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《微生物学免疫学进展》2022,(1)
目的 制备汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)PS-6株小鼠单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb),建立HTNV抗原双抗体夹心ELISA检测方法,验证方法的检测性能并初步应用于疫苗抗原含量检测。方法 以HTNV PS-6株灭活全病毒原液作为免疫原,采用小鼠杂交瘤融合技术,筛选mAb杂交瘤细胞株,制备mAb;用间接ELISA测定mAb效价;用Western blot鉴定mAb特异性;用间接ELISA测定mAb相对亲和力;经抗体配对筛选,建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以I型肾综合征出血热疫苗标准品作为定量标准,验证该方法的检测限、线性范围、特异性、准确度、精密度;对6批次I型肾综合征出血热灭活疫苗原液进行检测,初步验证该方法的适用性。结果 获得4株稳定分泌抗HTNV PS-6特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株:4B2、3H8、5D7及2A7;间接ELISA检测腹水抗体效价均在1×106~1×106~1×107;Western blot鉴定4株mAb均能特异性识别HTNV PS-6;相对亲和力为4B2>5D7>3H8>2A7;抗体ELISA配对筛选后,选用5D7作为包被抗体,4B2作为标记抗体,包被抗体工作浓度为10μg/mL,HRP标记抗体工作浓度为1∶5 000。该方法对HTNV PS-6抗原检测限为0.039 1μg/mL;检测线性范围为0.078 1~2.500 0μg/mL,R7;Western blot鉴定4株mAb均能特异性识别HTNV PS-6;相对亲和力为4B2>5D7>3H8>2A7;抗体ELISA配对筛选后,选用5D7作为包被抗体,4B2作为标记抗体,包被抗体工作浓度为10μg/mL,HRP标记抗体工作浓度为1∶5 000。该方法对HTNV PS-6抗原检测限为0.039 1μg/mL;检测线性范围为0.078 1~2.500 0μg/mL,R2> 0.97;检测与I型肾综合征出血热疫苗生产主要原辅料成分、II型肾综合征出血热疫苗、森林脑炎疫苗及甲肝疫苗均无交叉反应;准确度验证,病毒抗原回收率在95.8%~110.5%之间;试验内和试验间精密度,CV分别在6.72%~8.03%、8.24%~9.70%之间。用该方法检测6批次I型肾综合征出血热灭活疫苗原液,结果均呈剂量依赖性。结论 成功制备HTNV PS-6株mAb,建立病毒抗原双抗体夹心ELISA抗原检测方法,方法准确、可靠,可初步应用于I型肾综合征出血热灭活疫苗科研、生产过程病毒抗原检测。 相似文献
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我国汉坦病毒基因型和基因亚型的分布研究 总被引:55,自引:0,他引:55
为了搞清全国汉坦病毒的基因型和亚型的分布情况,广泛收集了全国各地汉坦病毒毒株、阳性病人血清和阳性鼠肺,并应用RT-PCR的方法,应用汉坦病毒型特异性引物,对这些不同来源的阳性标本中汉坦病毒型特异性M和S片段进行扩增和测序,并与其它已知病毒序列进行比较,以明确其型别和亚型及其在全国的分布情况.结果表明:我国HFRS各疫区仍然为HTNV和SEOV两型病毒,但亚型分布差异较大,其中HTNV可分为9个亚型,SEOV则有4~6个亚型.Q32株的部分M和S片段分属于H9和H2亚型,是一个基因重排病毒,而Nc167株在系统发生上与其它HTNV明显不同,比较核苷酸序列发现,其M片段与其它HTNV的同源性在71.3%~76.7%之间,S片段与其它HTNV的同源性只有52.3%~57.8%,可能是一个新型病毒. 相似文献
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本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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目的:为进一步研究汉坦病毒包膜糖蛋白的糖基化与病毒的感染性和免疫原性等的关系,构建含有汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白(GP)糖基化位点突变体的重组假病毒。方法:利用定点突变的方法,分别突变了HTNV 76-118株的5个N-糖基化位点并克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染293T细胞,构建5株重组假病毒。感染HEK293细胞后,进行RT-PCR鉴定及免疫荧光检测。结果:经测序显示构建的含有N-糖基化位点突变体的5个重组假病毒原序列中的天冬酰胺(N)均被置换为谷氨酰胺(Q)。RT-PCR结果显示5个重组假病毒均有HTNV GP基因的表达。免疫荧光检测5个重组假病毒均可表达HTNV的Gn和Gc蛋白。结论:成功构建了含有HTNV包膜糖蛋白糖基化位点突变体的5个重组假病毒,分别命名为rLV-M1、rLV-M2、rLV-M3、rLV-M4和rLV-M5。本研究为明确N-糖基化对汉坦病毒生物学活性的影响提供了有利的研究工具,并为汉坦病毒疫苗及致病机理的进一步研究打下了一定的基础。 相似文献
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《微生物学免疫学进展》2020,(1)
目的建立汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)微基因组系统,并进行初步评价。方法用分子克隆方法构建HTNV微基因组系统所需的微基因组质粒和表达核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)的辅助质粒,转染HEK-293T细胞;并在辅助病毒添加与否的情况下进行验证。结果成功构建了基于HTNV L片段非编码区的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)和Gaussia荧光素酶(gaussia luciferase, Gluc)的微基因组质粒,GFP微基因组在辅助病毒HTNV感染的情况下可观察到明显绿色荧光,Gluc微基因组在辅助病毒感染或者辅助质粒共转染情况下均可检测到Gluc的表达。结论成功建立了HTNV的微基因组系统,为研究HTNV的复制机理和抗病毒药物的筛选提供了重要工具。 相似文献
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《生物技术通讯》2016,(6)
目的:研究汉滩病毒(HTNV)核蛋白细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽联合不同免疫佐剂免疫C57BL/6小鼠后的免疫学特性,确立一种免疫效果良好的多肽免疫C57BL/6小鼠方案。方法:分别用氢氧化铝、弗氏佐剂和脂质体作为免疫佐剂与汉滩病毒核衣壳蛋白上的CTL表位肽段混合,经皮下注射免疫C57BL/6小鼠,共免疫3次,每次间隔2周;免疫结束后分离小鼠脾细胞,并分别采用ELISPOT和CTL杀伤试验进行检测。结果:HTNV核蛋白CTL表位肽联合弗氏佐剂加脂质体组小鼠脾细胞分泌IFN-γ能力和CTL杀伤能力优于其他各实验组(P0.01)。结论:HTNVCTL表位肽联合弗氏佐剂加脂质体免疫C57BL/6小鼠效果最佳,可为HTNV多肽疫苗的免疫策略提供参考。 相似文献
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《中国实验动物学报》2015,(4)
卵黄免疫球蛋白(Ig Y)由于其独特的分子结构和稳定性能,使得Ig Y的制备成为抗体领域的研究热点。核酸疫苗作为一种新型疫苗,在生产成本、免疫剂量和免疫保护力等方面比大多数传统疫苗更具有优势。核酸疫苗制备Ig Y结合了两者的优点,比常规免疫方法更具有优势,产生的Ig Y适用范围也更广。本文综述了一种经济、快速的Ig Y制备方法:核酸疫苗制备Ig Y。 相似文献
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艾滋病肆虐全球,已成为世界上危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。疫苗在预防和控制艾滋病中具有重要意义,理想的HIV疫苗必须能够产生广泛的交叉反应性中和抗体、有效的抗病毒细胞毒性T细胞(CTL)反应。近年来,核酸疫苗的研究已经取得了可喜的进展,科学家正不断努力研制更有效、更强大、更广谱的新型疫苗。综述了艾滋病核酸疫苗的载体改造、抗原选择、免疫策略等方面的研究进展,并对其今后的研究发展方向进行了阐述。 相似文献
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本文旨在对全球结核病疫苗研究进展进行系统综述,描述国际上目前进入临床试验不同阶段的新型疫苗,包括重组卡介苗、亚单位疫苗、治疗性疫苗等,分析我国结核病疫苗研究现状,介绍国际研究发展趋势,如人类疫苗计划、全细胞疫苗、多阶段疫苗等,并对存在的问题和挑战进行讨论,展望未来发展趋势。 相似文献
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信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)疫苗和抗体是近年来兴起的一种新型疫苗和抗体技术。与传统疫苗相比,mRNA疫苗具有安全性高、均衡免疫性好、研发周期短、生产成本低等优势,mRNA抗体比其他形式递送的抗体在体内发挥生物学效应的时间更早也更持久。随着mRNA修饰与递送技术的快速发展,mRNA技术迅速走向成熟,在肿瘤治疗、病毒传染疾病的预防和治疗等方面展现出广阔的应用前景,特别是新型冠状病毒mRNA疫苗以创纪录的速度完成研发并成功应用,为未来mRNA技术的推广铺平了道路。本文综述了mRNA技术领域的重要突破,重点关注mRNA疫苗和抗体在应对病毒传染病中的重大进展,并展望了未来该技术在抗病毒感染领域的研究趋势。 相似文献
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DNA疫苗免疫佐剂的研究进展 总被引:6,自引:0,他引:6
DNA疫苗是最近几年从基因治疗研究领域发展起来的一种新型疫苗,它能诱导机体产生持久的体液免疫和细胞免疫应答,能够抗病毒,细菌和寄生虫的感染,对自身免疫性疾病和过敏性疾病有一定的疗效作用。但与传统的灭活疫苗相比,其免疫效价还比较低,最近的研究表明:联合使用DNA疫苗和疫苗佐剂如细胞因子,协同刺激分子等有助于提高DNA疫苗的免疫效价,这一发现有利于研制更有效的DNA疫苗,本文就通过使用免疫佐剂提高DNA免疫效价的最新进展做一综述。 相似文献
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牛分枝杆菌减毒活疫苗--卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)对预防严重的儿童结核病有效,但其免疫保护效率随儿童年龄增长而降低。BCG不能提供终身免疫保护可能与其诱导的记忆性T细胞主要是寿命较短的效应记忆性T细胞有关。新型结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗将有效的抗原有机组合起来,在适宜的疫苗佐剂辅助下诱导Th1型免疫应答。动物实验表明,增加抗原谱可有效提高亚单位疫苗的保护效率。更重要的是,亚单位疫苗在体内持续时间较短,可诱导寿命较长的中央记忆性T细胞,提供比BCG更持久的免疫保护力。记忆性T细胞的分化受抗原特性与剂量、细胞因子、转录因子及雷帕霉素等的调控。对亚单位疫苗及其诱导的免疫记忆进行研究将对新型结核分枝杆菌疫苗的设计与评价产生积极影响。 相似文献
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新型冠状病毒疫苗研究策略分析 总被引:3,自引:1,他引:2
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新发呼吸道病原体,与重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于β-冠状病毒,具有较高的传染性和一定的致死率。2019年12月在我国武汉被发现,随后蔓延到我国大部分省份,给我国人民健康和经济发展造成巨大损失。疫苗接种是预防和控制传染病的常规和有效手段,国内外多个机构已启动COVID-19疫苗研究工作。文中基于SARS和MERS疫苗研究的经验和教训,对COVID-19疫苗的研究策略和需要注意的关键问题进行了阐述,为相关研究人员提供参考。 相似文献