特异性肝癌细胞结合单链抗体的筛选及克隆表达

用人肝癌细胞系SMMC7721免疫小鼠,提取脾细胞总RNA,构建单链抗体库,从中筛选到1个与人肝癌细胞系HepG2特异性结合的噬菌体－单链抗体。此单链抗体与HepG2细胞结合滴度比正常肝细胞低100倍以上。构建表达质粒pTrx-scFv5-56,单链抗体scFv5-56在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地进行了可溶性表达。     

前列腺癌细胞结合单链抗体的克隆表达及其功能初步研究

目的:在获得纯化的前列腺癌细胞结合单链抗体scFvP-9后,对其生物学功能进行初步探讨,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础。方法:利用MTT比色实验初步研究了scFvP-9对多种肿瘤细胞及正常肝细胞HL02的生物学作用,并建立人宫颈癌的裸鼠模型,进行了抑瘤实验。结果:scFvP-9不影响HL02细胞及恶性程度低的人前列腺癌细胞LNCaP的生长,但对人前列腺癌细胞PC3、人宫颈癌细胞HeLa、人肺癌细胞PLA801D均有生长抑制作用;scFvP-9在荷瘤模型体内也显示了较好的抑瘤效果,与对照组相比有显著性差别,且瘤周皮下给药组效果更为显著。结论:该抗体具有潜在的重要临床应用价值。     

肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的克隆与表达

为探讨肝癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因的表达策略并比较二者的结合能力,在3种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究;对复性后的单链抗体以抗原捕获ELISA法进行检测。结果表明,在3种载体中表达的鼠源及人源化单链抗体都是包含体,诱导物浓度及培养温度不影响表达形式;抗原捕获细胞ELISA表明人源化的单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是:在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDRs的天然构象,表达的人源化单链抗体提供了免疫原性评价及临床应用的基础。     

抗人CD28单链抗体基因的构建及在BmN细胞和家蚕中的表达

采用TP-PCR法,将抗人CD28单链抗体的重、轻链可变区基因和人工设计的昆虫杆状病毒多角体蛋白基因(ph)偏好的连接肽序列,拼接成抗人CD28单链抗体(抗CD28-ScFv)基因,并将其插入昆虫杆状病毒转移载体pBacPAK8的ph启动子,构建成重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv。为便于表达产物的纯化,在CD28-ScFv的C端增加了6×Histag序列。通过脂质体介导法将重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv和线性化病毒Bm-BacPAK6共转染BmN细胞,经空斑分析和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv。将重组病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv感染BmN细胞和5龄家蚕,SDS-PAGE和Western Blotting分析表明,在分子量约为28kD处有一表达带。BmN细胞的表达始于24h,表达峰在72h,96h时表达量开始下降,而5龄家蚕的表达始于48h,表达峰在120h。结果证明,抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞和家蚕中得到了特异性表达。上述研究成果为抗人CD28基因工程抗体的研制奠定了基础。     

抗汉坦病毒核蛋白单链抗体的构建与表达

汉坦病毒核蛋白在病毒各个基因组片段核糖核蛋白(RNP)复合物的形成,以及RNP复合物装配入病毒颗粒中发挥重要作用。体外研究表明,核蛋白与病毒RNA的特异性结合结构域位于第175—217个氨基酸残基,羧基端其它部分为非特异性结合结构域。为了在细胞内病毒复制的正常过程中研究核蛋白的功能,应用噬菌体表面呈现技术,分别从鼠杂交瘤细胞和人外周血淋巴细胞天然抗体库中,筛选出两株不同抗原结合位点的抗汉坦病毒核蛋白抗体L13 F3和H34Fab抗体,并在大肠杆菌中进行表达。L13 F3 Fab抗体的抗原结合位点位于核蛋白氨基端25—65个氨基酸之间,H34的抗原结合位点位于核蛋白的羧基端的一半。分别使重链可变区羧基端与轻链可变区氨基端通过9个氨基酸寡肽连接起来,构建成单链抗体,并在大肠杆菌内进行表达。通过酶联免疫吸附试验(EL-SIA)、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot检测,确定所构建单链抗体与母抗体的抗原结合特性无差别。单链抗体分子量小,易于操作并保留了全部的抗原结合活性,是在细胞内探索汉坦病毒核蛋白功能的良好工具。     

抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达

采用噬菌体表达展示技术,以从乙型肝炎病毒（HBV）表达抗原（HBsAg）阳性血汪有超速离心纯化的HBsAg为固相抗原,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体（ScFv）克隆并提取质粒,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌XL1－Blue。经IPTG诱导后,表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以50％硫酸胺沉淀,经SDS－PAGE电泳表明,XL1－Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约28kD。免疫活性检测结果表明,该单链抗体具有较强的抗原结合性和特异性。HBsAg人源单链抗体的筛选和表达成功,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达

以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b( )载体,转化入E.coli BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。     

抗人CD3单链抗体与改形单域抗体的表达

设计并化学合成含有适当酶切位点及连接肽的寡核苷酸序列,与一定的背景载体连接并改造成适用于单链抗体表达的载体:外分泌型pWAI80和融合蛋白型pROH80从分泌抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞UCHT1中,经PCR扩增出轻、重链可变区基因V_H和V_K,并插入上述表达载体中构建成单链抗体基因.通过对鼠OKT3结合位点的结构模拟,并比较人、鼠抗体家族性保守序列,设计出改形OKT3的基因序列.化学法部分合成8个寡核苷酸片段,应用重叠PCR技术扩增出完整改形重链基因V_H,并克隆、酶切和测序鉴定.将所克隆V_H基因插入表达载体pCOMB3和 pGEX-4T-1中进行表达.经 IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和 Western blot分析以及 ELISA检测,结果发现分泌型表达产物及 M13基因Ⅲ-V_H改形单域抗体融合蛋白具有与CD3单抗竞争抑制的活性;而融合型单链抗体及改形单域抗体表达产物主要以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的 30％左右.     

抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达

采用噬菌体表面展示技术,以从乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体(ScFv)克隆并提取质粒,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌XL1-Blue。经IPTG诱导后,表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以50%硫酸胺沉淀,经SDS-PAGE电泳表明,XL1-Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约28?kD。免疫活性检测结果表明,该单链抗体具有较强的抗原结合活性和特异性。HBsAg人源单链抗体的筛选和表达成功,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

抗肉毒毒素A人源单链抗体在酵母细胞中的分泌表达

将特异肉毒抗毒素基因克隆入载体pPIC9k,G418抗性加压筛选阳性整合克隆,在毕赤酵母细胞GS115中进行分泌表达。获得了稳定分泌表达ScFv的工程菌,SDS—PAGE分析可见,目的蛋白分子量约为26kD,通过放大体积来探索重组抗毒素的诱导表达条件及纯化工艺,结果发现,1％甲醇诱导后72～84h,目的蛋白的表达达到高峰,占酵母培养上清中总蛋白的15％以上,经两步层析纯化,目的蛋白纯度可达95％。竞争活性测定结果表明,重组抗毒素在体外具有良好的活性,可竞争肉毒抗毒素马血清与毒素的特异结合。     

抗EGFRvIII噬菌体抗体库的构建和筛选

目的：应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш (epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ, EGFRvIII)的单链抗体 (single chain Fv, scFv)。方法：利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv 基因,连接至噬菌粒pCANTAB 5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coli HB2151,IPTG 诱导可溶性scFv 的表达。结果：构建了库容为7.9×107 的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv 基因序列长807 bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv 可分别与纯化的EGFRvIIIex抗原以及细胞表面的EGFRvIIIex结合。结论：利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvIII scFv,为开发针对EGFRvIII的抗体药物提供了靶向载体分子。     

用抗细胞表面分子单链抗体筛选和鉴别其相互作用肽

展示于噬茵体表面的肽库适于用抗体筛选其特异性结合表达肽。scFv-C193是一个抗KGla细胞表面分子的单链抗体,其抗原仍不清楚,为了筛选并鉴定其识别分子,用8cFv-C193筛选了1个展示于T7噬茵体表面的人胎肝cDNA片段库。经4轮生物吸附后分离单个阳性噬斑,并对其表达产物做电泳分析及斑点杂交。结果鉴别出1个scFv-C193结合肽,scFv-C193+克隆噬菌体DNA插入片段的PCR扩增和序列分析结果表明它是1个43bpDNA片段表达产物。BLAST分析EST人类基因数据库,发现它97％相同于CD34₊造血干/祖细胞mRNA的1-43bp,提示scFv-C193识别片段存在于人类造血干／祖细胞基因中,单克隆单链抗体scFv-C193可能用于研究这些人类基因的性质。     

原核表达载体pOPE101-8E5的改构及单链抗体的表达鉴定

本研究利用基因重组技术将链亲和素(core-streptavidin)cDNA插入原核表达载体pOPE101-8E5的3′端,并用单链抗体scFv-C4的重链和轻链可变区cDNA取代其scFv-8E5,构建重组表达载体pOPE101-C4::core-streptavidin。将该表达载体转化入在大肠杆菌中进行诱导表达,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析表达产物的表达量和产物活性。结果提示我们成功地获得一个分子量约为45kDa的scFv-C4::core-streptavidin的融合蛋白,它可结合KG1a细胞裂解物中分子量约为60kDa、45kDa的蛋白带,且其结合功能可以通过融合蛋白中的链亲和素基因直接测定。     

妊娠期糖尿病小鼠胎盘EGFR的表达与其发病关系的研究

目的:研究妊娠期糖尿病小鼠胎盘表皮生长因子受体(EGFR)的表达,探讨EGFR表达与妊娠期糖尿病发病的关系。方法:采用链脲佐菌素建立妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)小鼠模型,对照组为正常妊娠小鼠,腹腔注射等量缓冲溶液。测定母鼠体重、血糖;计算胎鼠的存活率;测定胎鼠、胎盘重量,计算胎盘效率;RT-PCR、免疫组化分别测定GDM组和对照组胎盘EGFR m RNA和EGFR蛋白的表达。Pearson相关性分析用于母鼠血糖与EGFR表达的相关性分析。结果:GDM组母鼠体重和血糖均高于对照组(P0.01);GDM组胎鼠、胎盘重量及胎盘效率均高于对照组(P0.01);RT-PCR和免疫组化结果显示GDM组胎盘EGFR m RNA和EGFR蛋白的表达与对照组相比差异有统计学意义(P0.01)。GDM组小鼠血糖值与其胎盘EGFR的表达具有相关性(r=0.582,P0.05)。结论:GDM导致胎盘EGFR表达升高,EGFR并不是GDM的发病因素,EGFR是预防GDM的潜在靶点。     

抗CD5单链抗体基因克隆和表达

以分泌抗CD5单克隆抗体的杂交瘤细胞poly(A) mRNA为模板,通过RTPCR扩增出抗CD5单克隆抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL) cDNA片段组装出抗CD5单链抗体(ScFv) cDNA片段。该ScFv片段被克隆到pCANTAB 5E载体上,以E.coli TG1为宿主,进行噬菌体表面呈现。通过Molt4细胞表面分子CD抗原,对噬菌体表面呈现的ScFv进行免疫亲和富集筛选。经细胞ELISA鉴定,得到4株高亲和力克隆。DNA序列分析得知,单链抗体全长732碱基,其中VH为339碱基,VL为300碱基。抗CD5 ScFv在E.coli HB2151中以可溶形式分泌表达,产物主要分布于周质之中,占周质中总蛋白的20%。     

抗松材线虫纤维素酶单链抗体库的构建及筛选

构建鼠源性松材线虫纤维素酶（Bursaphelenchus xylophilus cellulase, BXC）的噬菌体单链抗体库,从中筛选特异性BXC的单链抗体。以BXC为抗原免疫BALB/C小鼠,从脾脏提取总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链（V_H）和轻链(V_L)可变区基因。经重叠PCR(SOE-PCR)在体外将V_H和V_L连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,成功构建了库容为5×10⁴的Anti-BXC单链抗体库,并从该抗体库中初步筛选到了特异性识别BXC的噬菌体单链抗体scFv。将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌HB2151进行可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,可溶性scFv获得表达,且与BXC具有结合活性,为松材线虫的检验检疫以及病理学研究奠定了基础。     

抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选

目的:应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш(epidermal growth factorreceptor variant typeⅢ,EGFRvIII)的单链抗体(single chain Fv,scFv)。方法:利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv基因,连接至噬菌粒pCANTAB5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达。结果:构建了库容为7.9×107的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv基因序列长807bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv可分别与纯化的EGFRvⅢex抗原以及细胞表面的EGFRvⅢex结合。结论:利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvⅢ scFv,为开发针对EGFRvⅢ...     

单域重链抗体的分子特征

源于软骨鱼或骆驼科动物的同型重链二聚体无轻链,用基因工程方法获得其单一重链可变区可保留完整的抗原结合活性,称为单域重链抗体。单域重链抗体具有分子小、稳定性高、体内组织渗透性好、可溶性好、易表达、抗原识别表位独特的结构特征,近年来在生物技术研究与诊断治疗应用领域得到广泛关注,取得了快速发展。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素全人源双价单链抗体的构建、表达及其活性的初步研究

目的:为防治A型产气荚膜梭菌α毒素引起的肠毒血症及气性坏疽等相关疾病,构建并高效表达中和α毒素(CPA)的特异性双价单链抗体,并对其生物学活性进行初步研究。方法:以全人源噬菌体抗体库中筛选得到的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体sc Fv基因为模板,PCR的方法扩增两条单链抗体片段并通过引物设计引入中间连接肽G4S或(G4S)3,亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化E.coli BL21,IPTG诱导表达、鉴定及表达产物的层析纯化;Western blot和间接ELISA方法检测与抗原的免疫结合活性;通过体外检测抗体抑制CPA水解卵磷脂的活性和溶血活性以及体内小鼠攻毒保护试验初步研究双价单链抗体的生物学活性。结果:双酶切鉴定及基因测序结果表明构建的双价单链抗体sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均正确,诱导表达后经12%SDS-PAGE分析,两者均以包涵体形式表达且蛋白分子量符合理论值大小,Western blot和间接ELISA分析结果显示,构建的双价单链抗体与抗原CPA具有特异结合活性,且sc(Fv)2-15与抗原的结合活性明显高于sc(Fv)2-5和sc Fv,体外与体内生物活性试验结果进一步证明,sc(Fv)2-15中和毒素的能力较sc(Fv)2-5和sc Fv具有明显优势。结论:成功制备了抗A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源双价单链抗体,为进一步研究该毒素引发的各类疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

抗CEA单链抗体与链亲和素融合基因的表达

克隆分泌CEA杂交瘤细胞重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）,以Linker连接V_H及V_L构建抗CEA单链抗体.同时以Spacer连接单链抗体和链亲和素,构建成功单链抗体和链亲和素融合基因,克隆该融合基因至原核表达载体,pET21a(+),经IPTG诱导表达出该双特异性融合蛋白.活性鉴定表明该融合蛋白具有结合CEA及生物素的双特异性.该融合蛋白在生物领域中有较广阔的应用前景.