MicroRNA-221/222对乳腺癌MDA-MB-231/DOX细胞阿霉素耐药性的影响

目的:探讨微小RNA-221/222(miR-221/222)对乳腺癌MDA-MB-231/阿霉素(DOX)细胞DOX耐药性的影响。方法:采用脂质体法转染miR-221/222抑制物(miR-221/222 inhibitor)至MDA-MB-231/DOX细胞内(Inhibitor组),同时设立空白对照组和转染无关序列的阴性对照组,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测MDA-MB-231细胞株及MDA-MB-231/DOX细胞株的miR-221/222表达水平及转染效率;CCK-8法检测转染48 h后MDA-MB-231/DOX细胞对DOX药物敏感性的变化;流式细胞术(FCM)检测转染MDA-MB-231/DOX细胞的细胞凋亡率;蛋白免疫印迹实验(WB)检测转染后MDA-MB-231/DOX细胞内促凋亡蛋白p53上调凋亡调控因子(PUMA),Bcl2蛋白修饰因子(BMF)以及细胞周期蛋白激酶抑制因子p27(p27Kip1)的表达情况。结果:MDA-MB-231/DOX细胞中的miR-221/222表达水平高于亲本MDA-MB-231细胞(P0.05);MDA-MB-231/DOX细胞转染miR-221/222 inhibitor 96 h后,miR-221/222的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);与空白对照组相比,MDA-MB-231/DOX细胞转染miR-221/222 inhibitor 48h后,DOX继续处理48 h后,细胞的凋亡率明显升高,且细胞内的促凋亡蛋白PUMA,BMF以及p27Kip1的表达均增加(P0.05);DOX对inhibitor组耐药细胞的半数抑制浓度(IC50)显著低于空白对照组细胞及阴性对照组(P0.05)。结论:miR-221/222能够增加MDA-MB-231/DOX细胞对DOX的耐药性,这可能与下调促凋亡蛋白的表达有关;降低miR-221/222水平可诱导MDA-MB-231/DOX凋亡,并且上调促凋亡蛋白的表达,从而部分逆转MDA-MB-231/DOX对DOX的耐药性。     

PRMT5对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

该文目的为探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltranserase 5,PRMT5)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。设计PRMT5短发夹核糖核酸(sh RNA)序列,装入p LKO.1-TRC vector质粒,进行慢病毒包装,感染肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7402,嘌呤霉素筛选并培养稳定低表达PRMT5细胞株。Western blot、q PCR检测sh RNA干扰效率;CCK-8检测细胞增殖活性;平板克隆法检测细胞克隆形成能力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测细胞增殖、凋亡相关蛋白的影响。结果显示,成功构建慢病毒重组质粒sh-PRMT5并感染肝癌细胞。Western blot、q PCR结果表明,筛选出的稳转细胞株能低表达PRMT5;在肝癌细胞中下调PRMT5的表达,可抑制细胞增殖(P0.05),降低cyclin B1、cyclin D1、cdc20和cdc25B蛋白质水平(P0.05),降低细胞克隆形成能力(P0.05),促进细胞凋亡(P0.05),同时能诱导Caspase-3表达,降低Bcl-2/Bax的比值(P0.05)。由此说明,下调PRMT5的表达能抑制肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,为进一步研究体内PRMT5的作用提供基础。     

miR-21靶向调节MARCKS基因影响人乳腺癌细胞多西紫杉醇敏感性的研究

目的:探讨miR-21对MARCKS基因表达的调控及其与乳腺癌MDA-MB-231细胞株多西紫杉醇耐药的关系。方法:通过基因芯片筛选到miR-21在亲代敏感细胞株(MDA-MB-231/S)与多西紫杉醇耐药细胞株(MDA-MB-231/Doc)中存在差异表达,应用实时荧光定量(RT-qPCR)方法验证此差异,同时分别检测MDA-MB-231/S细胞和MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21模拟物和抑制物后的表达变化;通过靶基因预测软件预测miR-21与MARCKS基因的关系;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞术、RT-qPCR和蛋白质印迹法检测miR-21表达变化对三阴性乳腺癌细胞多西紫杉醇耐药性的影响,并探讨其与MARCKS基因表达的关系。结果:与MDA-MB-231/S相比,miR-21在MDA-MB-231/Doc中的表达水平明显升高(2.03±0.06)倍(P0.05)。与阴性对照组比,MDA-MB-231/S细胞转染miR-21 mimics后miR-21表达水平明显增高(2.26±0.07)倍(P0.05),而MARCKS基因在mRNA和蛋白水平上均明显下调。MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21 inhibitors后,miR-21表达水平是阴性对照组的(0.36±0.03)倍(P0.05),MARCKS基因的mRNA和蛋白水平高于其阴性对照组。转染miR-21 mimics后的MDA-MB-231/S细胞IC50显著高于其阴性对照组(P0.05),相反,与阴性对照组相比,MDA-MB-231/Doc细胞转染miR-21 inhibitors后,其IC50显著降低(P0.05)。MDA-MB-231/S转染miR-21 mimics后,miR-21表达量明显上调,MARCKS基因分别是阴性对照组的(3.564±0.336)倍和(2.019±0.268)倍(P0.05)。结论:miR-21可能通过靶向调节MARCKS基因增强乳腺癌细胞对多西紫杉醇的耐药性。     

低频超声联合微泡造影剂通过激活自噬和凋亡对乳腺癌细胞活力的影响

自噬和凋亡是乳腺癌细胞数量和活力减少的重要因素,低频超声对肿瘤细胞的作用引起了研究者们的广泛兴趣,但是低频超声对乳腺癌细胞自噬和凋亡的作用尚不清楚。该文采用功率0.5 W/cm2的1 MHz低频超声联合微泡造影剂,作用于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 60s后,吖啶橙染色,电镜观察自噬的数量,Western blot检测微管相关蛋白轻链3-II(microtubule associated protein1 light chain 3-II,LC3-II)、自噬相关基因5(autophagy related 5,ATG5)和SQSTM1(sequestosome 1)/p62蛋白质水平变化,分别分析自噬的水平。Western blot检测caspase-3,膜联蛋白V/PI染色和DAPI染色方法分析MDA-MB-231细胞凋亡水平。ATG5 si RNA转染细胞可抑制自噬,caspase抑制剂Z-VAD-FMK可抑制凋亡,使用CCK-8分析自噬和凋亡对MDA-MB-231细胞的作用。结果显示,低频超声联合微泡造影剂促使LC3-II和ATG5蛋白质表达水平显著升高,而使SQSTM1/p62蛋白质表达水平显著下降(P0.05)。透射电镜和共聚焦观察发现,MDA-MB-231细胞自噬体数量增加。低频超声联合微泡造影剂促使caspase-3蛋白质表达水平升高,凋亡率增加。抑制自噬和凋亡后均明显缓解低频超声联合微泡造影剂对细胞活力的抑制作用(P0.05)。该研究结果说明,低频超声联合微泡造影剂通过激活自噬和凋亡抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖活力。     

二十二碳六烯酸增强MDA-MB-231细胞对5-FU敏感性的研究

目的:探讨二十二碳六烯酸(DHA)对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖与凋亡的作用及对Wnt/1β-Catenin信号传导通路的影响.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT),测定DHA对5-FU诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖活性的作用;应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;RT-PCR检测MDA-MB-231细胞β-catenin、GSK-3β基因的表达情况;Western blot检测MDA-MB-231细胞3-catenin、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白的表达情况;细胞免疫组化染色观察DHA及DHA联合Licl对3-Catenin蛋白细胞内表达及定位的影响.结果:20 μg/ml、40μg/ml的DHA分别与5-FU联合应用,可增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用.DHA(20 μg/ml)能促进5-FU增强MDA-MB-231细胞G0/G1期阻滞作用、降低细胞增殖指数及诱导细胞的凋亡.DHA作用于MDA-MB-231细胞后,β-catenin基因及蛋白表达水平下降(P＜0.05)、GSK-3β的基因及蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05),磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白表达水平下降(P＜o.05).结论:DHA能增强5-FU对MDA-MB-231细胞增殖抑制和诱导凋亡,起化疗增敏作用,可能与其通过抑制GSK-3β磷酸化来阻断Wnt/β-Catenin信号通路有关.     

SETD8基因表达对乳腺癌细胞周期、活性氧及药物敏感性的影响

目的:构建SETD8重组慢病毒载体,探讨SETD8对人乳腺癌细胞周期、氧化应激的影响,并观察稳定敲低SETD8后对乳腺癌细胞多西他赛敏感性的影响。方法:构建含SETD8基因的重组慢病毒载体,经转染,荧光显微镜观察感染效率;采用RT-qPCR和Western blot检测SETD8 m RNA和蛋白相对表达量;采用流式细胞技术检测细胞周期及活性氧水平,通过CCK-8试剂检测稳定敲低SETD8基因的乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性变化。结果:成功包装慢病毒,荧光观察慢病毒感染效率在85%左右,通过PCR和WB验证SETD8过表达及敲低稳转细胞系的效率显著(P0.01)。低表达SETD8的乳腺癌细胞周期停滞在G2/M和S期,细胞内ROS水平高于对照组。不同浓度多西他赛处理的SETD8敲低稳转细胞系的细胞活性较对照组明显降低(P0.01)。结论:慢病毒介导下调SETD8表达,使得乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M期,细胞内ROS增多,与多西他赛发生协同作用,从而增加了药物敏感性。     

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。     

大豆苷元增强多西紫杉醇体外杀伤三阴性乳腺癌作用研究

目的:研究大豆苷元通过调节BRCA1表达逆转多西紫杉醇耐药的具体机制。方法:应用三阴性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、SUM-1315作为研究对象,通过MTT法评估分析不同治疗组的抑瘤率,应用流式细胞仪检测各治疗组细胞的凋亡情况;应用western-blot分析各治疗组BRCA1及凋亡相关蛋白的表达情况。结果:研究发现大豆苷元、多西紫杉醇及联合组对乳腺癌MDA-MB-231、SUM1315细胞的抑制呈浓度依赖的原则。并且BRCA1表达的细胞系MDA-MB-231比BRCA1突变的细胞系SUM1315抑瘤率更高,两个细胞系不同治疗组分别与对照组相比较,凋亡率明显升高,均具有统计学意义;且随着大豆苷元的加入,可使多西紫杉醇的凋亡率显著增加,并且可减少多西紫杉醇的用量。在SUM-1315细胞系,大豆苷元逆转多西紫杉醇耐药,增加凋亡比率更为显著。大豆苷元可使BRCA1突变型的三阴性乳腺癌细胞系SUM-1315表达BRCA1,并具有浓度依赖性。对各组细胞的凋亡蛋白的变化进行免疫印迹分析表明大豆苷元联合多西紫杉醇可通过调节caspase依赖的凋亡通路活性来增强多西紫杉醇的凋亡作用,从而增强乳腺癌细胞杀伤。结论:大豆苷元可通过调节BRCA1表达量,协同增强多西紫杉类药物杀伤三阴性乳腺癌细胞,促进凋亡进而逆转化疗耐药。     

慢病毒介导沉默PD-L1基因在乳腺癌细胞中的表达

构建含细胞程序性死亡因子配体1(PD-L1)基因的慢病毒载体三质粒体系,并检测其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达情况。p MAGic 7.1慢病毒表达载体与质粒△8.91和p VSVG用聚乙烯亚胺(PEI)共转293T包装病毒,感染并筛选获得MDA-MB-231稳转细胞系,检测PD-L1表达情况。(1)MDA-MB-231在3种乳腺癌细胞中PD-L1表达量最高;(2)三质粒转染293T细胞48 h后荧光强度增强,达到90%以上;用病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h获得20%左右荧光强度;(3)经筛选的MDA-MB-231稳转细胞系在m RNA水平和蛋白水平低表达PD-L1,其中由p MAGic-sh1包装的病毒干扰能力最强;(4)分别加入病毒后,干扰组细胞增殖能力下降,p MAGic-sh1干扰组细胞在加入病毒7 d后生长速度约为阴性对照的64.77%;(5)混合淋巴实验显示,sh-1干扰组的肿瘤抑制率为35.8%,是正常组的3.06倍,且干扰组的T淋巴细胞活性显著增强。成功通过PEI转染试剂建立了三质粒慢病毒包装体系,该体系获得的慢病毒可有效干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞中PD-L1的表达量,所得的干扰细胞株细胞增殖能力下降,可增强T细胞增殖活性及肿瘤细胞杀伤活性。     

PARP15在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长、凋亡的影响

该文研究了PARP15过表达在肺腺癌中的临床意义及其对肺腺癌细胞生长、凋亡的影响。利用UALCAN和GEPIA数据库比对PARP15基因在肺腺癌组织和正常组织中的表达水平,利用GEPIA数据库分析PARP15基因对肺腺癌患者预后生存的影响。构建核心质粒pCDH-PARP15,通过慢病毒包装及感染的方法在人肺腺癌细胞系A549和H1299中获得PARP15过表达稳定株,用Western blot鉴定PARP15过表达情况。采用CCK-8、克隆形成实验检测过表达PARP15对A549和H1299细胞生长的影响,流式细胞仪检测PARP15对A549和H1299细胞凋亡和细胞周期的影响。PARP15基因在肺腺癌组织中的表达水平均低于正常组织(P<0.05),且PARP15基因的表达水平与肺腺癌患者的良好预后呈正相关(P=0.003 6)。过表达PARP15抑制肺腺癌细胞的生长(P<0.05),并诱导细胞凋亡(P<0.05),但对细胞周期没有显著影响。PARP15可通过诱导肺腺癌细胞凋亡从而发挥抑制其生长的作用。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。