LEA蛋白研究进展

LEA蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)是生物体中广泛存在的一类与渗透调节有关的家族蛋白,该蛋白的编码基因在植物种子胚胎发育晚期表达量丰富,而且在环境胁迫如干旱、低温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和NaHCO3等条件下LEA基因的mRNA也会大量累积.LEA蛋白显著的理化特性是具有很高的亲水性和热稳定性,即使在煮沸条件下也能保持水溶状态.LEA蛋白在细胞中可以稳定细胞膜结构,作为分子伴侣,具有结合离子和防止氧化等作用,被认为是在胁迫过程中对植物起保护作用的物质之一.针对这些重要特性,分别综述了LEA蛋白的分类、结构、编码基因和表达调节方式及其在植物生长过程中的作用.     

小麦TaLEA1基因的表达特征及抗逆功能验证

我国土壤盐碱化日益严重,对我国的粮食安全造成了严重威胁,因此耐盐基因挖掘对作物耐盐育种非常重要。许多研究表明胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)在植物应对非生物胁迫中发挥积极作用。本研究以小麦TaLEA1基因为研究对象,分析了其表达蛋白的理化性质及基因表达模式,并通过在拟南芥中过表达,分析Ta LEA1基因的抗逆功能。结果表明,TaLEA1基因的表达蛋白属于第3组LEA蛋白,是稳定的亲水蛋白,富含α-螺旋、β-转角等结构。Ta LEA1基因在小麦根、茎、叶、花、种子等不同组织中均有表达,盐胁迫条件诱导其高表达。在拟南芥中过表达TaLEA1基因,显著提高了盐胁迫下转基因拟南芥的种子萌发率、根长及盐和旱胁迫下的叶绿素含量。本研究结果为LEA基因抗逆机理的研究和耐盐基因的挖掘提供了重要信息。     

玉米ZmCIPK31基因原核表达及启动子序列分析

与钙传感器类钙调磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)互作的蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)在植物特定的生长发育和应答胁迫过程中起重要作用。对前期研究得到的玉米ZmCIPK31基因构建原核表达重组载体,进行原核表达分析,转化重组质粒的大肠杆菌BL21菌株能够诱导出期望的目的蛋白。蛋白可溶性分析表明,它是可溶性的蛋白,通过淀粉树脂柱对其进行纯化,为下一步激酶活性分析提供了有活性的目的蛋白。同时,克隆了ZmCIPK31基因起始密码子ATG上游包括2189bp的启动子区段,顺式作用元件预测分析表明此区段不仅具有TATA-box和CAAT-box等启动子共有序列,还具有光应答、胁迫应答、发育相关、激素相关及其他功能未知的调控结构域。聚乙二醇(PEG)胁迫下,ZmCIPK31基因的诱导表达进一步表明其能够应答胁迫,且在地上部和根中的表达模式不同。     

LEA蛋白与植物的抗旱性

植物在干旱胁迫下会产生多种诱导蛋白,其中LEA蛋白（Late-embryogenesis-abundant protein)已受到普遍关注。根据近年的研究进展,本文就植物中LEA蛋白的特性、分类、功能及LEA基因的表达调控作了简要综述。     

小麦耐逆基因-TaLEA3的克隆及在酵母中的功能分析

LEA蛋白(late-embryogenesis-abundant protein),是指胚胎发生后期种子中大量积累的一类蛋白质,它广泛存在于高等植物中,且受发育阶段、脱落酸(ABA)和脱水信号的调节,其中第3组LEA蛋白与作物耐逆性密切相关。通过RT-PCR从小麦中克隆了一个新的第3组LEA蛋白基因,TaLEA3。该蛋白主要定位于细胞质。TaLEA3的表达受高盐、低温和外源激素ABA的诱导,根中表达量一般高于叶中,且在不同胁迫下该基因表达模式存在差异。在所检测的一对同核异质小麦品种中,该基因的表达与耐旱性呈正相关。TaLEA3在酵母中过量表达,改善了酵母在离子和渗透胁迫下的生长状态或提高了存活率。     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:通过佛波酯(TPA)和植物球血凝素(PHA)刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a-IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论:成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

毛白杨NBS型基因PtDRG01原核表达研究

为了分析毛白杨NBS型抗病基因PtDRG01(EF157840)编码蛋白的特性,研究构建了该基因的原核表达载体pGEX-Pt01,并导入大肠杆菌XA90,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证明,该特异蛋白的分子量约为79kD。对原核表达体系以及融合蛋白的表达特性进行优化与分析表明:最佳诱导表达条件为1mmol/L IPTG在37℃下诱导4h,所表达的融合蛋白为胞内分泌的可溶性蛋白。利用谷胱苷肽-琼脂糖亲和层析柱纯化获得了电泳纯级的目标蛋白,为PtDRG01基因编码蛋白的功能鉴定研究奠定了基础。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21(DE3)中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度(16℃)有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B基因的克隆及表达

[目的]将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi B)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化。[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增Rpi B基因,经酶切连接表达载体p ET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况。通过LC-MS-MS验证重组酶活性。[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 k Da左右。优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多。重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19%。[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的Rpi B酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性。     

纤枝短月藓LEA5基因表达及耐盐性分析

该研究以纤枝短月藓为材料,利用RT-PCR和HiTail-PCR技术分别克隆得到纤枝短月藓LEA5基因的ORF和启动子序列,并进行生物信息学、基因表达及耐盐性分析,为进一步研究LEA5蛋白的保护机制奠定基础。结果显示:(1)LEA5基因包含267 bp的开放阅读框(ORF),编码88个氨基酸。(2)LEA5基因启动子序列为1 053 bp,利用PlantCARE在线工具预测顺式作用元件显示,该启动子不仅具有典型的CAAT box元件,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他元件。(3)荧光定量分析表明,LEA5基因在纤枝短月藓不同时期和不同组织中都有表达。(4)LEA5蛋白的异源表达提高了大肠杆菌对盐胁迫的耐受性,表明LEA5蛋白可能在耐盐性中起重要作用。     

干旱胁迫下白沙蒿LEA基因的表达及序列分析

[目的]确定白沙蒿在干旱胁迫下起调节作用的LEA蛋白家族及其生物信息学特征。[方法]对在正常生长、中度胁迫和重度胁迫下的白沙蒿进行转录组测序,获得其LEA表达的差异性,对其中显著上调表达的基因进行序列分析。[结果]与多数报道的物种不同,白沙蒿在干旱胁迫时起调控作用的是第5家族LEA5蛋白。白沙蒿LEA的开放阅读框(ORF)全长264 bp,编码87个氨基酸。LEA5蛋白的分子量为9 406.74 Da,等电点为9.75,其序列与黄花蒿同源性最高(64%)。LEA蛋白为亲水性蛋白,定位于线粒体(73.9%),二级结构以无规则卷曲(59.77%)和α-螺旋(37.93%)为主,无信号肽和跨膜结构。[结论]白沙蒿在干旱胁迫下,LEA5参与了抗旱的调控,该基因的生物信息学特征分析为深入了解白沙蒿及蒿属其它固沙植物的抗旱机制提供一定的理论基础。     

天花粉蛋白突变基因TCSA-S在大肠杆菌BL21中的表达

天花粉蛋白是具有N-糖苷酶活性的一种植物Ⅰ型核糖体失活蛋白,本研究用PCR方法获得了天花粉蛋白的突变基因TCSA-S,构建了表达载体pET-30a( )-TCSA-S,转化大肠杆菌BL21(DE3),并在30℃条件下诱导表达。经SDS-PAGE电泳检测,重组的突变体基因TCSA-S表达产物主要存在于包含体中。     

长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆长双歧杆菌NCC2705株果糖结合蛋白BL0033的基因,利用大肠杆菌表达GST-BL0033融合蛋白并纯化。方法：以长双歧杆菌NCC2705株基因组为模板,PCR扩增BL0033基因,并将其插入pGEX-4T-1表达载体,转化至大肠杆菌DH5α;提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21,并对表达条件进行摸索;用谷胱甘肽-Sepharose4B树脂对可溶性GST-BL0033融合蛋白进行纯化。结果：PCR扩增的BL0033基因长度接近1000bp,与预期值一致;重组菌在IPTG浓度为0.05mmoL/L的条件下,于16℃诱导过夜后,SDS-PAGE分析可见可溶性表达条带,相对分子质量约60×103,与预期值一致;亲和纯化后,SDS-PAGE结果显示单一的表达条带。结论：克隆了BL0033蛋白的基因,并表达纯化了融合蛋白GST-BL0033,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705株BL0033蛋白功能奠定了基础。     

转柽柳晚期胚胎富集蛋白基因烟草的耐低温性分析

目的:验证转柽柳晚期胚胎富集蛋白(LEA蛋白)基因烟草对低温的忍耐程度。方法:采用低温方式,对转LEA蛋白基因烟草的11个株系及非转基因对照烟草组培苗和大棚盆栽苗进行胁迫处理,测定其相对电导率和丙二醛含量。结果:烟草组培苗在非胁迫条件下,转基因和非转基因对照烟草的相对电导率、丙二醛含量无显著差异;在0℃胁迫条件下,非转基因对照烟草的相对电导率和丙二醛含量均明显高于转基因烟草。大棚盆栽烟草在-4℃条件下,各转基因烟草的相对电导率、丙二醛含量与0℃胁迫时均变化不大;但非转基因对照烟草相对电导率高于0℃胁迫的25.2%,丙二醛含量高于0℃胁迫的59.29%。结论:柽柳LEA蛋白基因的导入提高了烟草的耐低温能力。     

硅对辣椒CaLEA5基因低温胁迫下表达分析

通常在逆境胁迫下,植物细胞会诱导产生一系列的逆境蛋白来保护细胞免受伤害,其中胚胎发育晚期丰富(LEA)蛋白是目前研究最为普遍的一种。为了研究辣椒LEA蛋白的耐寒性,以豫椒101为材料,根据已经报道的LEA基因序列设计引物,通过PCR技术从辣椒基因组中获得LEA基因,命名为CaLEA5。经生物信息学分析,该基因具有一个完整的ORF为297 bp,编码98个氨基酸。辣椒CaLEA5蛋白质含有LEA基因家族保守的结构域。对其亚细胞定位、跨膜结构进行分析,预测其定位在叶绿体,存在跨膜结构。荧光定量PCR检测结果表明,低温胁迫可诱导CaLEA5基因的表达,且其表达量在迅速达到峰值后又降低,说明CaLEA5是一个快速响应基因,推测其在辣椒抗逆机制中起着重要的作用。在低温胁迫的条件下,硅处理可延缓CaLEA5基因的上调表达。     

戈壁异常球菌Dgl5蛋白生物学功能研究

LEA5C(Group 5C Late Embryogenesis Abundant)家族蛋白参与非生物胁迫反应并以分子伴侣的形式保护细胞内生物大分子不受损伤。分离于新疆戈壁沙漠的戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)I-0具有极端的电离辐射、氧化、干燥等抗性。功能基因组注释表明Dgo_CA1605编码蛋白属于LEA5C家族,命名为Dgl5,对Dgl5生理功能展开研究。采用同源重组的方法构建Dgl5重组表达菌株。非生物胁迫实验结果表明,Dgl5能够显著增强表达菌株BL21盐胁迫抗性,最大限度地保护宿主菌免受反复冻融的损伤;体外生理生化实验结果表明在反复冻融条件下,Dgl5能够有效保护苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)酶学活性。因此推测,在冷冻、高盐胁迫条件下,Dgl5蛋白通过保护细胞体内相关酶类的活性,增强宿主菌抵抗外界复杂多变的极端环境。?     

戈壁异常球菌Dgl5蛋白生物学功能研究北大核心CSCD

LEA5C(Group 5C Late Embryogenesis Abundant)家族蛋白参与非生物胁迫反应并以分子伴侣的形式保护细胞内生物大分子不受损伤。分离于新疆戈壁沙漠的戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)I-0具有极端的电离辐射、氧化、干燥等抗性。功能基因组注释表明Dgo_CA1605编码蛋白属于LEA5C家族,命名为Dgl5,对Dgl5生理功能展开研究。采用同源重组的方法构建Dgl5重组表达菌株。非生物胁迫实验结果表明,Dgl5能够显著增强表达菌株BL21盐胁迫抗性,最大限度地保护宿主菌免受反复冻融的损伤;体外生理生化实验结果表明在反复冻融条件下,Dgl5能够有效保护苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)酶学活性。因此推测,在冷冻、高盐胁迫条件下,Dgl5蛋白通过保护细胞体内相关酶类的活性,增强宿主菌抵抗外界复杂多变的极端环境。?     

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)与植物抗逆性研究进展

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)在自然条件下主要在种子发育晚期大量积累,植物LEA基因也在多种非生物胁迫下诱导表达。植物LEA蛋白是植物应对失水胁迫(包括干旱、盐碱、冷冻等)逆境的一种广泛存在的亲水性应答蛋白,具有很强的热稳定性。本论文就LEA蛋白的结构、分类、功能及抗逆性分子机制进行了概述与总结,为分离新的LEA蛋白成员,进行功能分析以及进一步发掘其潜在应用价值提供参考。     

甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。