慢性吸烟大鼠气道平滑肌大电导的钙激活钾通道和Kv1.5表达的变化

复制大鼠的慢性吸烟模型,采用气道反应性的测定、HE染色、免疫组织化学染色、原位杂交和免疫印迹实验等方法,观察吸烟对大鼠支气管平滑肌大电导的钙激活的钾通道(BKca)和电压依赖性延迟整流钾通道Kv1．5蛋白和mRNA表达的影响,以阐明吸烟引起的气道高反应性发病机制中钾通道表达变化的作用。结果显示：(1)慢性吸烟可降低大鼠大气道和小气道BKca和Kv1．5蛋白和mRNA表达;(2)大气道BKca的降低程度大于Kv1．5,小气道BKca和Kv1．5的降低程度无明显差异：(3)吸烟对全肺组织BKca和Kv1．5的蛋白表达无明显影响。上述结果提示,慢性吸烟可下调大鼠气道平滑肌钾通道BKca和Kv1．5的表达水平,是导致气道高反应的机制之一。     

MKL1靶向CAAP1促进胃癌细胞的自噬并抑制凋亡

[目的]探讨MKL1和CAAP1对胃癌细胞凋亡的影响及其分子机制。[方法]蛋白质印迹和实时荧光定量PCR检测MKL1、CAAP1过表达效果;蛋白质印迹、流式细胞术、自噬检测试剂盒检测细胞的自噬和凋亡情况;荧光素酶报告基因活性测定、染色质免疫共沉淀验证MKL1和CAAP1基因启动子的结合。[结果]在MGC80-3细胞中过量表达MKL1后,凋亡抑制蛋白CAAP1的mRNA和蛋白水平与对照组相比均上调(P 0. 05),自噬标记基因LC3BII表达升高(P 0. 05),促凋亡蛋白Caspase3表达降低(P 0. 05)。敲降MKL1,Caspase3蛋白表达升高(P 0. 05)。敲降CAAP1,Caspase3蛋白表达升高(P 0. 05)。过表达CAAP1拮抗敲降MKL1,LC3BII蛋白表达下降,Caspase3蛋白表达升高(P 0. 05)。荧光素酶活性分析以及染色质免疫共沉淀分析结果表明MKL1促进CAAP1基因的转录活性。[结论]MKL1可通过上调CAAP1的表达进而促进胃癌细胞的自噬并抑制细胞凋亡。     

2型腺相关病毒载体介导的apoAⅠ和SR-BⅠ双基因表达对动脉硬化模型鼠保护效应的研究

重组腺相关病毒载体(AAV)具有很多安全方面的特性,有利于其在动脉硬化方面的治疗研究.尽管如此,传统的介导单个基因的治疗效果并不是很理想,这都归因于动脉硬化疾病的发生是由于多种基因的缺陷而不是单单某一特定基因.为了克服这个问题,尝试了重组腺相关病毒载体介导的双基因对动脉硬化的治疗研究.实验大鼠分为动脉硬化模型鼠和正常饮食组(即正常对照组),动脉硬化组大鼠被随机分为3组,分别进行AAV-apoAⅠ/SR-BⅠ,AAV-apoAⅠ,与AAV-GFP尾静脉注射,同时正常饮食组尾静脉注射PBS作为对照.其中目的基因mRNA检测采用RT-PCR方法,蛋白质表达的检测采用Western blotting和ELISA.由饮食诱导的动脉硬化和高胆固醇的大鼠模型在尾静脉注射后8周进行冰冻切片的荧光检测.重组AAV载体显示出较强的表达活性.尾静脉注射治疗8周后,AAV-apoAⅠ/SR-BⅠ与AAV-apoAⅠ治疗组血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇浓度与AAV-GFP治疗组相比有了明显下降(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇浓度各组之间没有明显差异,彩色多普勒超声检测发现,AAV-apoAⅠ/SR-BⅠ与AAV-apoAⅠ治疗组的腹主动脉的内中膜厚度相对于AAV-GFP治疗组有了明显下降(P<0.05),血清hs-CRP和SOD的水平有了明显上升(P<0.01),血清MDA的水平有了明显的下降(P<0.01).同时也检测了动脉硬化相关基因mRNA水平的表达.结果显示,rAAV-hapoAⅠ-IRES-hSR-BⅠ治疗后可能是通过抑制NF-κB的活性发挥抗炎作用减少炎症因子的释放,增加动脉硬化板块的稳定性以及降低血浆胆固醇含量的.总之,利用2型腺相关病毒载体介导的基因转移过度表达人载脂蛋白AⅠ和SR-BⅠ可能对饮食诱发大鼠高胆固醇血症和动脉硬化的产生有利影响.这些结果可能为动脉粥样硬化基因治疗提供了一种新的研究思路.     

萝卜硫素诱导RASD1的表达促进宫颈癌HELA细胞凋亡及周期阻滞的机制研究

目的:探讨萝卜硫素靶向RASD1,对宫颈癌细胞(HELA)凋亡及周期的影响机制。方法:不同浓度的萝卜硫素(SFN)作用于HELA细胞48h,采用CCK-8法检测SFN对HELA细胞增殖的影响;采用RT-PCR法检测SFN对RASD1基因mRNA表达水平的影响;采用Western印迹法检测SFN对RASD1蛋白表达水平的影响;采用流式细胞技术检测加药以及过表达RASD1对HELA细胞凋亡及周期的影响,采用Western blot检测HELA中cleaved-caspase3和cleaved-parp相关凋亡蛋白以及p21和cdc2周期相关蛋白的影响。结果:SFN抑制宫颈癌细胞增殖,且加药组中RASD1的mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。流式细胞凋亡分析结果提示:加SFN或是过表达RASD1细胞组凋亡率明显高于对照组,Western blot结果表明加SFN或过表达RASD1后细胞cleaved-caspase3以及cleaved-parp蛋白水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);ModFit LT软件分析结果表明加SFN或过表达RASD1细胞S期显著低于对照组,G2/M期细胞增多,同时Western blot结果示p21蛋白的表达水平增高,而cdc2蛋白表达降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论:在宫颈癌HELA细胞中RASD1作为SFN的作用靶点,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。     

CHFR,PARP-1基因对B细胞淋巴瘤Raji细胞增殖和凋亡的影响（英文）

目的:探讨CHFR与聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)基因对B细胞淋巴瘤Raji细胞增殖和凋亡的影响。方法:用5-Aza-d C处理Raji细胞,后通过qRT-PCR检测CHFR的mRNA表达水平,western blot评估CHFR、PARP-1的蛋白表达。经CHFR慢病毒转染Raji细胞后,用qRT-PCR和western blot评估RAJI细胞中的CHFR、PARP-1变化。通过CCK-8法测定细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:与对照组相比,经5-Aza-d C处理Raji组的CHFR mRNA表达显著上调(P0.01),PARP-1mRNA水平和蛋白表达水平明显降低(P0.05)。与对照组相比,Sh RNA组CHFR的mRNA表达显着下调(均P0.01),PARP-1mRNA和蛋白表达水平升高(P0.05)。CCK结果显示CHFR Sh RNA组细胞活力明显低于对照组(P0.05)。流式细胞术结果显示CHFR沉默后细胞凋亡率降低(P0.05)。结论:CHFR可能通过PARP-1调控B淋巴细胞的增殖和凋亡。     

IGF2BP1对白血病干细胞特性维持的作用

[目的]探究胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)调控HOXB4、MYB、ALDH1A1表达在白血病干细胞特性维持中的作用。[方法] K562细胞分为3组:对照组、IGF2BP1组、siIGF2BP1组。通过转染过表达或沉默IGF2BP1。分别对各组细胞的增殖、凋亡、体外干细胞成球能力进行检测。检测HOXB4、MYB、ALDH1A1 mRNA和蛋白水平。[结果]三组细胞的上述指标比较差异显著(P<0.05)。IGF2BP1组细胞的IGF2BP1增殖(0.75±0.07,1.34±0.12)、成球数量(98.23±4.16)个和大小(205.97±9.54)μm、HOXB4、MYB、ALDH1A1 mRNA和蛋白水平显著高于对照组,凋亡率(3.62%±0.35%)显著低于对照组(P<0.05)。siIGF2BP1组细胞的IGF2BP1、增殖(0.46±0.04,0.81±0.08)、成球数量(25.76±1.35)个和大小(85.44±2.37)μm、HOXB4、MYB、ALDH1A1 mRNA和蛋白水平显著低于对照组,凋亡率(18.34±0.27)%显著高于对照组(P<0.05)。[结论]过表达IGF2BP1上调了HOXB4、MYB、ALDH1A1 mRNA和蛋白表达,促进白血病干细胞特性的维持。     

肿瘤对小鼠肾上腺皮质细胞胆固醇稳态分子表达的影响

目的探讨肝癌状态下肿瘤大小对肾上腺皮质细胞内胆固醇稳态分子表达的影响。方法在220只KM小鼠右腋下接种H22肝癌腹水细胞,复制肝癌荷瘤小鼠模型,在接种第11天依据肿瘤体积排序,筛选瘤体大组和瘤体小组各18只,并设立18只正常小鼠为对照组。采用生化方法检测血脂含量;应用实时荧光定量PCR检测各组小鼠肾上腺组织Srb1、Ldlr、Npc1、Npc2、Stard3、Hmgcr、Lipe、Acat1、Abca1、Abcg1、Srebp-1c、Lxrα、Lxrβ、Rxrα、Apoa1、Apoe基因mRNA表达,并以Gapdh和β-actin两个基因作内参照;应用Western blot方法检测SRB1和Apo A1蛋白表达。结果瘤体大组小鼠肿瘤质量明显大于瘤体小组(P0.05);与正常组比较,两组肝癌小鼠血浆HDL-C显著下降(P0.05);瘤体大组肝癌小鼠,肾上腺皮质细胞胆固醇摄取相关分子Srb1、Ldlr、Apoa1基因表达显著升高(P0.05),且SRB1蛋白表达显著升高(P0.05)、而Apo A1蛋白表达在肿瘤大组明显高于肿瘤小组(P0.05);调节胆固醇酯化及其分解酶Acat1与Lipe基因表达在瘤体大组显著低于肿瘤小组(P0.05);调节胆固醇逆向流出胞外的Abca1和Abcg1基因表达在瘤体大组也显著下降(P0.05);而调控细胞胆固醇稳态的核受体Srebp-1c、Lxrα与Rxrα基因表达无明显变化,但肿瘤小组Srebp-1c、Lxrβ与Rxrα基因表达显著升高(P0.05)。内质网合成胆固醇的酶Hmgcr与载脂蛋白Apoe在各组间均无显著差异。结论在肝癌状态下,小鼠为适应肿瘤慢性反复的应激,肾上腺皮质细胞能有效利用胆固醇合成皮质激素。     

大鼠海马神经细胞VDAC1基因shRNA慢病毒表达载体的构建及干扰效果评价

目的:构建线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC1)短发卡样RNA重组慢病毒(LV)载体,沉默海马神经细胞VDAC1基因表达,观察所构建的慢病毒载体对海马神经细胞的干扰效果。方法:根据基因库提供的大鼠VDAC1基因的核苷酸序列(序列号为：AB039662.1),设计合成3条LV3-VDAC1-shRNA及1条无义的阴性表达载体;将构建好的慢病毒载体转染到海马神经细胞,按照不同的转染条件对细胞分为空载组、对照(NC)组、病毒组,分别在病毒感染复数(MOI)值在100和10的条件下进行转染;采用荧光定量PCR和Western blot的方法分别检测VDAC1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果:与空载组相比,慢病毒感染组的扩增倍数均大于1,VDAC1基因在mRNA水平与蛋白水平表达均明显升高(P<0.05);与对照组相比,病毒感染复数(MOI)=10与MOI=100之间没有显著差异(P>0.05);PCR结果与Western blot结果综合来看,VDAC1转录水平表达越高,蛋白水平表达越低,呈现反向关联的状态。结论:三种慢病毒对海马神经细胞都有干扰效果,VDAC1基因的mR...     

RNA干扰CD151基因表达抑制肝癌细胞侵袭

目的研究RNA干扰(RNA interference RNAi)抑制CD151表达对人类肝癌细胞迁移侵袭的影响及分子机制。方法将CD151-siRNA在脂质体介导下瞬时转入人肝癌HepG2细胞,倒置荧光显微镜观察转染效率,用qPCR,western blot检测HepG2细胞CD151mRNA和蛋白表达,体外研究肿瘤细胞迁移和侵袭能力,并检测相关信号通路的变化。结果成功转染CD151-siRNA后,HepG2细胞CD151基因的表达与正常对照组和阴性对照组相比,mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05),细胞迁移和侵袭能力明显下降(P0.05),同时,沉默CD151的表达,FAK,ERK的磷酸化受抑制。结论CD151-siRNA能有效抑制人肝癌细胞CD151基因mRNA和蛋白的表达,通过抑制FAK,ERK蛋白的磷酸化水平,降低细胞的迁移和侵袭力。     

降脂益生菌调节胆固醇代谢 改善小鼠非酒精性脂肪肝

目的研究一种由鼠李糖乳杆菌DM9054和植物乳杆菌86066构成的降脂益生菌组合对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠胆固醇代谢的影响及其可能机制。方法 24只雄性LDLR-/-小鼠随机分为对照组、模型组和益生菌干预组。高脂饮食(HFD)15周建立小鼠NAFLD模型,造模同时干预组给予鼠李糖乳杆菌DM9054联合植物乳杆菌86066灌胃,对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。实验过程中监测各组小鼠体重变化。实验结束后,检测小鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL)的水平差异。检测小鼠肝脏组织病理变化。使用Realtime PCR检测小鼠肠道内法尼脂受体(FXR)mRNA、顶端膜钠依赖的胆汁酸转运体(ASBT)mRNA、纤维生长因子15(FGF-15)mRNA和三磷酸腺苷结合盒转运体G5(ABCG-5)mRNA表达水平。Western blot检测小鼠肝脏胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、FXR、三磷酸腺苷结合盒转运体G8(ABCG-8)、清道夫受体BI(SR-BI)、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、胆盐输出泵(ABCB-11)、纤维生长因子受体4(FGFR-4)和胆固醇调节元件结合蛋白-2(SREBP-2)蛋白表达水平。结果与模型组相比,降脂益生菌干预组小鼠体重减轻(P0.05);小鼠血清TC、TG、LDL水平降低,HDL水平升高(P0.05);小鼠肝脏脂肪变性和炎性细胞浸润的现象显著减少;小鼠肠道ASBT mRNA和ABCG-5mRNA表达水平明显降低(Ps0.05),FGF-15mRNA表达水平明显升高(P0.05),FXR mRNA表达水平差异无统计学意义(P0.05);小鼠肝脏FGFR-4蛋白表达水平升高(P0.05),SREBP-2和HMGCR蛋白表达水平降低(Ps0.05),FXR、CYP7A1、SR-BI、ABCG-8和ABCB-11蛋白表达水平差异无统计学意义(Ps0.05)。结论降脂益生菌可能通过激活FXR-FGF15通路调节胆汁酸代谢;通过下调SREBP-2表达水平,抑制HMGCR表达,减少胆固醇的生成,从而起到改善非酒精性脂肪肝的作用。     

miR-149-5p靶向DCLK1基因对乳腺癌细胞MCF-7/DDP顺铂耐药的影响

[目的]探讨miR-149-5p靶向双皮质素样激酶1(DCLK1)基因对乳腺癌细胞MCF-7/DDP顺铂耐药的影响。[方法]构建DDP耐药乳腺癌MCF-7细胞,然后按细胞转染质粒的不同分入对照组(不转染质粒)、空载组(转染空载质粒3.1)、miRNA-149-5p组(转染miRNA-149-5p-AH质粒)。采用CCK-8法检测细胞存活率,划痕实验检测细胞迁移力,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测细胞miRNA-149-5p和DCLK1 mRNA水平,Western Bloting检测细胞DCLK1蛋白表达水平。[结果] miRNA-149-5p组乳腺癌MCF-7/DDP细胞miRNA-149-5p水平、细胞凋亡率显著高于对照组和空载组,DCLK1 mRNA和蛋白水平、细胞存活率和细胞迁移率显著低于对照组和空载组,差异均有统计学意义(P<0.05)。空载组和对照组miRNA-149-5p水平、细胞凋亡率、DCLK1 mRNA和蛋白表达、细胞存活率和细胞迁移率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。[结论]过表达miRNA-149-5p可减弱乳腺癌MCF-7/D...     

大电导钙激活钾通道对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

为了观察开放和拮抗大电导钙激活钾通道（bigconductanceCa2＋-activated砧channel．BKca）对大鼠骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）增殖的影响并探讨其机制,该研究分离培养了大鼠BMSCs,采用BKca通道特异性开放剂msl619）和拮抗剂（IBTX）干预,MTT、平板克隆测定细胞增殖活力及细胞克隆形成能力;流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期分布;Westernblot、定量PCR检测周期蛋白cyclinD1基因和蛋白表达水平;整细胞膜片钳技术分析细胞膜电生理特性。结果显示,NS1619干预组与对照组相比,BMSCs~胞膜科通道外向电流振幅增大,细胞增殖能力和克隆形成能力增强,凋亡减少。此外,开放BKca通道明显促进细胞从G1期向S期过渡,cyclinD1蛋白7LmRNA表达上调,而拮抗BKca通道则相反。推测,BKca通道通过调节细胞周期进程最终影响细胞增殖,该作用可能与其具有调控细胞膜心电流的电生理特性有关。     

绞股蓝皂苷调控长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡对ApoE~(-/-)AS小鼠肝脏脂质沉积的影响及机制研究

为探讨绞股蓝皂苷通过影响长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡改善ApoE~(-/-)AS小鼠肝脏脂质沉积防治AS机制,本实验将10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组,20只健康ApoE~(-/-)小鼠随机分为模型组、绞股蓝皂苷组(高脂饲料喂养12周),灌胃给药4周。HE染色观察小鼠肝脏脂质沉积情况,全自动生化分析仪检测血脂水平,实时荧光定量Q-PCR检测长链非编码TUG1、miRNA-26a表达,实时荧光定量Q-PCR及Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP基因及蛋白表达。结果显示模型组ApoE~(-/-)小鼠血脂水平发生紊乱,肝细胞体积变大,脂肪空泡明显,小鼠肝脏Lnc-TUG1表达显著升高,miRNA-26a显著下降(P0.01);Bax、Cyt-c、cleaved caspase-3、cleaved PARP mRNA及蛋白表达显著升高,Bcl2 mRNA及蛋白显著下降(P0.01或P0.05);cleaved caspase-9蛋白表达显著升高(P0.01或P0.05),cleaved caspase-9 mRNA仅有上升趋势;绞股蓝皂苷干预后血脂紊乱得以改善,肝细胞脂肪变性程度减轻,脂肪空泡明显减少,小鼠肝脏Lnc TUG1表达有所下降,miRNA-26a表达有所上调(P0.05),小鼠肝脏Bax、Cyt-c、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 mRNA及蛋白表达显著下调,Bcl2 mRNA及蛋白显著上调(P0.01或P0.05),cleaved PARP蛋白表达显著下调(P0.05),cleaved PARP mRNA仅有下调趋势;研究结果提示绞股蓝皂苷可能通过影响长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡改善ApoE~(-/-)AS小鼠肝脏脂质沉积,进而防治动脉粥样硬化。     

miR-659-3p靶向CTNNBIP1调控甲状腺癌细胞凋亡的机制

[目的]探讨miR-659-3p在甲状腺癌细胞中的潜在功能和机制。[方法]纳入甲状腺乳头癌患者60例,比较甲状腺患者癌旁组织和癌组织中miR-659-3p的表达水平。过表达或敲低miR-659-3p后检测甲状腺癌细胞TPC-1的增殖水平和凋亡水平,并进行底物鉴定。[结果] miR-659-3p的表达水平在60个甲状腺癌组织中也显著上调(P<0.05)。miR-659-3p敲低后TPC-1的增殖水平显著下降(P<0.05)、 TPC-1的凋亡水平显著上升(P<0.05)。敲低CTNNBIP1时,TPC-1的凋亡水平下降(P<0.05)、 TPC-1的细胞活力水平上升(P<0.05)。过表达miR-659-3p时,CTNNBIP1的蛋白水平和mRNA水平显著下降(P<0.05);敲低miR-659-3p时,CTNNBIP1的蛋白水平和mRNA水平显著上升(P<0.05)。过表达miR-659-3p后,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin的核定位增多;敲低miR-659-3p后,β-catenin的核定位减少。[结论] miR-...     

p53在蓝莓花青素诱导Lovo细胞凋亡中的作用

[目的]研究蓝莓花青素(BA)对人结肠癌Lovo细胞增殖及凋亡的影响,分析凋亡相关基因—p53基因mRNA和蛋白表达的变化。[方法]分别用浓度为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的BA处理结肠癌Lovo细胞24h,采用MTT法、免疫荧光法和Real-time PCR法和免疫细胞组织化学分析BA对Lovo细胞增殖、细胞凋亡、p53 mRNA和蛋白表达的影响。[结果]BA呈剂量依赖的方式抑制Lovo细胞增殖;能诱导细胞发生晚期凋亡;与对照组相比,不同浓度BA处理后p53基因mRNA表达水平分别上调0.602、0.697、0.541倍(P0.05),但BA不同剂量组间并无明显的差异(P0.05);免疫细胞组化结果表明随着BA浓度的增加,p53表达增强。[结论]BA可以诱导结肠癌Lovo细胞发生晚期凋亡,p53基因mRNA表达上调,但与BA的浓度无相关性。     

靶向人CHOP基因shRNA真核表达载体的构建

[目的]构建靶向干扰内质网应激标志性因子CHOP的shRNA真核表达载体,并检测其对CHOP的干扰效率。[方法]查询Gen Bank数据库,获取人源CHOP基因mRNA的序列,按照小干扰RNA(siRNA)靶序列的设计原则,设计并构建靶向CHOP基因mRNA的4个特异性shRNA真核表达载体(shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4)和1个无同源性的阴性对照载体(shRNA-NC),经PCR和测序鉴定确认shRNA载体构建成功后,脂质体转染人正常肝细胞系(L-02),Western Blot法检测CHOP蛋白的表达,筛选出干扰效果最好的表达载体。[结果]PCR和测序结果显示,5个shRNA表达载体均构建成功。Western Blot结果显示,0.06 g/L衣霉素损伤24h后,与内质网应激模型组相比,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4组的CHOP蛋白表达水平均明显降低(P0.01),其中shRNA-1和shRNA-4组CHOP干扰效果最明显。[结论]构建了并成功筛选出靶向干扰CHOP基因的真核表达载体,为深入研究CHOP介导内质网应激所致细胞凋亡的信号通路奠定了实验基础。     

SUSD2基因干扰表达载体的构建及在A549细胞中鉴定北大核心

[目的]构建SUSD2基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并在人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞中鉴定。[方法]设计合成SUSD2基因shRNA片段,连接到经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切的psi-m H1 shRNA载体中,构建干扰表达载体psi-m H1-SUSD2 shRNA,酶切后测序鉴定;将干扰载体psi-m H1-SUSD2 shRNA转染A549细胞,荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot法检测干扰载体的干扰效率。[结果]酶切和测序结果显示成功构建了SUSD2基因shRNA的表达载体,q-PCR和Western Blot结果显示最佳干扰载体可使SUSD2 mRNA相对表达量下调75%以上,并可明显抑制A549细胞中SUSD2蛋白的表达。[结论]成功构建了SUSD2基因干扰表达载体,并在A549细胞中有效干扰SUSD2基因的表达。     

SUSD2基因干扰表达载体的构建及在A549细胞中鉴定

[目的]构建SUSD2基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并在人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞中鉴定。[方法]设计合成SUSD2基因shRNA片段,连接到经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切的psi-m H1 shRNA载体中,构建干扰表达载体psi-m H1-SUSD2 shRNA,酶切后测序鉴定;将干扰载体psi-m H1-SUSD2 shRNA转染A549细胞,荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot法检测干扰载体的干扰效率。[结果]酶切和测序结果显示成功构建了SUSD2基因shRNA的表达载体,q-PCR和Western Blot结果显示最佳干扰载体可使SUSD2 mRNA相对表达量下调75%以上,并可明显抑制A549细胞中SUSD2蛋白的表达。[结论]成功构建了SUSD2基因干扰表达载体,并在A549细胞中有效干扰SUSD2基因的表达。