充植骨和颗粒填充植骨.分别于术后3至6周处死动物,取材标本进行生物力学分析,Micro-CT检测和组织学观察.结果:3周时,整体填充组的最大抗压强度明显优于颗粒填充组(P＜0.05),而Micro-CT检测发现新生骨密度(tissue mineral density,TMD)和新生骨体积百分比(bone volume fraction,BV/TV)在两组间均无明显差异,组织学在两组均表现为少量新骨形成;6周时,两组之间的最大抗压强度无明显差异,而Micro-CT检测显示颗粒填充组的TMD和BV/TV均优于整体填充组(P＜0.05),组织学上颗粒填充组较整体填充组可见较多的新骨形成.结论:整体填充组提供了更好的生物学强度,颗粒填充组更有利于诱导新骨形成,二者各有优点.     

β-TCP支架体外构建组织工程骨及其流体力学研究

骨髓基质干细胞在β-tricalciumphosphate(β-TCP)支架上分别进行了1、2和4周的三维动态培养,对支架上不同时间和部位的细胞面积/微孔面积及支架动态培养的流体环境进行了研究.研究表明,第1周细胞在支架大部分孔道内粘附生长并出现一定区域的单细胞层和多细胞层,第2周部分区域的部分孔道已填满了细胞并出现多细胞层,第4周大部分孔道几乎填满了细胞,主管道内壁出现了较多的细胞生长.同时发现,支架上各个区域细胞粘附面积不等,部分区域无细胞存在,有的部位2周后细胞逐渐减少.为了研究支架各个位置细胞増殖与流速、剪切应力的关系,建立了支架随机孔道结构的流体分析模型,通过支架上流速和剪切应力分布探讨实验中细胞分布现象的机理.结合计算和实验发现,流体能流到的部位几乎都有细胞生长,细胞生长较快的部位速度大多集中在0.24～0.53mm/s,剪切力大多在0.0050～0.023Pa,主管道底部及靠近进口的部位可能存在由于过大的剪切力影响细胞生长的区域.上述结果在一定程度上反映了细胞-支架-流体三者在成骨转化过程中的作用,对指导体外灌注培养的流量确定、灌注工艺及骨转化动力学研究有重要的意义.     

经低强度超声波照射后组织工程骨成骨的生化学和力学分析

目的:观察低强度超声波照射后组织工程骨的骨形成情况和力学变化。方法:将骨髓间充质细胞/β-磷酸三钙(Bonemarrowstromalcells/tricalciumphosphate,BMSCs/β-TCP)共同增殖分化培养2周后,手术植入同基因鼠背部两侧皮下,一侧行低强度超声波每日照射20min,另一侧作为对照。术后5、10、25和50d,分别取出组织工程骨,行抗压力测试、碱性磷酸酶(Alkalinephosphate,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OCN)含量分析。结果:超声波组组织工程骨的ALP活性和OCN含量都明显高于对照组(P0.01);抗压力测试与对照组没有明显差别(P0.05)。结论:低强度超声波能够促进组织工程骨的骨形成能力。     

PCL/β-TCP调控巨噬细胞极化对成血管效应的影响

目的:探究生物可降解材料聚己内酯/β-磷酸三钙(PCL/β-TCP)通过调控巨噬细胞极化对骨组织内血管生成的作用,为其临床应用提供依据。方法:采用3D打印技术制备试样并加以表征。体内实验采用模型为SD大鼠股骨远端植入模型。双侧植入PCL/β-TCP支架后采取免疫荧光染色观察支架内部成血管标记物CD31的表达差异,并采用血管灌注方法进行血管造影,评价支架内部血管体积。采用免疫荧光染色检测炎症标记物iNOS,抑炎标记物Arg-1的表达情况。体外实验采用细胞共培养的方式检测PCL/β-TCP对巨噬细胞极化的调控作用以及免疫介导的血管形成改变。实验分为两组,空白组(Control)及PCL/β-TCP(PT5)组。将巨噬细胞系Raw264.7接种于材料表面并对其极化水平及分泌改变进行检测。通过免疫荧光染色检测M1巨噬细胞标记物iNOS、M2巨噬细胞标记物Arg-1的表达情况。通过RT-qPCR检测CCR-7,CD206,血管内皮生长因子(VEGF),血小板源性生长因子(PDGF-BB),肿瘤坏死因子α(TNF-α),白细胞介素-10(IL-10)的转录情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGF、PDGF-BB、IL-10、TNF-α的分泌情况。应用Transwell迁移实验检测PCL/β-TCP刺激下巨噬细胞分泌作用对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁移能力的影响,应用免疫荧光染色检测PCL/β-TCP刺激下巨噬细胞分泌作用对HUVECs表面血管形成指标CD31表达情况的影响。结果:在体内实验中,支架周围组织CD31表达升高(P0.001),血管灌注结果提示支架内部血管体积显著增加(P0.001),同时炎症标记物iNOS表达下调(P0.001),抗炎标记物Arg-1升高(P0.001)。在体外实验中,与Control相比,PT5组巨噬细胞中炎症标记物iNOS合成无明显差异,抑炎标记物Arg-1合成增加;炎症标记物CCR-7及TNF-α转录水平下调(P0.01,P0.01),抗炎标记物CD206及IL-10转录上调(P0.001,P0.001);VEGF转录水平下调(P0.01),PDGF-BB转录上调(P0.01);VEGF分泌水平下降(P0.001),PDGF-BB分泌增加(P0.01),IL-10分泌水平提高(P0.001),TNF-α分泌水平下降(P0.05)。在巨噬细胞分泌作用下,HUVECs的迁移能力提高(P0.001),CD31表达上调(P0.001)。结论:骨修复材料PCL/β-TCP可通过调控巨噬细胞向M2方向极化进而促进血管形成,可作为骨修复材料的候选材料之一。     

超临界流体发泡技术制备BMP-2-PLLAms/FGF-2-nHA/PLGA复合支架及体外成骨诱导效应研究

本研究将左旋聚乳酸微球(PLLAms)与纳米羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙醇酸(nHA/PLGA)多孔支架复合,构建可次第释放不同生长因子的骨组织工程支架.首先,制备载骨形态发生蛋白2的左旋聚乳酸微球(BMP-2-PLLAms),然后将微球与nHA/PLGA及碱性成纤维细胞生长因子2(FGF-2)按照一定的比例混合,通过超临界流体发泡制备BMP-2-PLLAms/FGF-2-nHA/PLGA复合支架.制备的BMP-2-PLLA载药微球呈规则球形,粒径分布在6~10μm之间,BMP-2载药量为1.45×10-3%,包封率为61.9%,制备的BMP-2-PLLAms/FGF-2-nHA/PLGA复合支架孔径为100~200μm,孔隙率为75.8%,抗压强度为6.8 MPa,8周降解率为19.9%.7天时,FGF-2和BMP-2的累计释放率分别为77.1%和44.2%;14天时,FGF-2和BMP-2的累计释放率分别为84.9%和61.5%.大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨诱导实验证明复合支架中释放的BMP-2和FGF-2能够持续有效地刺激BMSCs的增殖和分化,具有良好的生物活性.BMP-2-PLLAms/FGF-2-nHA/PLGA复合支架有效实现了FGF-2和BMP-2的次第释放,且能够显著地促进BMSCs的成骨分化.     

雪旺氏细胞与同种异体骨支架的体外共培养研究

目的:探讨雪旺细胞(Schwann’s cells,SCs)在同种异体骨支架上的生物相容性,体外构建组织工程骨神经化模型。方法:利用新鲜人体骨骼制备同种异体骨支架材料,检测其物理性能;采用优化方法提取新生SD大鼠坐骨、臂丛神经培养SCs,实验分为三维培养实验组(SCs+同种异体骨)、二维培养对照组(SCs+胶原玻片),S-100抗体免疫荧光染色鉴定SCs纯度;细胞计数法检测两组细胞增殖特点;细胞接种后第3、7天取样,扫描电镜观察。结果:同种异体骨支架具有良好的三维孔隙结构,适宜细胞贴附生长;S-100免疫荧光染色证实SCs纯度95%;扫描电镜检测显示两组SCs均可正常粘附增殖,细胞间排布规律相似,培养早期实验组SCs胞体更加细长,伪足更加明显,随着培养时间的延长表现出较强的迁移能力;细胞增殖检测:两组SCs生长曲线特征基本一致,支架材料对SCs无毒性作用。结论:同种异体骨支架SCs具有良好的生物相容性,其三维立体多孔结构有利于SCs的粘附与迁移,初步构建了体外组织工程骨神经化模型。     

具有中空贯通管结构的磷酸钙骨水泥的制备研究

目前,磷酸钙骨水泥因其具有优良的生物性能已被广泛用于骨组织工程,但它自固化后只是形成具有微孔和封闭气孔的致密块体,其孔径尺寸和连通性仍远达不到骨组织工程的最佳要求.本研究采用α-TCP为原料,以过氧化氢作为发泡剂,使用模具插针法制得一种具有大孔径和中空管的多孔磷酸钙骨水泥材料.孔径达到900μm,孔隙率为50.67%,抗折强度达到5.84MPa.通过扫描电镜照片观察和分析微观结构.结果表明,通过这种方法可以制得具有理想孔径尺寸和连通性的多孔磷酸钙骨水泥,可以说,这为制备用于骨组织工程的多孔磷酸钙骨水泥创造了一种新的方法.     

羟基磷灰石/胶原类骨仿生复合材料的制备方法及机理

天然骨除了含有羟基磷灰石无机成分外,还有胶原、糖蛋白等少量的有机成分,这种混杂结构使骨具有独特性能。因此模拟天然骨的形成机制,采用仿生的方法制备羟基磷灰石／胶原类骨材料以再生骨的生物学和力学性能势在必行。本就制备羟基磷灰石／胶原类骨仿生复合材料的方法及体外模拟天然骨生物矿化和材料自组装的形成机制进行了综述。     

应用于骨缺损修复的复合生物活性人工骨的生产技术

可应用于骨组织修复的具有生物活性的复合医用材料——人工骨,采用60％FDA批准的高分子材料高分子材料聚乙内酯多元醇和40％陶瓷原料磷酸三钙用融合塑型技术,生产出物理性状类似骨组织的人工骨,再以交联的方式将骨形态发生蛋白BMP-2,修饰复合材料表面,增强复合材料的生物成骨活性,可促进骨组织再生。     

RGD多肽修饰钙磷陶瓷支架材料对骨质疏松兔成骨能力及骨功能影响的机制研究

摘要 目的：探究RGD多肽修饰钙磷陶瓷支架材料对骨质疏松（osteoporosis, OP）兔成骨能力和骨功能的影响极其可能的作用机制。方法：选取40只雌性SPF级新西兰大白兔，随机分为A组（正常对照组）和B组（OP组），每组各20只，再将A组随机分为A1组：sham组、A2组：sham+HA组、A3组：sham+BCP组、A4组：sham+RGD-BCP组，每组5只；B组随机分为B1组：OP组、B2组：OP+HA组、B3组：OP+BCP组和B4组：OP+RGD-BCP组，每组5只。B组采用去势法制备OP模型，检测相关指标。结果：A组兔术前和术后3个月时BMD无变化（P>0.05），B组兔术后3个月时的BMD值较术前下降（P<0.05）。自第4 d开始，A组和B组RGD-BCP支架材料组细胞的OD值高于HA和BCP支架材料（P<0.05），且B组之间的差异较A组更大（P<0.05）。Western Blot分析显示，A、B两组中RGD-BCP中整合素avβ3的表达高于HA和BCP（P<0.05），且B组之间的差异较A组更大（P<0.05）。B4和A4组p38 MAPK蛋白的相对表达均低于、Wnt5a和β-catenin表达均高于B2、B3和A2、A3组(P<0.05)，此外，A4组p38 MAPK蛋白的相对低于、Wnt5a和?茁-catenin表达高于B4组(P<0.05)。结论：RGD-BCP对兔BMSCs具有良好的相容性和吸附作用，对OP模型兔更显著；且RGD-BCP的机制可能与调控p38 MAPK/Wnt5a/β-catenin信号通路有关，为OP合并骨缺损的修复提供了新的思路和理论依据。     

PGLA编织支架的制备与初步体内评价

目的:热拉伸会改变纤维的结构和性能,进而影响由纤维编织而成的支架的性能。本文考察了PGLA纤维的拉伸倍数对编织支架在SD大鼠皮下的体内降解行为的影响。方法:制备了基于生物可降解高分子材料聚乙交酯丙交酯(PGLA,GA/LA摩尔比=90/10)的完全生物可降解编织支架,通过测试支架在大鼠体内降解过程中的失重、表面形貌、热性能、径向压缩力等变化情况,考察了纤维的不同的拉伸倍数对支架体内降解过程的影响。结果:用拉伸倍数为5的PGLA纤维编织的支架在植入SD大鼠皮下后降解最慢,重量、吸水率、结晶度、化学成分和径向压缩力的变化最慢,植入体内10天后能够保持完整的支架形态。结论:纤维的拉伸倍数会影响由纤维编织成的支架的热性能和力学性能的变化,本研究结果表明这种新的手工编织的支架具有短暂支撑管腔狭窄的潜在应用,为支架的材料选择和制备方法提供了参考,为在体内起到短暂支撑作用的支架的深入研究提供了实验基础。     

多孔n-HA/PA66支架复合rhBMP-2修复兔桡骨缺损的实验研究

目的 ：研究多孔纳米羟基磷灰石/聚酰胺66（nHA/PA66）骨修复材料作为骨组织工程支架复合基因重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）后的成骨能力的变化,探讨加速nHA/PA66人工骨与受体骨愈合的方法。方法：选用新西兰大白兔双侧桡骨制作骨缺损模型,将nHA/PA66/rhBMP2复合材料植入左侧骨缺损处,右侧骨缺损以nHA/PA66植入作为实验对照,另做不植入任何材料的骨缺损空白对照。在1、2、4、8、12周各时相点分别进行大体观察、X线照片、组织学切片、免疫组化原位杂交进行检测图象分析。结果：nHA/PA66/BMP2与nHA/PA66组骨缺损均完全修复,而空白对照组骨缺损未见修复;2周时nHA/PA66与nHA/PA66/rhBMP2两组间原位杂交阳性细胞表达有统计学意义（ P<0.05）, 4周时nHA/PA66与nHA/PA66/rhBMP2两组间原位杂交阳性细胞表达无统计学意义（ P>0.05）,2周及4周实验和实验对照两组分别与空白对照组比较均无统计学意义（ P>0.05）,nHA/PA66/rhBMP2组较nHA/PA66组可加速人工骨/植入体/受体界面骨愈合。 结论：多孔nHA/PA66作为骨组织工程支架复合具有诱导成骨活性的rhBMP2后,增强了早期成骨能力,加速了其与受体骨的愈合。     

丝素蛋白/羟基磷灰石复合物对磷酸钙骨水泥性能的影响

目的：磷酸钙骨水泥（Calcium phosphate cement,CPC）以其诸多优点正得到了越来越多的应用,但其较差的力学性能表现也限制了它的使用范围。本研究目的在于改善磷酸钙骨水泥的力学性能,同时评估改性后的磷酸钙骨水泥的其他性能。方法：通过丝素蛋白（Silk fibroin,SF）的矿化自组装方法制备丝素蛋白／羟基磷灰石复合物（silk fibroin/hydroxyapitite composite, SF/HA）。按照1％、2％、3％、4％的质量分数加入磷酸钙骨水泥中,与磷酸钙骨水泥组对比。比较内容包括力学强度、抗渍散性能及细胞毒性。结果：以丝素蛋白溶液为液相组的磷酸钙骨水泥强度大约为35MPa。随后随着添加丝素蛋白／羟基磷灰石复合物的质量分数从1％增至3％,磷酸钙骨水泥的强度逐渐增加（P〈0．05）,最高约至45MPa。而当丝素蛋白／羟基磷灰石的质量分数达到4％时,磷酸钙骨水泥的强度较质量分数3％组小幅度下降至43MPa（P〈0．05）。以丝素蛋白溶液作为液相时,磷酸钙骨水泥的抗溃散能力也得到了加强。在MTT法测定细胞活力的对照实验中,无论是加入丝素蛋白溶液或丝素蛋白／羟基磷灰石复合物,都未观察到细胞毒性。结论：在磷酸钙骨水泥中加入3％质量分数的丝素蛋白／羟基磷灰石复合物,能显著提高磷酸钙骨水泥的抗压强度。而丝素蛋白溶液作为液相可改善磷酸钙骨水泥的抗溃散能力。同时,丝素蛋白和丝素蛋白／羟基磷灰石复合物都不表现出细胞毒性。更理想的力学强度和更强的抗溃散能力,大大扩展了磷酸钙骨水泥的应用范围。