邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构和功能研究进展

邻苯二酚是所有芳香族化合物降解过程中的重要的中间产物,其降解有邻位和间位裂解两条裂解途径,分别由邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)催化裂解。本综述简要介绍了邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构和功能的研究进展。     

对高效石油降解菌株C_(230)酶活的最适pH和温度的探究

以中国甘肃华庆油田附近被石油污染的土壤中分离得到的六株高效石油降解菌A6、L5、L3、M4、B1、B3为菌种材料。通过对六种菌株进行整细胞破碎处理,研究了在不同的pH值和不同温度条件下的各菌株C23O(邻苯二酚2,3-双加氧酶)酶活。实验结果表明:C230酶的最佳反应pH值为7.5;最适反应温度为35℃。     

陶厄氏菌Thauera sp.K11对酚类化合物降解作用及途径研究

旨在分析陶厄氏菌属(Genus Thuaera)中的一株菌株Thauera sp.K11对含酚废水中酚类化合物的降解作用和途径。以石化污水厂分离菌株K11为研究对象,克隆其16S r RNA基因和关键酶基因,并进行系统发育分析,在基因水平探究苯酚降解机理;利用气相色谱技术检测酚类化合物降解效果和苯酚降解机理。结果显示,利用16S r RNA系统学分析发现K11是陶厄氏菌属的一株细菌。该菌对11种酚类化合物具有降解作用,其中5种酚类化合物72 h的降解率90%。克隆并获得了K11的苯酚羟化酶和邻苯二酚双加氧酶基因。酶活性测定表明,K11通过苯酚羟化酶催化苯酚转化为邻苯二酚,然后利用邻苯二酚-2,3-双加氧酶催化产生2-HMSA。陶厄氏菌Thauera sp.K11是一株能够降解多种酚类化合物的菌株,具有较强的酚类污染物降解能力,其通过苯酚→邻苯二酚→2-HMSA途径进行苯酚降解。     

三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp. YL-JM2C中多个邻苯二酚双加氧酶的功能

【目的】研究Sphingomonas sp.YL-JM2C菌株的生长特性,确定以三氯卡班作为碳源的生长情况。挖掘菌株YL-JM2C潜在的邻苯二酚1,2-双加氧酶及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达邻苯二酚双加氧酶基因并研究其酶学性质。【方法】优化S.sp.YL-JM2C菌株以三氯卡班作为碳源时的培养条件,并利用全自动生长曲线测定仪测定菌株生长情况,绘制生长曲线。通过生物信息学方法挖掘潜在的邻苯二酚双加氧酶基因,并分别在Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达,通过AKTA快速纯化系统纯化蛋白,分别以邻苯二酚、3-和4-氯邻苯二酚为底物检测重组蛋白的酶学特性。【结果】菌株在pH为7.0-7.5时生长最优。在以浓度为4-8 mg/L的三氯卡班做为底物时,菌株适宜生长。当R2A培养基仅含有0.01%酵母提取物和无机盐时,加入终浓度为4 mg/L的三氯卡班可促进菌株生长。挖掘到6个潜在的邻苯二酚双加氧酶基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1、stcE2和stcE3,表达并通过粗酶液分析证明其中5个基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1和stcE2编码的酶均具有邻苯二酚双加氧酶和氯邻苯二酚双加氧酶的活性;纯化酶的底物范围研究揭示了StcA1、StcA2和StcA3均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,StcE1和StcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶;它们酶动力学分析研究证明了5个酶对邻苯二酚的亲和力和催化效率最高,4-氯邻苯二酚次之。【结论】在同一菌株中发现了5个具有功能的邻苯二酚双加氧酶基因,stcA1、stcA2和stcA3编码的酶均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,stcE1和stcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶编码基因。5个酶均具有催化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能,这为更好地理解微生物基因组内代谢邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚基因的多样性奠定了基础。     

一株木质纤维素降解菌的筛选及其全基因组分析北大核心CSCD

【目的】筛选和鉴定有木质纤维素降解能力的1株细菌,测定其相关酶活力并进行全基因组分析,为构建木质纤维素降解工程菌提供依据。【方法】采用3种木质素类似物(天青-B;酚红;愈创木酚)的脱色/染色法,从腐木和被枝叶覆盖的土壤中分离和筛选出1株具有较强木质纤维素降解能力的细菌。通过16S r RNA基因和全基因组序列分析对该菌进行种属鉴定。使用紫外分光光度法测定其锰过氧化物酶(Mn P)、漆酶(Lac)、羧甲基纤维素酶(CMCase)以及滤纸酶(FPA)活力,了解该菌相关酶活力大小在一定时间内的变化趋势。使用Illumina Miseq和454 GS Junior测序平台获取该菌的全基因组序列,将其全基因组序列经过注释的基因蛋白质序列提交COG和KEGG数据库进行BLASTp比对分析,确定该菌潜在的重要酶类和代谢途径,并对部分注释基因进行定量RT-PCR验证。【结果】筛选得到1株优势菌株S12,该菌经鉴定后命名为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)。在液体CMC-Na培养基中发酵28 h,菌体生长达到稳定期,纤维素降解相关酶活力也在此时达到峰值。生物信息学分析结果表明,菌株S12具有木质素降解通路中重要酶类的编码基因,如过氧化物酶、Fe-Mn型超氧化物歧化酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶和原儿茶酸-3,4-双加氧酶等,这些基因在以碱性木质素为碳源的培养条件下表达量不同程度地高于以葡萄糖为碳源的培养条件。另外,菌株S12具备完整的纤维素降解和乙醇生成通路。【结论】本研究首次揭示了Raoultella ornithinolytica S12具备有效的木质纤维素降解性能,这对于推动木质纤维素应用产业的发展具有重要意义。     

食酸丛毛单胞菌AN3菌株降解苯胺代谢途径的研究

食酸丛毛单胞菌(\%Comamonas acidovorans\%)AN3菌株中降解苯胺的酶类均为诱导酶,在以苯胺为唯一碳、氮源和能源生长的细胞中,含有苯胺双加氧酶、邻苯二酚2,3双加氧酶、2羟基己二烯半醛酸脱氢酶、4草酰巴豆酸脱羧酶和4羟基2酮戊酸醛缩酶等。苯胺双加氧酶作用于苯胺的\%K\%m值和\%V\%\-\{max\}分别为292μmol/L和3.57μmol\5mg\+\{-1\}·min-1;邻苯二酚2,3双加氧酶作用于邻苯二酚的\%K\%m和\%V\%\-\{max\}分别为16.4 mol/L和15.2μmol\5mg\+\{-1\}\5min\+\{-1\}。根据实验结果,推测了该菌株降解苯胺的代谢途径。     

石油污染土壤中苯酚降解菌ad049的鉴定及降解特性

以苯酚为唯一碳源,采用富集培养方法,从陕北靖边油田污染土壤中分离获得1株苯酚高效降解菌(ad049),对菌株进行形态观察、生理生化检验及16S rDNA序列分析,确定该菌株为红球菌(Rhodococcus)。采用摇瓶振荡培养方法,研究了接种量、pH值、温度和底物浓度对ad049生长量和苯酚降解率的影响,同时对该菌株脱氢酶和邻苯二酚双加氧酶活性进行了测定。结果表明,ad049具有较强的苯酚降解能力;在苯酚浓度1000 mg/L,温度35℃,pH值8,接种量5%的培养条件下,反应24 h后,苯酚降解率达99%以上,且整个降解过程符合零级动力学方程,速率常数k_0=41.51,相关系数R~2=0.96。通过邻苯二酚双加氧酶活性的测定,推测出该菌株降解苯酚的途径可能是以邻苯二酚1,2双加氧酶为主要途径进行邻位开环,辅以邻苯二酚2,3双加氧酶进行间位开环。     

鞘氨醇单胞菌PY3菲降解基因的克隆及序列分析

将菲降解菌鞘氨醇单胞菌(Sphingomanas sp.)PY3的DNA片段与pUC119质粒连接后,转化大肠杆菌JM109,经筛选得到两个质粒,分别命名为pUp1(带有23kb外源DNA片段)和pUp2(带有39kb外源DNA片段)。pUp 1的DNA含有2个ORF。ORF 1由275个氨基酸组成,与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)F1的甲苯水解酶及菌株Pseudomonas CF600的甲苯水解酶在氨基酸水平上有47%的同源性。ORF 2由327个氨基酸组成,与嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的邻苯二酚双加氧酶(phe B)及紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)CTM的邻苯二酚双加氧酶(C23O)在氨基酸水平上分别有57%和44%的同源性。     

微生物降解邻苯二酚的动力学研究

以一株产邻苯二酚双加氧酶的假单胞菌84103为试验菌,对其降解邻苯二酚的动力学进行了研究。结果表明,该降解过程为酶催化反应,测定了反应最适温度、最适pH、饱和菌量、Km值及诱导作用等。     

1株高效菲降解不动杆菌的筛选、鉴定及性能研究

从兰州某化工厂石油废水中分离筛选出1株高效降解菲的细菌F-1并对其菌种进行鉴定,结合紫外分光光度法及气相色谱-质谱联用(GC-MS)对菌株生长特性、不同烃类化合物降解特性及菲降解动力学等进行了研究,利用PCR技术检测了芳香烃代谢相关基因。结果表明,菌株F-1属于约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii),可在终浓度为50～800 mg/L的含菲基础培养基中正常生长。在温度30℃、pH 7. 0、盐度0. 3%(质量分数)、转速180 r/min条件下培养5 d后菲(终浓度为100 mg/L)降解率为43. 57%,降解过程符合一级动力学特征。菌株F-1也能利用联苯、萘、蒽、芘为唯一碳源生长。GC-MS分析显示菌株对C10-C28部分直链烷烃具有较强的降解能力。PCR扩增结果表明,菌株F-1基因组中存在邻苯二酚-1,2-双加氧酶、苯甲酸盐双加氧酶、铁氧化还原蛋白还原酶、乙醇脱氢酶、二羟酸脱水酶、醛缩酶和氧化还原蛋白基因。研究结果为该菌株应用到含菲废水及多环芳烃污染土壤的处理和深度修复研究提供参考。     

睾丸酮丛毛单胞菌对羊草根际土壤PAHs降解及细菌群落结构的影响

探究睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni,C.t)联合羊草修复多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)污染土壤过程中,羊草根际土PAHs降解及根际微生物的变化。用气相色谱-质谱法(GC-MS)检测C.t联合羊草时根际PAHs的降解,通过高通量测序技术测定羊草根际土壤细菌群落及多样性,采用冗余分析及网络分析评价PAHs降解与细菌群落组分之间的相关性,用PICRUSt软件预测PAHs降解潜力。结果表明,C.t的接入在修复后期(60–120d)促进PAHs降解,使羊草根际细菌丰富度、多样性以及细菌与PAHs的相关性发生改变,并且提高了羊草根际PAHs的降解潜力。C.t主要通过影响变形菌门属水平中鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、MND1和Nordella,放线菌门属水平上红色杆菌(Rubrobacter)和Gaiella,酸杆菌门属水平中RB41以及拟杆菌门中黄杆菌(Flavobacterium),从而加快羊草根际土中萘(Nap)、菲(Phe)、苯并芘(BaP)3种PAHs的降解。研究以期为C.t联合植物降解土壤...     

苯酚降解工程菌Bacillus subtilis dqly-2的构建

目的:构建苯酚降解工程菌Bacillus Subtilis dqly-2.方法:选取2株苯酚降解菌,分别为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa zllf4和枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis BHf3-4,体外扩增Pseudomonas aeruginosa zllf4的邻苯二酚2,3双加氧酶基因(SYJ),并将此基因转入Bacillus Subtilis BHf3-4中,构建基因工程菌,并对野生菌和工程菌降解能力进行比较.结果:作用96h后,工程菌苯酚降解率为96.18％,显著高于野生菌的84.78％.结论:成功构建高效苯酚降解基因工程菌.     

联苯降解细菌的分离及其降解质粒某些特性的研究

:通过选择性富集培养 ,从芳烃污染的土壤中分离得到 16株以联苯作唯一碳源生长的细菌。初步鉴定 ,3株均为假单孢菌属(Psedomonas) 。都含有大小 2个质粒。质粒不稳定 ,易丢失。经苯甲酸钠和口丫啶橙的消除实验 ,结果表明 ,随着质粒丢失 ,菌株利用Bp生长的能力也丧失。酶活性分析表明 ,菌株只有邻苯二酚 2 ,3—氧化酶活性 ,没有邻苯二酚1 ,2—氧化酶活性。菌株对联苯的降解率 :bp2 菌为 93%、bp2 3菌为 81%、bp2 4 菌为 99%。降解过程中产生λmax331nm和λmax4 34nm2种中间代谢物。     

蜡状芽孢杆菌菌株Jp-A的分离鉴定及其降解苯酚特性

从某钢铁厂处理废水的活性污泥中驯化分离一株能高效降解苯酚的细菌（Jp-A）.通过形态观察、生理生化实验和16srRNA序列分析,初步鉴定Jp A为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）.在实验条件下,该菌在16、24和32 h内能将浓度分别为5、10和15 mmol·L^-1的苯酚完全降解,而30 mmol·L^-1的苯酚则完全抑制该菌的生长.该菌也能以甲苯、氯酚类和硝基酚类等芳香烃类物质作为唯一碳源和能源生长.双加氧酶检测表明,其通过间位途径开环裂解苯酚,该途径的关键酶邻苯二酚2,3 双加氧酶主要定位在细胞膜上,为诱导酶,补加葡萄糖能抑制该酶的产生.     

粪便微生物宏基因组来源的热稳定性邻苯二酚1,2-双加氧酶异源表达及酶学性质

【目的】克隆倭蜂猴粪便微生物宏基因组的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对该酶进行异源表达及酶学特性研究。【方法】利用宏基因组高通量测序技术获得cat PLCgl,并对其氨基酸序列进行分析。将cat PLCgl重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,研究其酶学性质。【结果】cat PLCgl全长852 bp,G+C含量48%,编码283个氨基酸,理论分子量为33.56 k D。重组Cat PLCgl酶学性质分析显示最适作用p H为7.0,其中在p H 7.0–10.0范围内处理1 h后,酶活剩余90%以上;最适作用温度为40°C,在25°C和40°C条件下稳定性较好,耐受210 h酶活性几乎不变。重组酶在最适条件下的动力学参数K_m、V_(max)和k_(cat)分别为24.9μmol/L、8.3 mmol/(min·g)和13.7 s~(-1);Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Triton X-100、SDS、Ag+强烈抑制该酶活性,而其它金属离子及有机试剂影响较小。【结论】从倭蜂猴粪便微生物宏基因组中克隆得到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对重组Cat PLCgl酶学性质进行研究,该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,在降解环境中的邻苯二酚和生产顺,顺-己二烯二酸方面具有应用潜力。     

苯并（a）芘对大弹涂鱼肝脏抗氧化酶活性影响的初步研究

在实验条件下,研究了不同浓度苯并(a)芘(BaP)暴露对大弹涂鱼肝脏内抗氧化酶-超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响.结果表明,不同浓度的BaP暴露对抗氧化酶活性产生不同程度的影响.低浓度组(3μg     

倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因多样性研究

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O基因克隆文库,并对克隆进行测序分析。【结果】倭蜂猴粪便微生物来源的PH和C12O基因序列经BLAST比对分析,与GenBank中相应酶的序列一致性分别介于92%?100%和87%?100%。系统进化树分析表明PH基因序列与Neisseria、Burkholderia、Alcaligenes、Acinetobacter 4个属来源的PH序列相关;C12O基因序列全部与Acinetobacter来源的C12O序列相关。序列比对结果表明PH序列具有LmPH (Largest subunit of multicomponent PH)中高保守的两个DEXRH结构域;C12O序列具有能被Ag+和Hg2+抑制的位点(半胱氨酸)。【结论】倭蜂猴粪便微生物来源的PH为多组分PH,其降解苯酚的中间产物邻苯二酚可以被C12O通过邻位开环途径裂解。     

波茨坦短芽孢杆菌降解苯酚特性及动力学研究

从活性污泥中分离筛选出一株高效苯酚降解菌,经形态特征、生理生化试验及16S rDNA鉴定,该菌株为波茨坦短芽孢杆菌。该菌能以苯酚为唯一碳源和能源,最佳降解条件为:温度30℃,初始pH7.0,摇床转速为160 r/min。苯酚降解试验表明,该菌可在72 h内将初始浓度为1 600 mg/L苯酚完全降解。随着苯酚浓度的增加,底物抑制作用增强。应用Haldane方程对菌株的生长过程进行动力学模拟,拟合曲线与试验测定值相关性良好,各参数分别为μmax(最大比增长率)0.334 h-1,Ks(半饱和常数)14.07 mg/L,Ki(抑制常数)196.89 mg/L,且该菌株苯酚降解动力学与其生长动力学表现出相似的趋势。代谢机制研究表明,苯酚可诱导该菌合成邻苯二酚1,2-加氧酶降解苯酚。     

好氧氯苯降解菌的分离鉴定

【目的】分离好氧氯苯降解菌,并通过研究降解特性为应用提供理论依据。【方法】利用富集培养技术分离菌株,通过形态、生理生化反应特征及16S rRNA基因序列分析鉴定菌株,测定培养液中氯苯、其它氯苯类化合物和氯离子的浓度以及菌体细胞的密度和菌体细胞粗提液中邻苯二酚双加氧酶的活性,研究菌株的降解特性。【结果】16S rRNA基因序列相似性比较表明,分离出的菌株与乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的相似性高达98.5%。以初始浓度为50mg/L的氯苯为唯一碳源和能源时,120h内菌株对氯苯的降解率高达98.2%,氯离子净释放量和氯苯降解量的摩尔比范围为1:1.85-1:1.39,菌体细胞粗提液中邻苯二酚1,2-双加氧酶的平均活性为0.538U/mg蛋白质。加入葡萄糖后,菌体细胞数量和氯离子浓度明显增加,但单位细胞的氯苯降解能力明显下降。在二氯苯和三氯苯共存时,菌株对氯苯的降解能力受到明显的抑制作用,但对二氯苯有一定的降解作用,降解能力大小顺序为:1,3-二氯苯1,2-二氯苯1,4-二氯苯。【结论】分离出的好氧氯苯降解菌属于Acinetobacter属菌株,该菌株对氯苯和二氯苯均具有降解作用,可能通过邻位裂环途径降解氯苯,氯苯对菌株的降解能力和邻苯二酚1,2-双加氧酶的活性具有明显的增强作用。     

邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构、功能及同工酶现象研究进展

邻苯二酚是芳香族化合物多条生物降解途径中共有的一种重要的中间产物,根据开环方式的不同,可分为邻位降解途径和间位降解途径,其中邻位降解途径中的关键酶是邻苯二酚1,2-双加氧酶。本文主要综述了邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构、酶学性质,以及它在芳香烃降解菌中存在的同工酶现象及其功能研究进展。