NALP1 基因与骨肉瘤细胞的相关研究

目的:探讨NALP1基因在骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的表达,以及高表达NALP1基因对于骨肉瘤细胞体外凋亡的影响。方法:使用RT-PCR、Western-blot法检测骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平并与人成骨细胞株hFOB1.19比较。将NALP1基因转染质粒PcDNA3.1,将重组质粒转染骨肉瘤细胞,分成高表达基因组、空质粒组及对照组,加入抗肿瘤药物顺铂及甲氨蝶呤促使肿瘤细胞凋亡,使用流式细胞仪测定各组肿瘤细胞凋亡率。结果:通过统计分析,骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平均低于人成骨细胞株hFOB1.19(P<0.05),NALP1高表达组的肿瘤细胞凋亡率明显高于空白质粒组及对照组。结论:上调骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的NALP1的表达量可以促进肿瘤细胞凋亡。     

NOK在雌激素促进肺腺癌细胞系上皮间质转化过程中的作用

摘要 目的：探讨NOK（Novel Oncogene with Kinase-domain：蛋白络氨酸激酶结构域新基因）在雌激素促进肺腺癌细胞系上皮间质转化过程中的作用。方法：实验共分四组,其中第一组细胞NOK基因不下调,不加雌激素,为空白对照组,第二组细胞NOK基因下调,不加雌激素,第三组细胞NOK基因不下调,加雌激素,第四组细胞NOK基因下调,加雌激素。用慢病毒下调A549细胞系中NOK基因表达量,并用浓度为1×10^-8 mol/L的雌激素刺激各组细胞,用q-RT-PCR及Western blot方法检测各组细胞中NOK和EMT标志物表达量,用Transwell实验检测各组细胞的迁移能力。结果：相比于第一组,第二组细胞中NOK和Vimentin表达量降低、E-cadherin表达量增高,分别为0.09±0.01、0.16±0.02、4.83±0.61,与第一组有统计学差异;第三组细胞中NOK和Vimentin表达量显著增高、E-cadherin表达量显著降低,分别为6.03±0.92、5.77±0.86、0.33±0.04,与第一组有统计学差异;第四组细胞中NOK和Vimentin表达量降低、E-cadherin表达量增高,分别为0.11±0.01、0.19±0.03、4.92±0.59,与第一组有统计学差异,与第二组无统计学差异。各组细胞中NOK和EMT标志物的蛋白表达量与mRNA表达量的趋势一致。第二组细胞迁移数显著低于第一组,组间有统计学差异,第三组细胞迁移数显著高于第一组,组间有统计学差异,第四组细胞迁移数显著低于第一组,组间有统计学差异。结论：雌激素可以促进肺腺癌细胞系EMT过程,而下调NOK基因表达可以阻断这一过程,由此认为,雌激素可以通过NOK调控肺腺癌EMT过程。     

microRNA-708-5p对骨肉瘤细胞凋亡与迁移的作用及机制

该文主要研究microRNA-708-5p(miR-708-5p)在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞凋亡、迁移的影响及机制。该研究利用miRNA基因芯片筛选差异表达miRNA; qRT-PCR(quantitative Realtime PCR)检测miR-708-5p在骨肉瘤细胞株MG63和正常细胞hMSC、HS-5中的表达;通过阳离子脂质体介导法过表达miR-708-5p;分别用Hoechst 33258染色、流式细胞术、划痕实验、Transwell法检测凋亡和迁移;通过qRT-PCR检测miR-708-5p、ZEB1(Zinc?nger E-box binding homeobox 1)的RNA水平; Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、ZEB1蛋白表达;利用TargetScan和双荧光素酶报告实验预测并验证miR-708-5p与ZEB1的靶向关系。结果显示, miR-708-5p在MG63中表达下调,恢复miR-708-5p表达水平可诱导MG63细胞凋亡并抑制迁移。Western blot结果显示,过表达miR-708-5p可上调E-cadherin,下调N-cadherin和ZEB1。双荧光素酶报告实验显示, miR-708-5p可直接靶向ZEB1。敲低ZEB1可抑制MG63迁移。该项研究结果表明, miR-708-5p可诱导骨肉瘤细胞凋亡,且通过靶向ZEB1来抑制迁移。     

miR-324-3p靶向GPX4对前列腺癌细胞铁死亡的影响

目的:探讨miR-324-3p对前列腺癌(PCa)细胞铁死亡的影响及其分子作用机制.方法:通过qRT-PCR检测PCa组织、癌旁组织和细胞系中miR-324-3p和GPX4 mRNA的表达水平;采用Western blot检测PCa细胞系中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白的表达水平;CCK-8检测PCa细胞增殖活力...     

稳定干扰ITGB1抑制人乳腺癌BT549细胞迁移和侵袭

在人乳腺癌细胞系BT549中稳定干扰整合素β1(integrinβ1,ITGB1),研究其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。构建靶向干扰ITGB1基因的sh RNA慢病毒,感染BT549细胞,通过筛选成功获得稳定干扰ITGB1蛋白的BT-549细胞系,实验设空白对照组(Blank)、病毒感染阴性对照组(shNC)、ITGB1-shRNA慢病毒感染组(shITGB1);Real-time PCR和Western blotting法检测稳定干扰后ITGB1 mRNA和蛋白的表达情况;Western blotting法检测稳定干扰ITGB1后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Fibronectin)的表达情况;利用划痕试实验和Transwell侵袭试实验分别检测稳定干扰ITGB1后细胞的迁移及侵袭能力。Real-time PCR和Western blotting结果显示,shITGB1组细胞ITGB1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于Blank组和shNC组细胞(p0.01,p0.01)。Western blotting结果显示,稳定干扰ITGB1可部分逆转乳腺癌细胞BT549的EMT化;稳定干扰ITGB1后,上皮标志蛋白E-cadherin表达显著上调(p0.01),间质标志蛋白Vimentin(p0.05)、N-cadherin(p0.01)和Fibronectin(p0.01)的表达显著降低。划痕和Transwell侵袭试验实验结果显示,稳定干扰ITGB1后可显著降低乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力(p0.05,p0.05)。在乳腺癌BT549细胞中稳定干扰ITGB1后,通过逆转EMT化抑制细胞迁移和侵袭。     

miR-194-5p靶向下调 CD44 抑制胃癌肿瘤干细胞上皮间质转化的机制研究

摘要 目的：探讨miR-194-5p靶向下调 CD44 抑制胃癌肿瘤干细胞（CSCs）上皮间质转化（EMT）的相关分子机制。方法：采用 qRT-PCR检测胃腺癌细胞系（SGC-7901、MGC-803、SPAG-9和MNK-45） 和胃粘膜细胞（GES-1）中 miR-194-5p、CD44、Snail 和膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP） 表达量,Western blot检测CD44、Snail 和MT1-MMP蛋白表达量。体外构建miR-194-5p过表达和低表达质粒载体并进行慢病毒转染,实验分为过表达组、对照组和低表达组,qRT-PCR和Western blot检测miR-194-5p、CD44、Snail 和MT1-MMP的变化;CCK8法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell实验检测细胞侵袭力,Western blot检测EMT标志物E-cadherin和N-cadherin蛋白表达量。结果：胃腺癌细胞系中miR-194-5p表达显著低于胃粘膜细胞,而CD44、Snail 和MT1-MMP表达量显著升高;SGC-7901和MGC-803与胃粘膜细胞的表达差异最明显（P＜0.05）。与对照组相比,过表达组miR-194-5p表达量明显升高,CD44、Snail 和MT1-MMP表达量显著下降,细胞增殖率和侵袭力下降,凋亡率升高,E-cadherin上调,N-cadherin下调（P＜0.05）。与对照组相比,低表达组miR-194-5p表达量明显下降,CD44、Snail 和MT1-MMP表达量显著增加,细胞增殖率和侵袭力升高,凋亡率下降,E-cadherin下调,N-cadherin上调（P＜0.05）。结论：胃癌中miR-194-5p低表达可能发挥抑癌作用,通过下调CSCs中CD44表达进而抑制EMT的发生。     

hERG shRNA 表达载体构建及其稳定转染骨肉瘤细胞系MG-63、 SOSP-9607 的建立

目的:构建hERG钾离子通道蛋白(human ether-a-go-go-related gene potassium channel)shRNA表达载体质粒,获得稳定转染干扰质粒的人骨肉瘤细胞系MG-63、SOSP-9607。方法:将4对合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pGPU6/GFP/Neo表达载体,并测序鉴定。使用脂质体法将重组的质粒转染至MG-63、SOSP-9607,通过G418筛选建立稳定转染的两种细胞系,采用免疫印迹(Western blot)技术检测hERG蛋白的表达。结果:测序结果证实shRNA与载体连接正确,免疫印迹实验证实hERG蛋白表达显著降低。结论:成功构建了hERG shRNA真核表达载体,获得了稳定表达hERG shRNA的人骨肉瘤细胞系MG-63和SOSP-9607。     

FOXG1在结直肠癌侵袭及转移中的作用及机制

构建叉头框G1(Forkhead box G1,FOXG1)的慢病毒干扰(shRNA)质粒及表达质粒,通过敲低和过表达FOXG1探讨其对结直肠癌细胞上皮-间质转化EMT的作用及其机制。应用Western blotting检测FOXG1在RKO、SW480、SW620、LOVO、DLD-1五种结直肠癌细胞中蛋白的表达水平,设计并合成FOXG1的shRNA片段(shFOXG1),运用DNA重组技术获得重组质粒,经双酶切技术及测序方法鉴定后进行慢病毒的包装、纯化及稳定转染,经筛选后获得稳定的结直肠癌细胞株,通过Western blotting和qRT-PCR技术检测FOXG1敲低和过表达效率及EMT关键因子E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Snail、Twist mRNA和蛋白的变化,光学显微镜观察敲低后细胞形态学变化,通过划痕实验检测迁移能力变化,Transwell检测侵袭迁移能力的变化。5种结直肠癌细胞中,FOXG1在RKO细胞中蛋白表达量最高,而在DLD-1细胞中表达量最低,与对照组相比较,在RKO细胞中敲低FOXG1,细胞形态由长梭型变成了类圆形或者多边形,细胞极性和紧密连接增加,细胞迁移距离明显降低,侵袭转移穿过小室的细胞数也明显减少,EMT关键因子E-cadherin表达增高,Vimentin、Fibronectin、Snail、Twist表达降低,过表达FOXG1组则相反。FOXG1在结直肠癌中高表达,这种基因的高表达能够促进结直肠癌细胞的侵袭和转移,对结直肠癌细胞的EMT起着重要的调控作用。     

miR-448通过抑制上皮间质转化抑制肺癌细胞增殖和运动能力

探讨mi R-448对肺癌细胞增殖和运动的影响及其分子机制。采用实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction)检测原发肺癌组织和癌旁正常组织mi R-448表达水平。转染mi R-448 mimic和inhibitor至肺癌A549细胞系,通过MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide)、平板克隆形成和Transwell实验观察mi R-448表达对A549增殖和运动能力的影响;利用Western blot检测EMT(epithelial-mesenchymal transition)标志物蛋白表达水平,通过实时荧光定量PCR检测EMT相关转录因子m RNA表达水平。实时荧光定量PCR显示较癌旁正常组织相比,mi R-448在原发肺癌组织中表达降低。MTT和平板克隆形成实验显示,过表达mi R-448抑制A549细胞增殖和运动能力;降表达mi R-448增强A549细胞增殖和运动能力。Western blot显示降表达mi R-448能下调上皮标志物E-cadherin,上调间质标志物Vimentin表达水平。实时荧光定量PCR显示降表达mi R-448能上调EMT相关转录因子Twist1和ZEB1 m RNA表达水平。mi R-448可通过抑制EMT抑制肺癌进展。     

果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)过表达对骨肉瘤细胞恶性逆转并向成骨分化的影响

该研究探讨FBP1对人骨肉瘤MG63细胞恶性生物学行为即增殖、凋亡、迁移及成骨分化的调控作用。采用脂质体转染法将FBP1过表达重组质粒转染至人骨肉瘤MG63细胞中,并通过qRT-PCR和Western blot法检测FBP1的m RNA和蛋白表达水平,以验证FBP1基因过表达效果。通过CCK-8、结晶紫染色、活细胞计数法检测细胞增殖; AnnexinV-FITC双染法和DAPI染色法检测细胞凋亡,并通过Western blot技术检测凋亡相关蛋白的表达;应用细胞划痕实验、Transwell检测细胞的迁移能力;通过流式细胞术检测细胞周期; ALP染色和茜素红S染色检测细胞的早期及晚期成骨分化作用。结果表明,过表达FBP1后增殖细胞数明显降低(P0.01)、凋亡率明显增高(P0.01)、划痕实验愈合率明显降低(P0.01)、Transwell实验细胞穿膜数也明显减少(P0.01);成骨诱导MG63细胞后ALP染色、茜素红染色阳性,钙盐结节明显增多;但3个组的细胞周期并无明显差异。综上所述,过表达FBP1可抑制人骨肉瘤MG63细胞增殖,抑制迁移,促进其凋亡,并同时促进MG63细胞的早期和晚期成骨分化,且其增殖并非通过细胞周期调节。     

Bub1基因对人肝癌MHCC97-H细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的:研究Bub1基因在肝癌中的表达以及对肝癌细胞系MHCC97-H增殖、周期和凋亡的影响。方法:利用RNA干扰技术下调肝癌细胞系MHCC97-H中Bub1的表达;qRT-PCR和Western Blot分别检测Bub1在mRNA和蛋白水平表达的变化;CCK-8实验检测肿瘤细胞增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化。结果:qRT-PCR和Western Blot结果显示si-Bub1能够成功下调Bub1的表达;下调Bub1后肝癌MHCC97-H细胞的增殖能力下降(P0.05),细胞的凋亡比例升高(P0.05),细胞发生S期阻滞。结论:Bub1基因在肝癌中高表达,下调Bub1的表达后能够降低肝癌细胞的增殖能力,促进细胞凋亡,诱导细胞发生S期阻滞。     

BMP-2、-3、-6和-12在骨肉瘤细胞株中的表达

目的研究骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2、-3、-6和-12在骨肉瘤细胞株中的表达,为下一步研究BMPs在骨肉瘤发生发展中的作用奠定基础。方法利用免疫细胞化学法和Western blot法检测BMP-2、-3、-6和-12在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和大鼠骨肉瘤细胞株UMR106中的内源性表达。结果在MG63、U2OS和UMR106细胞中,BMP-2、-3和-6均呈不同程度的阳性表达;而BMP-12在这3株骨肉瘤细胞中则均为阴性,并且两种检测方法所得结果完全一致。结论BMP-2、-3和-6在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和大鼠骨肉瘤细胞株UMR106中均有内源性表达;而这3株骨肉瘤细胞中均未检出BMP-12的表达。     

雌激素对A549细胞系EMT过程的影响

目的:探讨雌激素对A549细胞系EMT标志物表达量的影响。方法:用不同浓度的雌激素刺激A549细胞系,并用q-RT-PCR和Western-blot实验检测各组细胞中EMT标志物表达量的变化,用Transwell实验检测不同浓度雌激素对细胞迁移能力的影响,计算各组间有无统计学差异。结果:当雌激素浓度为1×10-9 mol/L、1×10-8 mol/L、1×10-7 mol/L时,Vimentin的m RNA表达量分别为:2.14±0.55、4.72±0.63、2.21±0.47,显著高于空白对照组,组间有统计学差异,E-cadherin的m RNA表达量分别为:0.64±0.15、0.46±0.11、0.59±0.13,显著低于空白对照组,组间有统计学差异,蛋白表达量也有同样趋势;细胞迁移数分别为58.63±7.33、80.12±9.32、61.89±8.22,组间有统计学差异。当雌激素浓度为1×10-8 mol/L时,Vimentin的表达量最高,E-cadherin的表达量最低,细胞迁移数最高。结论:适宜浓度雌激素可以促进Vimentin的表达,抑制E-cadherin的表达,提高细胞迁移能力,当雌激素浓度为1×10-8 mol/L时,促进Vimentin表达、抑制E-cadherin表达和促进细胞迁移的作用最显著。由此认为,雌激素对A549细胞系发生EMT过程有促进作用。     

miR-30 inhibits the progression of osteosarcoma by targeting MTA1

Objectives:MicroRNAs (miRNAs) have been considered as a new class of novel diagnostic and predictive biomarker in many diseases. However, there are few studies on miRNA in osteosarcoma (OS). This study aimed to investigate the roles of miR-30 on OS occurrence and development.Methods:PCR was used to detect mRNA levels of miR-30 and MTA1 in cancer tissues, adjacent non-cancerous tissues from OS patients. Western blot was used to detect MTA1 protein expression in all tissues and cell lines (hFOb1.19,Saos-2, MG63, and U2OS). The correlation between miR-30 and MTA1 was predicted through bioinformatics software, and identified by a luciferase reporting experiment. In vitro, functional test detected the specific effects of miR-30 and MTA1 on the development of OS.Results:miR-30 expression was significantly reduced, while the expression of MTA1 was increased in OS tissues and cells. Luciferase reporting experiment showed that miR-30 sponged MTA1 which was negatively correlated with miR-30 expression. Furthermore, rescue tests revealed that MTA1 restrained the functions of miR-30 on cell proliferation and migration of OS.Conclusion:Our finding showed that miR-30 modulated the proliferation and migration by targeting MTA1 in OS.     

miR-125a-3p调控人结肠癌细胞浸润转移的作用及机制研究

目的:探讨miR-125a-3p在结肠癌细胞浸润与转移中的作用及其可能机制。方法:通过qRT-PCR方法检测miR-125a-3p在结肠癌细胞及组织样本中的表达;在结肠癌细胞过表达或沉默miR-125a-3p后,通过平板克隆实验、MTT实验、划痕实验、Transwell实验检测结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化;采用Western blot方法检测miR-125a-3p过表达后相关标志分子的表达水平变化情况。结果:miR-125a-3p在结肠癌细胞及组织呈现异常低表达;过表达miR-125a-3p抑制结肠癌细胞HCT116及SW480的增殖能力;过表达或沉默miR-125a-3p分别抑制或增强结肠癌细胞的迁移与侵袭能力;过表达miR-125a-3p在mRNA及蛋白水平均能够显著抑制Snail、N-cadherin及Vimentin的表达,而增加E-cadherin的表达。结论:miR-125a-3p参与调节结肠癌细胞浸润与转移,其机制可能是通过调控上皮间质转化途径介导的。     

Sprouty-2对胃癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的影响

目的:研究Sprouty2(SPRY2)基因在胃癌肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)和侵袭转移的影响。方法:体外培养人胃癌细胞(BGC-823),采用慢病毒介导的sh RNA沉默SPRY2基因,并用实时定量PCR与Western blot检测其SPRY2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的表达,采用细胞划痕实验、Transwell实验检测SPRY2基因沉默后的胃癌细胞侵袭转移能力变化。结果:在慢病毒介导sh RNA沉默SPRY2基因的人胃癌BGC-823细胞中,SPRY2的m RNA和蛋白表达明显降低(P0.05),SPRY2沉默后人胃癌细胞E-cadherin的蛋白表达增多(P0.05),vimentin的蛋白表达减少(P0.05)。此外,SPRY2沉默后,胃癌细胞迁移能力和侵袭能力明显减弱(P值均P0.05)。结论:Sprouty-2基因通过调节E-cadherin与vimentin的表达参与胃癌细胞的上皮-间质转化,进而促进胃癌细胞的迁移与侵袭。     

肿瘤相关成纤维细胞对非小细胞肺癌恶性生物学行为影响

目的:探讨肿瘤相关成纤维细胞(Tancer Associated Fibroblast,TAF)对非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)恶性生物学行为的影响。方法:选取在本院肿瘤科住院手术的非小细胞肺癌患者,收集术后肺癌标本,马松三色染色(Masson Trichrome Stain)和天狼星红染色(Sirius Red Stain)观察肺癌组织(Lung Cancer Tissue,LCT)、癌旁组织(Pericarcinomatous Tissue,PCT)和正常组织(Normal Tissue,NT)中TAF的表达情况;体外将非小细胞肺癌细胞A549与非小细胞肺癌成纤维细胞P-gp共培养,CCK-8检测共培养前后A549细胞增殖能力;细胞划痕和Trans-well实验分别检测A549细胞迁移和侵袭能力;q RT-PCR和Western blot检测A549细胞上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)标志蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达。结果:Masson和Sirius染色结果显示:肺癌组织中纤维的表达明显高于癌旁组织;与P-gp共培养的A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力及上皮间质转化相关蛋白N-cadherin和Vimentin表达均明显高于阴性对照组(P0.05),而E-cadherin的表达明显降低(P0.05)。结论:TAF可能通过诱导非小细胞肺癌细胞EMT的发生从而促进非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。