白藜芦醇甙减轻高糖所致心肌微血管内皮细胞损伤的作用及机制研究

目的:探讨白藜芦醇甙在高糖处理的大鼠心肌微血管内皮细胞损伤中的作用及其可能调控机制。方法:酶消法分离大鼠CMECs,高糖处理CMECs建立细胞损伤模型,实验随机分为6个组:对照组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)、白藜芦醇甙组、高糖组(葡萄糖浓度为33 mmol/L)、高糖+白藜芦醇甙组、高糖+白藜芦醇甙+3-MA(自噬抑制剂)组和高糖+雷帕霉素(自噬诱导剂)组。白藜芦醇甙组和高糖+白藜芦醇甙组分别加入10μmol/L的白藜芦醇甙孵育24 h,高糖+白藜芦醇甙+3-MA组加入10μmol/L的白藜芦醇甙和10μmmol/L 3-MA孵育24 h,高糖+雷帕霉素组加入100 nmol/L的雷帕霉素孵育24小时。CCK-8实验检测大鼠CMECs增殖;Tunel法检测大鼠CMECs凋亡;FITC-葡聚糖清除实验检测单层CMECs通透性;Western blot检测LC3Ⅱ和p62的表达。结果:与对照组和白藜芦醇甙组相比,高糖组CMECs增殖能力降低(P<0.05),凋亡率显著增加(P<0.05),细胞通透性增加(P<0.05),LC3Ⅱ表达降低(P<0.05),p62的表达增加(P<0.05);与高糖组相比,高糖+白藜芦醇甙组和高糖+雷帕霉素组CMECs增殖能力增加(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.05),细胞通透性降低(P<0.05),LC3Ⅱ表达增加(P<0.05),p62的表达降低(P<0.05);与高糖+白藜芦醇甙组相比,高糖+白藜芦醇甙+3-MA组CMECs增殖能力降低(P<0.05),凋亡率显著增加(P<0.05),细胞通透性增加(P<0.05),LC3Ⅱ表达降低(P<0.05),p62的表达增加(P<0.05)。结论:白藜芦醇甙通过增加自噬减轻高糖处理的大鼠心肌微血管内皮细胞损伤。     

木犀草素是具有PPARγ激动剂活性的新型AMPK激活剂

目的:木犀草素是一种天然黄酮类化合物,早期报导其能激活PPARγ,本实验室发现其也能激活AMPK。因此本研究验证木犀草素在脂肪细胞中能否激活PPARγ和AMPK,并探究这两种活性对脂肪前体细胞分化及脂联素高聚化的影响。方法:使用LanthaScreen TR-FRET PPARγ竞争性结合检测试剂盒检测木犀草素与PPARγ的结合能力,并用PPRE转录激活报告基因体系验证木犀草素是否激活PPARγ转录活性,利用油红O染色法检测木犀草素对3T3-L1脂肪前体细胞分化的影响,采用RNA干扰沉默成熟脂肪细胞中AMPKα1,用Western Blot检测相关蛋白水平。结果:木犀草素能直接结合PPARγ,其IC50为1880 nmoL·L-1,并显示剂量依赖的PPARγ转录激活活性,抑制PPARγSer-273位点磷酸化。木犀草素能升高pAMPK(Thr-172)水平,抑制脂肪前体细胞分化,升高脂联素高聚化水平。结论:木犀草素通过激活AMPK和PPARγ调控脂肪前体细胞分化和脂联素高聚化,是一种具有PPARγ激动剂活性的新AMPK激活剂,有望成为治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖等代谢紊乱疾病的潜在药物。     

AMPK激活通过调控氧化应激修复高糖诱导的人脑微血管内皮细胞损伤

目的探究高糖条件下,腺苷酸活化蛋白激酶(adenine monophosphate activated protein kinase, AMPK)调控的氧化应激对血脑屏障通透性的影响。方法采用人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMEC)作为体外血脑屏障细胞模型,采取如下两种方式处理:①不同浓度(5.5mmol/L或27.5mmol/L)葡萄糖处理HBMEC 24h;②AMPK激动剂氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(4-amino-1H-imida-zole-5-carboxamide, AICAR)预处理2h后,再给予27.5mmol/L葡萄糖处理24h。Western blot及免疫荧光染色检测细胞间血脑屏障相关的闭锁连接蛋白(zonula occludens protein 1, ZO-1)水平,活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平,透射电镜观察细胞内线粒体超微结构改变。结果高糖处理后HBMEC细胞ZO-1水平显著降低,ROS水平升高,线粒体结构损伤;...     

木犀草素通过抑制p65 NF-κB、促进p85 PI3K调节微血管内皮细胞VCAM-1表达

通过抑制微血管内皮细胞血管细胞黏附分子(VCAM)-1的表达,木犀草素可阻遏中性粒细胞与微血管内皮细胞的黏附,起到抗炎作用。木犀草素调节VCAM-1表达与三条信号通路有关：丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子kappa B (NF-κB)/IκB和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路。其中,MAPK和NF-κB/IκB通路参与VCAM-1正向调节,PI3K/Akt通路参与VCAM-1负向调节。本文研究了木犀草素对微血管内皮细胞该三条通路中的关键蛋白p38 MAPK、p65 NF-κB、p85 PI3K磷酸化。结果表明：木犀草素在反应的30s和1min促进p38 MAPK磷酸化,在30 s、1 min和5 min促进p85 PI3K磷酸化,而在30 s、1 min、5 min和30 min抑制p65 NF-κB磷酸化。阻抑p38 MAPK通路导致VCAM-1表达下调,而p38 MAPK抑制剂SB203580可通过抑制p38 MAPK磷酸化也下调VCAM-1,提示木犀草素对微血管内皮细胞VCAM-1的调节作用独立于p38 MAPK磷酸化。由此可知,木犀草素通过抑制p65 NF-κB磷酸化或促进p85 PI3K磷酸化调节微血管内皮细胞VCAM-1表达。本文为木犀草素抗炎作用的分子机制研究提供了新的线索。     

木犀草素通过抑制p65 NF-κB、促进p85 PI3K调节微血管内皮细胞VCAM-1表达（英文）

通过抑制微血管内皮细胞血管细胞黏附分子(VCAM)-1的表达,木犀草素可阻遏中性粒细胞与微血管内皮细胞的黏附,起到抗炎作用.木犀草素调节VCAM-1表达与三条信号通路有关:丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子kappa B(NF-κB)/IκB和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路.其中,MAPK和NF-κB/IκB通路参与VCAM-1正向调节,PI3K/Akt通路参与VCAM-1负向调节.本文研究了木犀草素对微血管内皮细胞该三条通路中的关键蛋白p38 MAPK、p65 NF-κB、p85 PI3K磷酸化.结果表明:木犀草素在反应的30 s和1 min促进p38 MAPK磷酸化,在30 s、1 min和5 min促进p85 PI3K磷酸化,而在30 s、1 min、5 min和30 min抑制p65 NF-κB磷酸化.阻抑p38 MAPK通路导致VCAM-1表达下调,而p38 MAPK抑制剂SB203580可通过抑制p38 MAPK磷酸化也下调VCAM-1,提示木犀草素对微血管内皮细胞VCAM-1的调节作用独立于p38 MAPK磷酸化.由此可知,木犀草素通过抑制p65 NF-κB...     

高糖诱导血管内皮细胞凋亡机制的研究

目的:探讨高糖诱导血管内皮细胞凋亡的分子机制。方法:在高浓度葡萄糖的培养基中培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelium cells,HUVECs),模拟高糖血症条件下内皮细胞的病理状态。通过MTT检测HUVEC细胞生存情况;JC-1检测HUVEC细胞线粒体膜电位;逆转录-聚合酶链反应和荧光素酶报告基因检测己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ,HKⅡ)的转录;免疫印迹和免疫共沉淀检测VDAC1、HKⅡ、Bcl-2、Bax线粒体上蛋白表达水平和它们之间的相互作用。结果:25 m M和100m M葡萄糖诱导HUVEC细胞生存率分别下降了19.21%±4.13%和25.29%±5.78%;线粒体膜电位分别降低了34.19%±5.13%和58.63%±4.78%;HKⅡ蛋白表达水平分别降低了13.97%±6.32%和35.13%±5.18%;使得HKⅡ同VDAC1互作减弱,代偿性增强了VDAC1同Bax互作。结论:高糖下调HUVEC细胞HKⅡ表达水平,增强线粒体膜通透性,最终诱导了细胞凋亡。     

木犀草素对子痫前期大鼠滋养层细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨木犀草素（LUT）对子痫前期（PE）大鼠滋养层细胞凋亡的影响及其机制。 方法取妊娠10 d SD大鼠,按随机数字表法随机分为对照组、模型组、20、40、60 mmol/L LUT （LUT-L、LUT-M、LUT-H）组,每组各12只,模型组和给药组大鼠皮下注射100 mg/（kg·d）亚硝基左旋精氨酸甲酯建立PE大鼠模型,对照组大鼠皮下注射等量生理盐水,每天1次,注射6 d。妊娠16 d的大鼠分别予以20、40、60 mmol/L LUT腹腔注射,对照组、模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水,每天1次,注射5 d。测量各组大鼠妊娠10、16、21 d尾动脉血压及24 h尿蛋白水平;妊娠21 d,原位末端标记法（TUNEL）检测滋养层组织细胞凋亡情况,Western blot法检测滋养层组织B淋巴细胞瘤-2 （Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋（Bax）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化PI3K （p-PI3K）、蛋白激酶B （Akt）、磷酸化AKT （p-Akt）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和磷酸化eNOS （p-eNOS）蛋白表达量。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。 结果妊娠10 d,各组大鼠尾动脉收缩压、舒张压、24 h尿蛋白含量差异无统计学意义;妊娠16 d,与对照组比较,模型组、LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组大鼠尾动脉收缩压、舒张压、24 h尿蛋白含量升高（P均< 0.05）;妊娠21 d,与对照组比较,模型组、LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组收缩压[（110.33±3.67）比（147.28±4.16）,（131.29±4.31）,（124.46±4.27）,（118.54±4.18）mmHg]、24 h蛋白尿、细胞凋亡率[（1.38±0.34）%,（43.45±3.72）%,（39.21±3.53）%,（27.86±3.41）%,（23.21±3.28）%]和Bax蛋白表达量均升高;Bcl-2、p-PI3K/PI3K （1.06±0.09比0.25±0.02,0.37±0.03,0.57±0.06,0.73±0.08）、p-Akt/Akt（0.87±0.08比0.11±0.01,0.23±0.03,0.56±0.07,0.78±0.06）和p-eNOS/eNOS蛋白表达水平（0.85±0.07比0.09±0.01,0.16±0.02,0.38±0.04,0.69±0.07）均降低（P均< 0.05）。与模型组比较,LUT-L组、LUT-M组、LUT-H组大鼠尾动脉收缩压、舒张压、滋养层组织细胞凋亡率和Bax蛋白表达量降低,Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS蛋白表达量升高（P均< 0.05）。 结论LUT可抑制PE大鼠滋养层组织细胞凋亡,其机制可能与PI3K/Akt/eNOS信号通路激活,调控凋亡相关蛋白表达有关。     

微粒对内皮细胞的影响及其机制

微粒是细胞活化或凋亡时释放的磷脂囊泡,直径大小为100-1000 nm,并且带有亲缘性细胞的特异性抗原标记。外周血中的细胞微粒主要来源于血小板、白细胞、红细胞和内皮细胞。由于细胞活化和凋亡机制不同,所以从不同细胞上脱落的微粒大小、磷脂和原始细胞细胞质的含量也不同。微粒有潜在的生物学作用,包括对血管内皮细胞舒张功能的作用和对内皮细胞的促进生长的作用。除此之外,微粒能通过携带部分自身成份转移到靶细胞来介导细胞的活化、细胞表型的改变和细胞功能的重组。在疾病发生过程中,外周血中微粒的数量显著增加,这提示微粒可能参与了很多疾病的发生与发展,所以微粒日益受到临床工作者的重视。本文对微粒的形成原因、微粒成分,对内皮细胞的作用及其机制进行综述。微粒作为内皮细胞相关疾病一个新的治疗靶点,阐明其与内皮细胞功能障碍发生机制之间的关系,有助于为内皮细胞病变相关性疾病的治疗提供新的途径。     

木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其机制

【目的】研究木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑制活性及其机制。【方法】利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,细胞膜渗透性测定,SDS-PAGE蛋白谱变化,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色法等对木犀草素的抑菌活性及其机制进行研究。【结果】木犀草素能影响金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性,木犀草素作用16h,菌体可溶性蛋白总量减少64.54%,DNA含量减少48.44%,RNA含量减少39.35%,木犀草素的浓度为1.6mg/mL时,拓扑异构酶I和II的活性可完全被抑制。【结论】木犀草素有明显的抑菌活性,其抑菌机制主要是通过抑制DNA拓扑异构酶的活性,进而影响菌体核酸及蛋白质的合成来实现的。     

柚皮苷和木犀草素联合应用对大鼠BMSCs诱导成骨过程中Wnt/β-cantein通路相关基因表达的影响

摘要 目的：探讨柚皮苷和木犀草素联合应用对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）诱导成骨过程中Wnt/β-cantein通路相关基因表达的影响。方法：取大鼠股骨中提取的BMSCs,分别建立A组（空白组）、B组给予柚皮苷溶液10 μmol/L,C组给予木犀草素溶液5 μmol/L;D组给予骨碎补总黄酮溶液10 mg/mL;E组给予柚皮苷-木犀草素混合溶液配伍比为10 μmol/L：5 μmol/L,并诱导其向成骨细胞分化。应用碱性磷酸酶（ALP）染色及分光光度法检测第7 d各组细胞ALP活性。应用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测第7 d各组细胞Wnt/β-cantein通路相关基因及成骨基因的表达。结果：B组、C组、D组、E组细胞562 nm波长下光密度（OD）值显著高于A组,E组细胞562 nm波长下OD值最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。B组、C组、D组、E组细胞ALP、骨钙素（OCN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）基因表达水平显著高于A组,E组ALP、OCN、RUNX2基因表达水平最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。B组、C组、D组、E组细胞β-catenin、Cyclin D1基因表达水平显著高于A组;B组、E组LEF-1基因表达水平显著高于A组;E组β-catenin、LEF-1、Cyclin D1基因表达水平最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。结论：柚皮苷和木犀草素均具有促进大鼠BMSCs增殖和诱导其成骨向分化的作用,柚皮苷和木犀草素联合应用诱导大鼠BMSCs增成骨作用最强,其主要机制与Wnt/β-cantein通路激活有关。     

AIBP基因表达下调促进心肌微血管内皮细胞血管新生

目的:探讨阻断载脂蛋白A-I结合蛋白(AIBP)的表达后对心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生的作用。方法:消化法分离SD大鼠CMECs,通过慢病毒介导的siRNA转染CMECs下调AIBP基因表达,并设立空白对照组及阴性转染组。RT-PCR法检测AIBP基因的表达;CCK-8比色法检测细胞增殖;Transwell小室评价细胞迁移能力;成管实验评价血管新生能力。结果:RT-PCR结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs中AIBP表达显著降低(P0.01);CCK-8结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs增值水平显著增高(P0.01);Transwell法结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs迁移能力显著增高(P0.01);成管实验显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs成管能力显著增高(P0.01)。结论:抑制AIBP表达可以明显促进CMECs增殖,促进其迁移和成管。     

Regulation of n-3 and n-6 Fatty Acid Metabolism in Retinal and Cerebral Microvascular Endothelial Cells by High Glucose

Abstract: The present study was undertaken to determine whether polyunsaturated fatty acid metabolism is affected by high glucose levels in cerebral and retinal microvascular endothelial cells. The metabolism of [3-¹⁴C]22:5n-3 and [1-¹⁴C]18:2n-6 was studied in cells previously cultured for 5 days in normal (5 m M ) or high (30 m M ) glucose medium. After incubation of retinal endothelial cells with [3-¹⁴C]22:5n-3 in the high glucose condition, the formation of labeled 24:6n-3 and 22:6n-3 was increased, and that of labeled 24:5n-3 was decreased, compared with the normal glucose condition. The changes were found for fatty acids esterified in cellular lipids and those released into the medium. After incubation with [1-¹⁴C]18:2n-6, levels of all elongation/desaturation products were increased at the expense of the precursor in retinal endothelial cells cultured in high glucose medium. The changes were primarily found for esterified fatty acids, with the release of n-6 fatty acids being minor in both glucose concentrations. By contrast, high glucose levels did not affect the metabolism of [3-¹⁴C]22:5n-3 and [1-¹⁴C]18:2n-6 in cerebral endothelial cells. The changes in metabolic activity of retinal endothelial cells were not reflected in the fatty acid composition. The present data suggest that high glucose can increase the desaturation process in retinal but not cerebral endothelial cells. This may produce some lipid abnormalities in retinal microvasculature and contribute to altered vascular function observed in diabetic retinopathy.     

Trx通过Sirt3-P53通路促进自噬并改善高糖诱发的CMECs损伤

目的:明确硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)通过自噬调节对大鼠心脏微血管内皮细胞损伤的保护作用及相关机制。方法:分离成年大鼠心脏微血管内皮细胞并分为:(1)正常对照组;(2)高糖组;(3)高糖+Trx组;(4)高糖+Trx+Ad-sh Sirt3组;(5)高糖+Trx+Ad-sh P53组;(6)高糖+DMSO空载组。通过In Vitro Vascular Permeability Assay Kit检测单层心脏微血管内皮细胞通透性,TUNEL染色检测细胞凋亡,Western blot法检测Sirt3、P53、Atg5、LC3BI/II等相关自噬相关信号通路关键蛋白的表达水平。结果:与正常对照组相比,高糖引起单层心脏微血管内皮细胞通透功能损伤,增加细胞凋亡,抑制自噬,且Sirt3、Atg5、LC3BI/II表达下降而P53表达上升;给予Trx可以上调Sirt3、Atg5、LC3BI/II蛋白表达水平,抑制P53表达,并显著减轻上述高糖引起的细胞损伤;但是,分别干扰Sirt3和P53表达后,Trx的作用明显减弱。结论:Trx通过Sirt3-P53信号通路促进心脏微血管内皮细胞自噬,降低细胞凋亡,改善高糖诱发的大鼠心脏微血管内皮细胞损伤。     

基于PI3K/AKT通路探究上调miR-210对牙髓干细胞增殖、凋亡能力的影响

摘要 目的：研究基于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路探究上调微小RNA 210(miR-210)对大鼠牙髓干细胞增殖、凋亡能力的影响。方法：选取10只健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠,颈椎脱臼处死后提取大鼠下切牙牙髓,进行牙髓干细胞培养和鉴定。分为正常组（未进行处理）,miR-210抑制组（给予20 nmol/L的miR-210抑制物）,miR-210对照组（给予20 nmol/L的miR-210模拟物）三组。采用CCK-8法检测牙髓干细胞增殖活性,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测ALP活性,流式细胞仪检测细胞凋亡,采用免疫印迹（Western blot）检测PI3K、AKT蛋白。结果：与正常组相比,miR-210抑制组细胞增殖、ALP活性降低,细胞凋亡率升高;miR-210对照组细胞增殖、ALP活性升高,细胞凋亡率降低（P＜0.05）。与miR-210抑制组相比,miR-210对照组细胞增殖、ALP活性升高,细胞凋亡率降低（P＜0.05）。与正常组相比,miR-210抑制组PI3K、p-AKT蛋白表达降低,miR-210对照组PI3K、p-AKT蛋白表达升高（P＜0.05）。与miR-210抑制组相比,miR-210对照组PI3K、p-AKT蛋白表达升高（P＜0.05）。结论：miR-210通过调控PI3K、p-AKT蛋白激活PI3K/AKT通路,促进大鼠牙髓干细胞增殖,抑制牙髓干细胞凋亡。     

辛伐他汀对雷帕霉素作用下心肌微血管内皮细胞的影响

目的:研究辛伐他汀(SIM)对雷帕霉素(RAPA)引起的体外心肌微血管内皮细胞(CMECs)损害的保护机制。方法:分离、培养大鼠心肌微血管内皮细胞。经形态学及Dil-ac-LDL吞噬试验进行鉴定后,采用RAPA(100 nM)处理24小时建立CMECs损伤模型,然后加入不同浓度的SIM(0,10-2,10-1,100,101μM)培养24小时后,采用MTT,WST-8及Transwell检测受损后CMECs的增殖和迁移;采用Hoechst 33258及Caspase-3检查各组CMECs的凋亡;采用蛋白免疫印迹(Western blotting)检测Akt/p70 S6K磷酸化的程度;格里斯反应及实时逆转录PCR分别检测一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达。结果:①经形态学及Dil-ac-LDL吞噬试验均表明,成功培养CMECs;②低浓度SIM 100μM可显著改善100 nM RAPA对CMECs增殖、迁移和凋亡的影响;③SIM可通过上调PI3K/Akt进而上调p70s6K磷酸化(P0.05或P0.01);④SIM通过PI3K/Akt促进CMECs分泌NO及eNOS mRNA的表达(P0.05或P0.01)。结论:一定浓度下的SIM可改善RAPA作用下CMECs的增殖,迁移和凋亡,这些保护作用可能是通过其激活PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路实现的。     

达格列净对高渗诱导的血管内皮细胞衰老的干预研究

目的:探讨SGLT2i类药物达格列净(dapagliflozin)对高渗诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老的影响。方法:将HUVECs分为空白组(Blank组)、高渗330组(M-330组)、高渗350组(M-350组)、达格列净+高渗组(DAPA+M-350组),高渗培养环境由甘露醇诱导。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老情况;免疫荧光染色检测SGLT2表达变化;Western blot检测SGLT2、细胞衰老标志物p21的表达变化,JC-1染色试剂盒检测线粒体膜电位的变化。结果:免疫荧光染色和western blot结果显示,Blank组,M-330组及M-350组细胞上均存在SGLT2受体蛋白表达,且Blank组,M-330组及M-350组的SGLT2表达依次显著增加。与Blank组相比,M-350组SA-β-Gal胞质蓝染、染色阳性率、衰老蛋白p21及SGLT2表达显著增加,并伴有线粒体膜电位的显著下降(P0.05);DAPA+M-350组与M-350组相比,SA-β-Gal胞质蓝染、染色阳性率和p21表达显著下降,并伴有线粒体膜电位的显著上升(P0.05)。结论:HUVECs上存在SGLT2受体蛋白,且在300-350 m Osm/L范围内随着渗透压的升高而增加,达格列净可改善高渗所诱导的血管内皮细胞衰老,其机制可能与达格列净改善高渗导致的线粒体功能障碍有关。     

miR-20b-5p靶向MAPK1调控脑出血过程中脑微血管内皮细胞铁死亡

摘要 目的：探讨miR-20b-5p对氧糖剥夺（OGD）/Hemin处理的脑微血管内皮细胞（BMVEC）功能的影响及机制。方法：将BMVEC分为Control组、agomir-NC组、agomir-miR-20b-5p组、antagomir-NC组和antagomir-miR-20b-5p组。使用Lipofectamine 2000试剂对细胞进行相应的转染处理。BMVEC转染后,将BMVEC再分为Control组、OGD/Hemin组（O/H组）、OGD/Hemin+agomir-NC组（O/H+agomir-NC组）、OGD/Hemin+agomir-miR-20b-5p组（O/H+agomir-miR-20b-5p组）、OGD/Hemin+antagomir-NC组（O/H+antagomir-NC组）和OGD/Hemin+antagomir-miR-20b-5p组（O/H+antagomir-miR-20b-5p组）。Control组BMVEC正常培养,其他组BMVEC进行OGD/Hemin处理。MTT法检测BMVEC增殖,TUNEL染色检测BMVEC凋亡,Transwell检测BMVEC迁移。使用试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平。使用Iron Assay试剂盒检测Fe²⁺含量。通过qRT-PCR检测miR-20b-5p和MAPK1 mRNA水平。通过Western blot检测MAPK1、Bax、Bcl-2、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）蛋白表达水平。通过免疫荧光染色检测MAPK1的荧光强度水平。结果：与Control组和agomir-NC组比较,agomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平升高（P<0.05）。与Control组和antagomir-NC组比较,antagomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低（P<0.05）。与Control组比较,O/H组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低,细胞活力降低,TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,迁移数量降低,SOD和GSH-Px活性降低,MDA含量升高,Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平升高,GPX4的蛋白表达水平降低,MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度升高（P<0.05）。与O/H组和O/H+agomir-NC组比较,O/H+agomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平升高,细胞活力升高,TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高,迁移数量升高,SOD和GSH-Px活性升高,MDA含量降低,Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平降低,GPX4的蛋白表达水平升高,MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度降低（P<0.05）。与O/H组和O/H+antagomir-NC组比较,O/H+antagomir-miR-20b-5p组BMVEC中的miR-20b-5p水平降低,细胞活力降低,TUNEL阳性率和Bax蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,迁移数量降低,SOD和GSH-Px活性降低,MDA含量升高,Fe²⁺含量和PTGS2的蛋白表达水平升高,GPX4的蛋白表达水平降低,MAPK1的mRNA和蛋白表达水平以及相对荧光强度升高（P<0.05）。结论：本研究表明上调miR-20b-5p通过抑制OGD/Hemin处理的BMVEC中MAPK1的表达从而抑制了铁死亡途径。     

大鼠脑微血管内皮细胞培养及其药物转运体Oatp2和P-gp的表达

贴块法培养脑微血管内皮细胞(BMECs),倒置显微镜动态观察细胞生长及形态,Ⅷ因子相关抗原、CD34免疫细胞化学联合鉴定细胞并确定纯度。免疫细胞化学和Western印迹法检测药物转运体有机阴离子转运多肽亚型2(Oatp2)及P-糖蛋白(P-gp)在培养内皮细胞上的表达。结果显示,获得的BMECs呈多角形或铺路石形,单层贴壁生长;培养细胞Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学、CD34免疫荧光染色均为阳性,细胞纯度90%;培养细胞有Oatp2及P-gp表达,且二者均主要表达于BMECs细胞膜。提示贴块法可获得原代培养BMECs,方法简便易行,细胞纯度较高。原代培养的BMECs上有药物转运体Oatp2及P-gp的表达,为血脑屏障上药物转运体的体外研究提供了可能途径。     

葡萄糖和胰岛素对血管内皮细胞中microRNA-21的表达影响

目的:研究miRNA-21和程序性细胞死亡因子4(PDCD4)在不同浓度葡萄糖或胰岛素培养血管内皮细胞中的表达情况,探讨miRNA-21对内皮细胞凋亡功能的影响。方法:用不同浓度D-葡萄糖(5.5、11、22及33mM)和胰岛素(0、1、10、50、100及1000nM)分别干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs),2天后收集细胞用实时荧光定量RT-PCR方法检测细胞中miRNA-21及PDCD4的mRNA表达情况,用蛋白印迹方法检测PDCD4在细胞中的表达变化。结果:与5.5mM葡萄糖对照组相比,高葡萄糖浓度组(11、22及33mM)中HUVECs的miRNA-21随着葡萄糖浓度的增加表达明显降低(p<0.01);PDCD4的蛋白表达增加(p<0.05),但PDCD4的mRNA表达无差异(p>0.05)。与0nM胰岛素组相比,10、50、100、1000nM胰岛素组细胞中miRNA-21表达下降(p<0.05),PDCD4的蛋白表达增加(p<0.01),1000nM组miRNA-21表达降低程度和PDCD4的蛋白表达增加程度最为明显(p<0.05),但不同浓度胰岛素对PDCD4的mRNA表达无差异(p>0.05...