基因重组大肠杆菌表达HrpNEcc蛋白的发酵条件及诱导条件优化

对已构建好的表达HrpNEcc蛋白的工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)hrpN Ecc的摇瓶发酵条件及乳糖诱导进行优化, 通过在7L发酵罐中放大发酵实验,以期提高蛋白产量并降低生产成本。在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是：5% 的接种量,TB培养基,菌体培养至对数生长前期,添加3g/L外源诱导剂乳糖时,HrpNEcc蛋白产量可达417.60mg/L,比不添加乳糖时提高了36.73%,比用IPTG诱导时提高了16.85%。7L发酵罐中发酵,获得菌体湿重达到57.24g/L（WCW）,可溶性HrpNEcc蛋白产量占细胞总蛋白的50.2%,为3.29 g/L。     

GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究

为了提高GABAA受体α1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基,接种量,温度,摇床转速,pH,诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3%接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h。最高目标蛋白表达量达到136mg/L。     

抗菌肽hepcidin融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

构建了his-hepcidin融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,得到携带有pET-hec的E.coli BL2l(pET-Hec)菌株,为了确定融合蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,分别对诱导温度、诱导时机、诱导时间、诱导剂用量等进行了优化,通过Tricine-SDS-PAGE电泳分析,确定了最佳表达条件:37℃培养工程菌至OD600为0.6时,加入0.2 mmol/L IPTG,25℃诱导表达8 h.     

培养条件对重组大肠杆菌生长及外源基因表达的影响

重组DNA技术发展至今,已有许多外源基因在大肠杆菌中获得表达,其中一些产品已投放市场。这些产品所以能进行大量生产在很大程度上得益于发酵培养技术的完善。本文综述培养基、温度、pH、溶氧、比生长速率等对重组大肠杆菌生长、外源基因表达及产物存在形式的影响,并探讨了提高表达水平的途径。     

大肠杆菌表达GST-Aβ42融合蛋白的纯化条件及鉴定

目的：为了提高β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide,Aβ42基因在大肠杆菌中的表达,为深入研究Aβ的作用机制及其疫苗研究奠定基础。方法：大肠杆菌在37℃培养4 h后,以终浓度为1 mmol/L的IPTG在25℃下继续诱导培养2 h,促进GST-Aβ42融合蛋白的可溶性表达。表达产物以SDS-PAGE、Western bloting鉴定。结果：SDS-PAGE表明融合蛋白分子量约为32kD,与预计的一致;Western Blotting进一步分析表明它能与抗Aβ42和抗GST抗体特异反应。结论：GST-Aβ42基因的优化表达为研究Aβ42的作用机理打下了基础,同时也为Aβ42疫苗的研究提供了充分的实验条件。     

不同培养条件对孔雀草种子发芽的影响

孔雀草种子在3种光照、5个温度梯度处理条件下萌发,筛选种子萌发最佳条件。结果表明:在光照和黑暗条件下,孔雀草种子萌发率无显著差异;低温和高温都不适宜种子萌发,以30℃条件为最佳,胚根饱满,整齐,生命力旺盛。     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。本文综述国内外利用大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。     

优化大肠杆菌表达外源蛋白的研究进展

大肠杆菌表达系统是目前表达外源蛋白的首选,利用该表达系统表达重组蛋白有许多优越性,但表达的外源蛋白容易被宿主蛋白酶攻击或未能正确折叠形成包涵体,其表达受到了限制。综述了国内外利用大肠杆菌表达外源蛋白过程中采用的一些优化策略,主要包括表达稀有密码子、应用融合标签,改变表达菌株、降低包涵体形成、单一蛋白技术、自诱导、流加培养以及高密度细胞培养等,以期探索外源蛋白表达的最优策略。     

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达

目的:分析比较HBV PreS2蛋白在大肠杆菌细胞周质和细胞质中的融合表达情况。方法:构建大肠杆菌细胞周质中融合表达HBV PreS2蛋白的载体pMAL-P2x/S2和细胞质中融合表达载体pMAL-C2x/S2,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western Blot检测,分析HBV PreS2-MBP融合蛋白在菌体不同部位的表达情况及表达产物的存在形式。结果:细胞周质中表达的融合蛋白有一部分被降解了,而细胞质中表达出了完整的融合蛋白。细胞质中表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。结论:HBV PreS2-MBP融合蛋白适合在大肠杆菌细胞质中表达。     

应用正交实验法优化大肠杆菌表达CTB-PSMA624-632蛋白的条件

通过基因工程方法,将含霍乱毒素B亚单位(CTB)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)表位肽的重组质粒pET28a-CTB-PSMA624-632,转化表达宿主菌BL21 (DE3)。CTB蛋白的表达有利于开发粘膜佐剂和霍乱弧菌基因工程疫苗,同时抗原肽疫苗也是肿瘤免疫治疗的理想候选。本研究采用正交实验法,优化条件以增加大肠杆菌中CTB-PSMA624-632蛋白的表达量。选取了5个单因素作为考察因子,分别为:预诱导时间、诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、诱导转速。先做了4水平的实验L16(45)。根据极差分析的数据对影响较大的3个因素又做了细调型的3水平实验L9(33)。结果表明,在早期指数生长期的诱导能得到相对高水平的包涵体形式的CTB-PSMA624-632蛋白,并且此蛋白的表达随着诱导温度升高到37℃而逐渐增加;相比于使用正常浓度的IPTG诱导得到的蛋白表达量,用100%μmol/L诱导足以诱导蛋白的表达,这比通常使用的IPTG浓度小10倍;此外,诱导时间5 h与7 h对蛋白的表达量差距甚微,因此选定较短时间的5 h,240 r/min的诱导转速也被认为是能诱导目的蛋白CTB-PSMA624-632具有高表达量的最优条件。     

大肠杆菌抗铜蛋白高表达的条件

含有抗铜质粒pRJ1004的大肠杆菌(Escherichia coli)可以在含有20mmol/L的LB培养基中生长,菌落呈深棕色,其原因是由于一种“修饰铜”沉淀的结果。以同位素64~Cu所做的试验表明,抗性菌株比敏感菌株积累铜少,其抗性机制是减少吸收。质粒pRJ1004含一个抗铜基因组:pcoABCDRSE,,其中pcoABCDE为结构基因,pcoRS为调节基因。pcoABCD的基因产物和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)的copABCD基因产物很相似,有很高的氨基酸序列同源性。而后者的菌落在含铜平板上则呈深蓝色,且细胞中可积累比敏感菌株更多的铜,可达细胞干重的0.3％。copABCD基因产物在细胞中的分布及功能都已研究得比较清楚,它们都是铜结合蛋白。     

不同培养条件对海洋微藻多糖含量的影响

通过对不同培养条件下四种海洋微藻胞内多糖含量的测定,系统地研究了光照时间、温度、ＣＯ２的通入量及营养盐对微藻胞内多糖的影响,以探索其优化条件。     

不同培养条件对胡萝卜根原生质体生长的影响

胡萝卜根原生质体内有橙黄色或橙红色的质体,可以作为亲本的光学标记,有利于进行细胞融合的研究。虽然胡萝卜是植物细胞培养的经典材料之一,但文献中从原生质体得到再生植株的例证(Grambow等1972;吴石君等,1977。)以及胡萝卜属细胞杂种(Dudits等1977)都用悬浮细胞系或愈伤组     

不同射线剂量对鼻咽癌细胞蛋白表达谱的影响

探讨不同的射线剂量对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞蛋白表达谱的影响,以期从放射免疫学的角度深入理解NPC的临床治疗模式.利用固相pH梯度双向凝胶电泳研究5-8F NPC经不同射线剂量照射不同时间后的蛋白质表达谱,MALDI-TOF/TOF鉴定差异表达蛋白并用RT-qPCR和Wes...     

大肠杆菌表达Trx-rPA融合蛋白的复性纯化

大肠杆菌高密度发酵以包涵体形式表达融合蛋白Trx-rPA,表达量22%。包涵体蛋白洗涤后经金属螯合层析纯化,纯度达80%以上。经胱氨酸衍生,以脉冲加样形式复性,复性率可高达30%。经ETI-Sepharose纯化,复性的融合蛋白生物活性可达3.5×105IU/mgPr.。融合蛋白可被rEK酶切释放rPA,酶切效率达85%以上。酶切液经IDA-Sepharose和SP-Sepharose层析纯化,rPA纯度达98%以上,生物活性50万IU/mgPr.。1L发酵液经分离、复性及纯化后,可得高纯度rPA300mg以上。     

提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的研究进展

大肠杆菌是表达重组蛋白的常见宿主之一。重组蛋白分泌到周质空间或胞外培养基中较之在胞内以包含体形式表达有许多优势。主要讨论大肠杆菌Ⅰ、Ⅱ型分泌机制,并总结近年来在提高重组蛋白分泌表达的策略方面取得的进展。     

大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展

构建高产、稳定、可靠的质粒载体成为基因重组表达技术的研究重点之一。宿主细胞代谢反应和质粒不稳定性相关信息的缺乏,仍然阻碍着质粒载体的优化,成为限制外源蛋白在大肠杆菌中高效表达的瓶颈之一。主要论述了大肠杆菌外源蛋白表达载体的稳定性,分别从质粒和外源基因的本身特性、重组质粒转化对宿主细胞造成的影响及其他因素等方面阐述了对质粒载体稳定性的影响,同时介绍了相关的解决办法,从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。     

基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化

【背景】血红素加氧酶-1 (HO-1)具有抗氧化应激、抗凋亡和抗纤维化等多种生理效应,有望成为一种新型药物应用于临床疾病的治疗。【目的】构建表达HO-1的基因重组大肠杆菌(Escherichiacoli),并优化其表达培养条件,实现HO-1高产率的表达。【方法】PCR法克隆集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803的HO-1基因(ho1),构建重组质粒pET-28a-ho1,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,单因素实验优化表达培养基的种类、诱导剂添加时间、诱导培养时间、诱导剂浓度和诱导培养温度。【结果】构建了表达HO-1的基因重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株,用甘油(GY)培养基培养至菌体浓度OD_(600)约为0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导,30°C诱导培养6 h,HO-1的表达量最高,Ni-NTA柱分离纯化得到的HO-1收率占细胞总蛋白的10.9%。【结论】获得了可溶性表达HO-1的基因重组大肠杆菌及其较佳的培养条件,为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。     

优化培养条件和裂解方法提高hRANKL在大肠杆菌内的表达

RANKL/RANK/OPG轴在骨代谢过程中起到中心调节作用,也是近年来骨相关疾病治疗研究的热点之一。RANKL蛋白在RANKL/RANK/OPG轴信号传递过程中起到关键作用,在骨代谢相关实验研究中用途广泛。但是,使用大肠杆菌Escherichia coli可溶表达重组人源RANKL蛋白 (hRANKL) 时产量远低于鼠源RANKL (mRANKL)。本研究通过将LB培养基pH值调整并稳定在7.5、降低诱导表达温度至16 ℃并优化细菌裂解条件,成功地将可溶hRANKL产量增加到了对照组的5?12倍。该方法有效提高了hRANKL在大肠杆菌中可溶表达的产量,同时也是研究重组蛋白在大肠杆菌内的可溶表达策略的有益尝试。