甘草次酸调节BLM的转录及PC3细胞的增殖凋亡和迁移侵袭

[目的]探究甘草次酸(GA)影响前列腺癌(PC3)细胞BLM基因的转录以及细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的情况。[方法]MTT法检测细胞增殖能力并筛选适宜的药物浓度,荧光定量PCR检测BLM基因的表达量,划痕法检测细胞迁移,Transwell小室检测细胞侵袭,流式细胞仪检测细胞凋亡。[结果]甘草次酸浓度在0.12 mol/L~0.36 mol/L范围时,随着浓度增大,细胞的增殖能力逐渐下降,呈现药物浓度梯度依赖性;当甘草次酸浓度为0.2 mol/L时,PC3细胞中BLM的mRNA的表达量仅有对照组的0.2倍;甘草次酸浓度在0.10 mol/L以上时,细胞的侵袭和迁移能力均显著减小;流式结果显示甘草次酸浓度在0.10 mol/L时,细胞凋亡率为45.25±0.5**,差异极显著(P0.01)。[结论]甘草次酸浓度为0.15 mol/L以上时,能够下调PC3细胞中BLM基因的转录量(P0.01),在0.12 mol/L~0.36 mol/L范围时,对PC3细胞的增殖、侵袭、迁移具有抑制作用,对PC3细胞凋亡具有促进作用。     

干燥综合征合并特发性肺纤维化miRNA表达谱的变化及生物标志物的研究*

目的: 探究干燥综合征合并特发性肺纤维化患者血清中miRNA表达谱之间的差异关系。方法: 选择在云南省第一人民医院确诊为干燥综合征的3例患者作为对照组,平均年龄为(55.67±4.78) 岁,病程为(10.67±1.70)月;3例干燥综合征合并特发性肺纤维化患者作为观察组,平均年龄为(57.67±3.68) 岁,病程为(11.00±2.45) 月;6例患者均为女性。两组基本资料没有差异(P＞0.05)。利用芯片检测两组患者血清中miRNA表达谱的差异。通过GO富集分析,筛选出13个免疫细胞功能相关的聚类;表达差异明显的基因集中于免疫调节的信号通路。采用qRT-PCR验证其中5个表达有差异的miRNA。结果: 芯片检测结果共筛选出差异表达基因13个,其中6个miRNA上调:hsa-miR-6740-5p,hsa-miR-4507,hsa-miR-6775-5p,hsa-miR-4281,hsa-miR-4459,hsa-miR-6089,7个miRNA下调:hsa-miR-6873-3p,hsa-miR-4290,hsa-miR-6858-3p,hsa-miR-574-3p,hsa-miR-92b-3p,hsa-miR-3151-3p,hsa-miR-6886-3p。qRT-PCR结果验证了5个最明显的差异miRNA,结果和芯片趋势一致,差异显著,具有统计学意义。结论: 干燥综合征与干燥综合征合并特发性肺纤维化血清中miRNA表达存在差异,其中miR-6886-3p,miR-6873-3p,miR-574-3p,miR-6740-5p和miR-4507特异性和敏感度较高,可能作为干燥综合征特发性肺纤维化区别于原发性干燥综合征的生物标志物。     

hsa-miR-1249和hsa-miR-486-5p与Ⅱ型糖尿病的相关性研究

microRNAs(miRNAs)是一类普遍存在于真核细胞的非编码小分子RNA,通常在转录后水平抑制靶基因的表达。miRNA表达失调与许多疾病相关,如Ⅱ型糖尿病(T2D)。Ⅱ型糖尿病是一种复杂的疾病,显著特征是高血糖。近年来的研究表明,miRNA在Ⅱ型糖尿病的发生发展中扮演着不同的角色。本研究通过miRNA微阵列芯片和实时荧光定量PCR的方法,发现hsa-miR-1249和hsa-miR-486-5p在Ⅱ型糖尿病患者血浆中较之于正常对照组表达显著降低,显示了hsa-miR-1249和hsa-miR-486-5p可能在Ⅱ型糖尿病的发病过程中起着重要的作用。本研究揭示了hsa-miR-1249和hsa-miR-486-5p有可能成为Ⅱ型糖尿病的新的诊断标志物和治疗靶标。     

PD-L1蛋白过表达对HeLa细胞迁移能力的影响

[目的]探讨PD-L1过表达对HeLa细胞迁移的影响。[方法]通过分子克隆构建PD-L1质粒载体(p EGFPPD-L1);通过PEI法转染质粒,调节质粒转染量(1μg、3μg、5μg)和转染时间(24 h、36 h、48 h、72 h),优化转染条件;通过细胞划痕实验检测细胞融合率,Western Blot检测细胞迁移相关蛋白(E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白)的表达量。[结果]最佳转染条件是质粒量3μg/孔,转染后48 h观察,此时转染效率可达(82.94±8.08)%。转染pEGFP-PD-L1质粒后,HeLa细胞的PD-L1过表达3.5倍,划痕融合率显著增高(p0.01);波形蛋白和N-钙黏蛋白的表达量显著升高(p0.05),E-钙黏蛋白表达量显著下降(p0.05)。[结论]PD-L1过表达显著促进HeLa细胞迁移能力和上皮向间质转化水平。     

亚油酸对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪和乳蛋白合成相关基因表达的影响

该文主要研究了添加不同浓度的亚油酸(顺-9,顺-12-十八碳二烯酸)(0、20、40、80、120μmol/L)对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响。通过MTT法检测细胞活力,利用甘油三酯试剂盒检测BMECs内甘油三酯(triglyceride,TAG)的合成量,实时荧光定量PCR检测乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达。结果表明:(1)添加20μmol/L的亚油酸能促进BMECs的增殖,120μmol/L的亚油酸组BMECs的相对增殖率显著低于对照组(P0.05);(2)40μmol/L和80μmol/L亚油酸添加组BMECs中TAG的合成量显著高于对照组(P0.05);(3)添加20μmol/L亚油酸显著上调αs1-酪蛋白(casein alpha s1 identifiers symbols,CSN1S1)和κ-酪蛋白(κ-casein,CSN3)基因的表达,而80μmol/L和120μmol/L亚油酸显著下调CSN1S1和CSN3基因的表达(P0.05);(4)120μmol/L亚油酸上调了真核启始4E结合蛋白-1(eukaryotic initiation factor 4E-binding-protein-1,4EBP1)基因的表达,下调了核糖体蛋白S6激酶-1(ribosomal protein S6 kinase-1,RPS6K1)基因的表达(P0.05);(5)添加20~120μmol/L亚油酸显著下调脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-Co A desaturase,SCD)、脂肪酸结合蛋白-3(fatty acid-binding protein-3,FABP3)的基因表达(P0.05);(6)20μmol/L亚油酸添加组过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARG)基因表达量显著高于对照组,而120μmol/L亚油酸组PPARG、固醇调节元件结合因子-1(sterol regulatory element binding factor-1,SREBF1)的表达量显著低于对照组(P0.05)。综上所述,20~40μmol/L的亚油酸对BMECs乳脂肪和乳蛋白合成有较好的促进效果。     

操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物

【目的】操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶,生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素。【方法】构建了4个茶树类黄酮3′-羟基化酶基因(CsF3′H)和拟南芥的P450还原酶基因(ATR)融合表达质粒:SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR2[75-711]3 AA和SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR2[75-711]3 AA,分别转化大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21,获得12个转化菌株S1–S12;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒p YES-Dest52-CsF3′H,转化酵母菌株WAT11,得到转化菌株S13;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒pES-URA-CsF3′H,及茶树黄烷酮3-羟基化酶基因CsF3H与拟南芥黄酮醇合成酶基因At FLS的融合表达质粒pES-HIS-CsF3H::At FLS 9AA,二者共转化酵母菌株WAT11,获得转化菌株S14。【结果】转化SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA质粒的TOP10菌株S6在25°C条件下发酵,转化效率最高,能将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,分别转化生成287.93μmol/L圣草酚、131.76μmol/L二氢槲皮素和188.62μmol/L槲皮素。发酵菌株S13能分别将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,最多能转化生成734.32μmol/L圣草酚、446.07μmol/L二氢槲皮素和594.64μmol/L槲皮素。喂食S14发酵菌株5 mmol/L的底物柚皮素,在发酵36–48 h中,最多能生成1412.16μmol/L圣草酚、490.25μmol/L山奈酚、445.75μmol/L槲皮素、66.75μmol/L二氢槲皮素和73.50μmol/L二氢山奈酚。【结论】本研究首次将茶树类黄酮3′-羟基化酶基因应用于B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的生物合成。     

PD-L1蛋白过表达对HeLa细胞迁移能力的影响北大核心

[目的]探讨PD-L1过表达对HeLa细胞迁移的影响。[方法]通过分子克隆构建PD-L1质粒载体(p EGFPPD-L1);通过PEI法转染质粒,调节质粒转染量(1μg、3μg、5μg)和转染时间(24 h、36 h、48 h、72 h),优化转染条件;通过细胞划痕实验检测细胞融合率,Western Blot检测细胞迁移相关蛋白(E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白)的表达量。[结果]最佳转染条件是质粒量3μg/孔,转染后48 h观察,此时转染效率可达(82.94±8.08)%。转染pEGFP-PD-L1质粒后,HeLa细胞的PD-L1过表达3.5倍,划痕融合率显著增高(p<0.01);波形蛋白和N-钙黏蛋白的表达量显著升高(p<0.05),E-钙黏蛋白表达量显著下降(p<0.05)。[结论]PD-L1过表达显著促进HeLa细胞迁移能力和上皮向间质转化水平。     

PARP-1沉默对1,4-苯醌致骨髓间充质干细胞微核形成的影响

为探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)对1,4-苯醌(1,4-benzoquinone,PBQ)诱导骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)微核形成的影响。我们以空载体BMSCs为对照组,以PARP-1沉默BMSCs为处理组,免疫印迹法检测PARP-1蛋白表达量。磷酸盐缓冲液(PBS)溶解PBQ,分别以0μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L、40.0μmol/L、80.0μmol/L、160.0μmol/L和320.0μmol/L PBQ染毒两组细胞,应用MTT法检测细胞活力。根据细胞活力检测结果选择合适染毒浓度后进行微核试验,实时荧光定量-聚合酶链反应检测PARP-1基因表达。结果显示,沉默细胞PARP-1的蛋白表达量较对照组的细胞((1.00±0.03)倍)下降了85%(p0.05)。染毒24 h后,相同剂量下两组细胞的活力并无显著性差异。随着PBQ染毒剂量增加,两组细胞PARP-1表达水平、微核率和核异常率均明显增高(p0.05),且相同剂量下PARP-1沉默组细胞比对照组细胞微核率及核异常率明显增高(p0.05)。结果表明,PARP-1沉默BMSCs在PBQ作用下更易发生DNA损伤,且PARP-1沉默不利于DNA损伤的修复。     

基于生物信息学分析肾透明细胞癌组织中差异过表达miRNAs及其临床意义

[目的]基于生物信息学方法筛选肾透明细胞癌表达芯片中共同过表达的miRNAs,并对其下游靶基因进行GO Pathway、分子功能等预测,结合正常本底表达及患者生存分析,最终发现可作为肾透明细胞癌生物标记物的新miRNA。[方法]利用db DEMC 2. 0人类癌症相关miRNA数据库、mir Path v. 3、Human miRNA tissue atlas、PROGmiRV2等多种生物信息学手段进行肾透明细胞癌中miRNAs的全方位分析。[结果]db DEMC 2. 0数据分析表明相对于正常组织,肾透明细胞癌组织中,分别存在上调miRNA 33个(GSE11016)、48个(GSE12105)和48个(GSE47582)。Venny分析得到13个共同上调miRNAs簇,该microRNAs簇仅在肾透明细胞癌、乳腺癌等部分癌种中高表达。mir Path v. 3 GO分析进一步显示,下游靶基因可能与脂肪酸代谢、细胞周期、TGF-β信号通路、Hippo信号通路等密切相关。Human miRNA tissue atlas揭示miR-21-5p、miR-342-3p、miR15a-5p、m...     

Hsa_circ_0087354通过hsa-miR-199-3p/SLC7A11调节MG-63细胞增殖及氧化还原状态

环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类新型非编码RNA。已有研究表明,其在细胞氧化还原反应中发挥重要作用。在本文前期研究中,发现通过real-time PCR检测,hsa_circ_0087354与细胞的氧化还原状态密切相关。过表达hsa_circ_0087354后,活性氧1(reactive oxygen species1,ROS1)基因表达显著下降(P＜0.01),超氧化物歧化酶1(surperoxide dismutase1,SOD1)表达显著升高(P＜0.05);细胞内SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)活性以及谷胱甘肽(glutathione,GSH)浓度显著升高(P＜0.01),细胞增殖能力增强(P＜0.05)。生物信息学分析预测,hsa-miR-199-3p与hsa_circ_0087354和溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)存在结合位点,可能存在靶向调控关系。双荧光素酶报告基因结果证实了hsa-miR-199-3p与hsa_circ_0087354和SLC7A11之间的靶向调控关系。构建过表达hsa_circ_0087354质粒和ctrl质粒,合成hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199b-3p 和hsa-miR-NC mimics。通过Real-time PCR分析发现,转染hsa_circ_0087354后,hsa-miR-199-3p表达显著降低(P＜0.01),SLC7A11表达显著升高(P＜0.05)。转染hsa-miR-199-3p后,SLC7A11基因表达显著下降(P＜0.001),细胞内SOD和GPx活性以及GSH浓度显著降低(P＜0.01),细胞增殖能力下降(P＜0.05)。研究结果表明,hsa_circ_0087354通过吸附hsa-miR-199-3p,增强SLC7A11表达,促进氧化应激MG-63细胞增殖,降低氧化应激水平。     

沉默MDR1基因表达逆转肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性

本研究以A549/DDP细胞为实验对象,利用shRNA(short hairpin RNA)沉默MDR1基因,逆转人肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。构建3种靶向MDR1基因重组干扰载体,稳定转染A549/DDP细胞,qRT-PCR检测MDR1 mRNA表达水平,Western blotting检测MDR1蛋白表达水平,MTT法检测细胞对顺铂的敏感性。结果显示成功构建了3种靶向MDR1的重组表达载体p2.1-1、p2.1-2和p2.1-3。3种干扰表达载体均能有效沉默A549/DDP细胞MDR1基因表达,其中p2.1-3对MDR1沉默效果最好,对mRNA和蛋白的沉默效率分别为51.47%和53.24%。转染p2.1-3的细胞对顺铂的IC50由(72.08±7.00)μmol/L降至(31.89±3.39)μmol/L,逆转率达到(67.60±5.70)%。这些结果表明靶向MDR1的重组干扰载体均能够有效抑制MDR1表达,其中p2.1-3干扰效果最佳并且能逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。     

miRNA-338-3p通过靶向抑制MC1R基因表达抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成

黑色素皮质素1受体MC1R）是在黑色素细胞内表达的G蛋白耦合受体（G protein coupled receptor, GPCR）家族成员,参与黑色素细胞中黑色素的生成。微RNAs（miRNAs）是一类非编码RNA,通过与靶基因3′-UTR结合抑制基因表达。已有研究证明,miR-338-3p 在多种人类肿瘤细胞中（过）表达,可通过下调靶基因表达抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力。然而,有关miR-338-3p对羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素合成影响却罕见报道。本研究证明,miRNA-338-3p通过靶向抑制MC1R基因表达,抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成。采用生物信息学预测MC1R基因是miRNA-338-3p的靶基因,其基因表达抑制羊驼黑色素细胞黑色素合成。随后构建miR-338-3p真核表达载体。其基因转染结合qPT-PCR和Western印迹结果揭示,与对照细胞比较,过表达miRNA-338-3p的羊驼黑色素细胞的MC1R基因,及其下游与黑色素生成相关的小眼相关性转录因子（MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）、酪氨酸酶相关蛋白2（TYRP2）编码基因mRNA及蛋白质表达水平明显下调。酶联免疫吸附分析显示,过表达miRNA-338-3p的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素产量,较对照细胞显著下降（P＜0.01）。综上结果,miR-338-3p可通过抑制靶基因MC1R表达,下调其下游基因MITF、TYR、TYRP1和TYRP2基因的表达,从而抑制羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的合成。miRNA-338-3p在羊驼生长发育过程中,是否参与调控体内皮肤黑色素细胞的黑色素生成尚待进一步研究。     

组合处理对新型斜生栅藻(Scenedesmus obliqast)积累虾青素的研究

[目的]研究20μmol/L褪黑素和0.2 mg/L水杨酸(SA)组合3.0 mg/L茉莉酸甲酯等组合处理诱导新型斜生栅藻协同促进积累虾青素的效应。[方法]在优化和改良的BG11培养基中培养,营养细胞培养阶段用一系列平行的40.0W红光灯管和1.2 m长28.0 W蓝光灯管照射藻液(总光照强度为252μmol·m~(-2)s~(-1)),连续培养至对数生长期,每天震荡摇动培养物2次,防止黏壁。对数生长期1 d后,通过1.2 m长蓝光灯管+高光强+氮饥饿+51.8 g/L葡萄糖和20.0 g/L木糖,进行生物量发酵和诱导部分虾青素,继续培养3 d(方案1),然后在广泛诱导阶段,分步提高光照强度高约555μmol·m~(-2)s~(-1)后,培养3 d(方案2),继续光照,再通过2μmol/L褪黑素组合3.0 mg/L茉莉酸甲酯加0.2 mg/L水杨酸诱导获得虾青素,继续培养5 d(方案3)。[结果]3个处理方案均能轻微促进斜生栅藻细胞密度的增加,最大生物量达到0.91×10~6个/mL强度。方案3处理组藻细胞内SA含量适度提升为1.0 mmol/L,藻体内虾青素含量为9.6%,显著高于对照组(P 0.05)。运用荧光定量PCR分析表明:经过方案3处理后,斜生栅藻新藻种(Scenedesmus obliqast)体内ipi、psy、crtR-b基因的表达量分别为对照的15.60、16.20、19.68倍,均有显著差异(P 0.05)。尤其是lyc基因的表达量为对照的31.20倍,达到差异极显著(P 0.01)。从方案1到方案3,bkt、zds和pds基因的表达量逐渐增加,但不明显(P 0.05)。[结论]方案3的组合处理能使藻细胞内积累适度提升的水杨酸信号分子,适度提升的胞内SA含量就显著促进了虾青素的增长,而且组合处理协同调控7种关键酶基因表达。因此,2μmol/L褪黑素组合0.2 mg/L水杨酸加3.0 mg/L茉莉酸甲酯等诱导是非常有效的。     

MiR-338-3p靶向调控B3GNT3抑制肺腺癌的侵袭和转移

肺腺癌是目前肺癌最常见的组织学亚型,约占肺肿瘤的一半。MicroRNAs(miRNAs)是非常短(20～24个核苷酸)的非编码RNA,miRNA的异常表达与多种人类肿瘤的进展和转移有关。本研究通过GEO数据集GSE19945查询获得肺癌中降低最显著的miRNA即miR-338-3p,并通过Kaplan-Meier Plotter(Kmplot)网站查得低表达水平的miR-338与肺腺癌病人的不良预后有关。利用qRT-PCR检测发现,miR-338-3p在肺腺癌细胞中表达降低(P0.05)。利用GV369-miR-338过表达慢病毒上调A549细胞中的miR-338,利用qRT-PCR检测过表达效率。Transwell细胞侵袭实验发现,miR-338的上调可抑制肺腺癌细胞的侵袭能力(P=0.0007)。基因预测网站分析获得miR-338-3p的靶基因-B3GNT3(β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase-3),生物信息学数据库分析发现,B3GNT3在肺腺癌组织中升高。双荧光素酶分析验证miR-338和B3GNT3可靶向结合(P0.05)。Western印迹结果证明,过表达miR-338后B3GNT3蛋白的表达下降,且差距具有统计学意义(P0.05)。Transwell实验证明,miR-338-3p可通过靶向调控B3GNT3抑制肺腺癌细胞的侵袭和转移(P0.05)。综上,miR-338-3p在肺腺癌组织和细胞中表达降低,且miR-338-3p可靶向调控B3GNT3抑制肺腺癌的侵袭和转移。     

KSR2基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及其与hcmv-miR-UL70-3p和hcmv-miR-US4-3p靶向关系验证

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)的miR-UL70-3p和miR-US4-3p是HCMV microRNA(miRNA)家族中的一员,前期经生物信息学分析发现,Ras激酶抑制剂2(Kinase Suppressor 2 of Ras,KSR2)的3'-UTR区为miR-UL70-3p和miR-US4-3p的高度可疑结合靶点.为进一步鉴定miR-UL70-3p和miR-US4-3p与KSR2基因的靶标关系,本研究通过构建GV272-KSR2-3'UTR野生和突变型载体,进行双荧光素酶(Luciferase)报告基因实验,并测定其荧光值活性的方法判定miR-UL70-3p和miR-US4-3p是否能与KSR2基因结合.先将293T细胞复苏、扩增并进行质粒转染,转染分6组,每组重复做3孔,分组分别为①KSR2-3'UTR阴性载体与miRNA无关序列载体②KSR2-3'UTR阴性载体与miRNA有效序列载体③KSR2-3'UTR野生序列载体与miRNA无关序列载体④KSR2-3'UTR野生序列载体与miRNA有效序列载体⑤KSR2-3'UTR突变序列载体与miRNA无关序列载体⑥KSR2-3'UTR突变序列载体与miRNA有效序列载体.酶切及DNA测序结果显示GV272-KSR2-3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功.Luciferase检测显示:同一Luciferase质粒转染的两个组中,将miRNA-NC组Luciferase相对表达量均一化为1,即将实验组①③⑤均一化为1后,比较实验组③和④组、⑤和⑥组、④和⑥组之间的Luciferase检测结果,显示实验组④和实验组③相比,有显著性降低(P＜0.05),实验组⑥和实验组⑤相比,实验组⑥和实验组④相比,差异具有统计学意义(P＜0.05),说明hcmv-miR-UL70-3p和hcmv-miR-US4-3p可与KSR2-3'UTR结合,抑制KSR2表达.     

神经病理性疼痛大鼠海马miRNA差异性表达研究

目的:探讨神经病理性疼痛大鼠海马差异性表达的miRNAs,并预测其在神经病理性疼痛发病机制中的作用。方法:通过建立L5神经结扎横切(L5 Spinal Nerve Transection,L5-SNT)所致神经病理性疼痛大鼠模型,在机械痛阈检测结束后处死大鼠,剥离海马组织,提取miRNA进行测序,找出L5-SNT大鼠海马差异表达的miRNAs,并对其进行靶基因预测及功能分析。结果:L5-SNT大鼠模型建立成功,手术侧足底机械痛阈明显低于正常组和假手术组大鼠(P0.05)。miRNA测序结果显示:L5-SNT组的大鼠海马miRNAs发生明显的差异性表达,其中显著下调的为:rno-miR-30c-2-3p、rno-miR-370-3p、rno-miR-541-3p、rno-miR-22-3p(P0.05);显著上调miRNAs为:rno-miR-32-5p(P0.05);对上述差异性表达明显的miRNAs进行靶基因预测及功能分析,推测与海马神经病理性疼痛有关的靶基因有:Mapk14、Camk2b、Ntrk2、Cxcl12。结论:L5-SNT大鼠海马的差异性miRNAs及其靶基因功能可能主要与海马MAPK信号通路、长时程增强、炎症反应及细胞周期有关。     

IQGAP1高表达抑制食管鳞癌细胞对顺铂化疗的敏感性

本文旨在研究含IQ模序的GTP酶激活蛋白1(IQ motif containing GTPase-activating protein 1,IQGAP1)过表达或基因干扰是否影响食管鳞癌细胞对顺铂化疗的敏感性。质粒转染构建IQGAP1高表达和基因干扰的稳定细胞系,并采用Western blot进行鉴定。然后,采用不同浓度(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)的顺铂处理细胞,通过3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝[3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]法检测IQGAP1高表达、IQGAP1基因干扰和相应对照细胞的活力,通过4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-Diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色和流式细胞技术检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果显示,IQGAP1高表达和基因干扰的稳定细胞系成功建立。在不同浓度的顺铂处理后,MTT结果表明,IQGAP1...     

弱精子症精子中miRNAs特异表达及潜在致病靶点的分析

摘要 目的：弱精子症可见于40%的不育男性,其特征是精子活力低下。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）在精子发生中发挥重要作用,但关于精子中miRNAs在弱精子症中的作用知之甚少。本研究试图初探miRNAs在弱精子症的分子机制。方法：收集了重度弱精子症患者和健康男性的精子样本,采用高通量序列技术来识别差异表达的miRNAs,并对差异显著的miRNAs进行生物信息学分析。通过qRT-PCR 证实了2个特异性改变的 miRNA及其靶基因表达情况。结果：重度弱精子症患者与正常男性相比,共有146 个miRNAs（P＜0.05; |log2 Fold Change|＞1）发生改变,其中表达上调的52个,下调的94个;预测上下调幅度最显著的前10个miRNAs 的靶基因,同时在miRDB和TargetScan 数据库存在的靶基因共有1407个。富集分析结果显示,miRNAs的靶基因富集于精子细胞的生物过程,还参与精子细胞的氧化代谢、刺激反应、增殖和分化以及凋亡等生物过程。通路分析显示,靶基因可能参与细胞自噬、细胞衰老、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、mTOR信号通路等。其中,在弱精子症精子中特异性上调的hsa-miR-371a-5p和hsa-miR-2355-5p,预测靶基因分别为自噬效应蛋白Beclin1和线粒体内膜蛋白抑素2（prohibitin2,PHB2）,二者直接参与线粒体自噬过程。qRT-PCR结果显示随着精子活力的降低,精子中hsa-miR-371a-5p和hsa-miR-2355-5p的表达量升高。结论：本研究发现弱精子症患者精子中特异性失调的miRNAs及其靶基因,为后续深入研究低活力精子中miRNAs参与调控线粒体自噬功能的机制提供新思路和理论依据。     

利用TCGA数据库构建肾透明细胞癌相关miRNA预后模型

利用TCGA数据库中肾透明细胞癌的miRNA与mRNA数据及临床信息,构建由miRNA组成的预后风险评分模型,并筛选与生存预后相关的miRNA-mRNA调控关系对,为研究提供理论依据。下载并整理TCGA[JP+1]数据库中肾透明细胞癌的miRNA与mRNA数据;对数据进行差异分析,将差异表达的miRNA与临床信息进行合并,利用单因素与多因素Cox回归分析,构建预后模型并进行模型评价;对模型中的miRNA进行靶基因预测,结果与差异表达的mRNA进行取交集,构建miRNA-mRNA调控网络;对网络中的mRNA进行生存分析,筛选生存相关的miRNA-mRNA调控关系对。共得到49个差异表达的miRNA与3 613个差异表达的mRNA;预后模型计算公式为:风险值(risk score)=hsa-miR-21-5p表达量×0.603＋hsa-miR-1251-5p表达量×-0.093;调控网络中共纳入31个miRNA-mRNA调控关系对;对mRNA进行生存分析,共得到7个有价值的关系对。所构建预后模型可有效预测肾透明细胞癌患者生存预后情况,筛选到的miRNA-mRNA调控关系对可为相关研究与治疗提供参考。     

过氧化氢对内皮祖细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的:比较不同浓度过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)对人外周血来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)生存能力的改变及其对凋亡相关蛋白表达的影响。方法:采用密度梯度离心法和差速贴壁法从人外周静脉血中分离培养内皮祖细胞。选取传代后第3代EPCs作为研究对象,以终浓度分别为50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、300μmol/L和400μmol/L的过氧化氢处理内皮祖细胞12 h,同时设立正常处理对照组。CCK-8法检测各组内皮祖细胞生存能力的差异;Western blot分析各组内皮祖细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和p53的蛋白表达情况。结果:与对照组相比,在浓度为50μmol/L、100μmol/L和150μmol/L过氧化氢处理组中细胞存活能力逐渐增强,促凋亡蛋白Bax、p53随之下调,抗凋亡蛋白Bcl-2则显著上调;在浓度为200μmol/L、300μmol/L和400μmol/L过氧化氢处理组中细胞生存能力相对于正常对照组逐渐减弱,促凋亡蛋白Bax、p53表达水平逐渐增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降。结论:过氧化氢对内皮祖细胞存活能力和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、p53表达的影响均呈双相性变化。