葡萄球菌中毒性休克毒素的分离纯化及其体外抗肝癌活性分析

采用固体膜进行TSST-1的产毒培养,然后从金葡菌产毒产物中经CM纤维素离子交换层析、SephadexG-75、Sephacryl S-200三步纯化,成功地获得了纯度为95.3％的毒素,SDS-PAGE呈现单一条带,与其对应抗血清有免疫学特异反应,不含核酸、糖和其它肠毒素等物质。与同类方法相比,该方法步骤少、快速、简便。对其体外抗肝癌活性进行了分析,首次证明即使TSST-1的浓度为10^-8g/L仍然对人肝癌细胞有显著抑制作用。     

T—2毒素对心肌细胞电生理特性的影响及硒的保护作用

本实验在培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠乳鼠心肌细胞上观察了Ｔ－２毒素对膜电位活动的影响及硒的保护作用。结果表明,Ｔ－２毒素（０．１,０．５,５．０ｍｇ／Ｌ）使心肌细胞动作电位幅值（ＡＰＡ）、超射（ＯＳ）、阈电位（ＴＰ）、最大舒张电位（ＭＤＰ）及最大除极速率（Ｖｍａｘ）显著降低。使复极化时程（ＡＰＤ１０、ＡＰＤ５０、ＡＰＫ９０）延长;动作电位发放频率（ＡＰＦ）受到明显抑制。提示Ｔ－２毒素能抑制Ｃａ＾２＋、Ｋ     

甲壳胺诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的:通过体外实验探讨甲壳胺是否对人肝癌细胞HepG2具有生长抑制及诱导凋亡作用.方法:在HepG2细胞培养液中加入不同浓度的甲壳胺,培养48 h,于倒置相差显微镜下观察甲壳胺处理组及对照组细胞形态学变化;用流武细胞术(FCM)检测HepG2细胞的凋亡率,Western印迹检测甲壳胺处理组及对照组Bcl-2和p53蛋白...     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。     

小麦中T—2毒素的污染调查

采用酶联免疫吸附测定法(ELlSA),调查了我国部分地区1990年国产小麦T—2毒素的污染状况。调查结果表明,在330份样品中,有264份检出T—2毒素,占样品总数的80％。样品中毒素含量最高达1122．Oppb,平均含量为53．3ppb。在引起食物中毒的48份小麦样品中,检出高含量的T—2毒素(84．5—1064．4Ppb)。我国小麦中T—2毒素的污染水平与小麦赤霉病的流行密切相关。     

MMP-2结合肽-蜂毒素杂合基因的表达纯化及活性测定

为开发抗癌导向多肽药物,用从噬菌体十二肽库中筛选的与MMP-2具有高度亲和性的十二肽与蜂毒素连接,采用基因工程方法在大肠杆菌中进行了高效表达;并分别通过亲和层析、肠激酶酶切、凝胶层析获得高纯度的多肽(相对分子质量45000),经体外抑瘤作用测定该融合蛋白具有明显抑制肿瘤细胞的生长。该研究对肿瘤的导向治疗和临床应用提供了一定的帮助。     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化.采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品.首先从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品.然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性.ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g.结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的.     

层析法纯化破伤风毒素的试验研究

为了获得高纯度的破伤风毒素,用疏水层析和离子交换层析纯化破伤风毒素。破伤风毒素培养滤液经Phenyl Sepharose疏水层析除去大部分杂质,再经DEAE Sephadex离子交换层析进一步纯化。经两步层析纯化后,毒素纯度达到2000Lf/mg PN以上,回收率为52%~73%。用此方法,连续纯化五批毒素,均获得高纯度的破伤风毒素。试验证明破伤风毒素经疏水层析和离子交换层析可得到有效纯化。     

重组人RGD-sTRAIL的表达、纯化及抗肿瘤活性研究

利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20％左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95％的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。     

槲皮素下调hTERT表达对肝癌HepG2细胞生长影响研究

目的观察槲皮素对肝癌HepG2细胞生长及对hTERT基因表达的影响。方法以台盼蓝拒染法计数肝癌细胞的生长抑制率,透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,western-blot、RT-PCR检测hTERT基因表达改变,PCR-TRAP法检测端粒酶活性。结果台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48h后的Ic50为25.5μm。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经10～20μm/L的槲皮素处理,肝癌HepG2细胞周期阻滞于G0/G1期,且HepG2细胞hTERT蛋白和mRNA表达降低,端粒酶活性受抑制。结论槲皮素能抑制肝癌细胞的生长,呈时间、剂量依赖性,能诱导HepG2细胞发生凋亡,其抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调hTERT基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性有关。     

T—2毒素对心肌细胞三型钙通道的阻滞作用

用膜片钳连细胞电压钳法,在培养的Ｗｉｓｔａｒ大鼠单个心肌细胞上记录了Ｔ－２毒素对Ｂ,Ｌ和Ｔ三型Ｃａ＾２＋通道单通道电活动的影响,结果表明,Ｔ－２毒素浓度为１０ｍｇ／Ｌ时,心肌细胞Ｂ,Ｌ和Ｔ三型Ｃａ＾２＋通道均受到有显的阻滞,其阻滞作用表现为Ｃａ＾２＋通道的开放概率减小,开放时间缩短,关闭时间延长,而对流过Ｃａ＾２｜通道的Ｂａ＾２＋流幅值无影响。     

T-2毒素对于猪肝细胞毒性的分子机制研究

为了探讨T-2毒素对于家畜的毒性机理及诱导凋亡的分子机制,用T-2毒素对猪的肝脏细胞进行暴露,暴露浓度分别为0、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L,暴露时间为48h,然后用微阵列技术检测0.05mg/L处理组基因表达谱的变化。结果表明,氧化应激和细胞凋亡相关基因发生上调,药物和脂质代谢的基因发生下调,同时荧光定量PCR对细胞色素P450家族的CYP2D25和CYP51两个药物代谢基因的表达情况进行了进一步的验证。结果表明,T-2毒素对猪肝细胞的毒性机制可能是引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径氧化应激,进而导致细胞凋亡。     

T－2毒素对心肌细胞三型钙通道的阻滞作用

用膜片钳连细胞电压钳法, 在培养的Wistar大鼠单个心肌细胞上记录了T-2毒素对B、L和T三型Ca²⁺通道单通道电活动的影响. 结果表明, T-2毒素浓度为10mg/L时, 心肌细胞B、L和T三型Ca²⁺通道均受到明显的阻滞, 其阻滞作用表现为使Ca²⁺通道的开放概率减小, 开放时间缩短, 关闭时间延长, 而对流过Ca²⁺通道的Ba²⁺流幅值无影响.     

Vero毒素—1的纯化及特性分析

从含有VT1全基因的基因工程菌中纯化出VT1。纯化的步骤包括（NH4）2SO4盐析,两次DEAE Sepharose Fast Flow柱层析。最终从4L培养物中纯化出1.5mg纯毒素,收率为8．6％,梯度Native-PAGE测定毒素的分子量为70kD,SDS－PAGE电泳表明毒素有两个亚基,分子量分别是32kD和7.7kD。对VT1的多种生物学特性进行了研究;经测定VT1对Vero细胞的半数致死量CD50为1pg,对小鼠的半数致死量LD50为18ng,引起兔肠襻积液的最小毒素量是1．25μg/肠襻。     

凋亡蛋白的基因表达、纯化和体外活性

来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质凋亡蛋白（apoptin）能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,原核表达的凋亡蛋白是否具有体内的凋亡活性,对于用无细胞体系研究凋亡蛋白诱导肿瘤细胞凋亡机制和今后更好地开发凋亡素的临床应用具有重要意义。据此,采用原核表达载体pBV220和 pPROEXHT进行了凋亡蛋白的原核表达和纯化复性研究,体外证明了凋亡蛋白的凋亡诱导活性,并揭示原核表达的凋亡蛋白即使没有细胞质的参与,仍具有诱导细胞核凋亡的活性。     

镰刀菌毒素的研究 Ⅱ.T-2毒素的提取、纯化及结构鉴定

本文报道了三线镰刀菌M-20(Fusarium tricinctum)接种于已灭菌的玉米粒培养基中,于13℃培养30天后,提取培养物所得粗毒素。经二次硅胶柱层析纯化后,经丙酮-正己烷结晶,可获得白色针状结晶。根据它的熔点(151—2℃)R_f0.56,LD_(50)2.5,mg/kg。分子量466,FD质谱测定,~1H核磁共振谱及EI质谱,确证结晶为T-2毒素。     

镰刀菌毒素的研究II．T-2毒素的提取、纯化及结构鉴定

本文报道了三线镰刀菌M-20(Fusarium tricinctum)接种于已灭菌的玉米粒培养基中,于13℃培养30天后,提取培养物所得粗毒素。经二次硅胶柱层析纯化后,经丙酮-正己烷结晶,可获得白色针状结晶。根据它的熔点(151—2℃)R_f0.56,LD_(50)2.5,mg/kg。分子量466,FD质谱测定,~1H核磁共振谱及EI质谱,确证结晶为T-2毒素。     

IFN-λ1在HEK293T细胞中表达纯化及活性检测

[目的]构建IFN-λ1真核表达质粒,利用人胚胎肾HEK293T细胞表达系统,获得具有良好生物学活性的IFN-λ1重组蛋白。[方法]将IFN-λ1目的基因克隆到pcDNA3.1+载体NheⅠ与XhoⅠ多克隆位点构建pcDNA3.1-IFN-λ1分泌表达质粒,并将其转染到HEK293T细胞中;采用Ni-NTA亲和层析方法分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE和蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测IFN-λ1的表达与纯度;采用qPCR、WB结合显微镜观察检测IFN-λ1的生物学活性。[结果]IFN-λ1真核表达质粒构建正确,而且能够在HEK293T细胞中分泌表达重组蛋白,分离纯化的IFN-λ1能够有效地诱导ISG15、ISG54、ISG56、OAS1、TNFα、MX1和TRAIL等凋亡相关基因的表达,激活p38促凋亡信号通路,抑制水泡性口炎病毒对BHK-21细胞的感染。[结论]成功构建了pcDNA3.1-IFN-λ1真核表达质粒,能够在HEK293T细胞中分泌表达IFN-λ1重组蛋白;分离纯化的IFN-λ1重组蛋白具有潜在的抗肿瘤和抗病毒生物学活性,为进一步研究IFN-λ1的功能和临床应用奠定了基础。