人尿源性干细胞及人脐带间充质干细胞的生物学性状比较

该研究探讨人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)及人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的生物学性状差异。分离培养hUSCs及hUC-MSCs,显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测干细胞表面标记物,锥虫蓝拒染实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力,划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色、油红O染色及阿利新蓝染色评估多向分化潜能。hUSCs为米粒状贴壁生长细胞,hUC-MSCs为长梭形贴壁细胞,呈旋涡状排列生长,两种细胞表型分析相似,均表达多种间充质干细胞标志物,但CD24在hUC-MSCs表达阳性,而CD105在hUSCs表达阳性。hUC-MSCs的增殖及迁移能力优于hUSCs,但后者的克隆形成能力更强。hUSCs及hUCMSCs都具有成骨、成脂、成软骨分化能力,hUC-MSCs的成骨能力强而hUSCs的成脂能力强。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的hUSCs,该细胞与hUC-MSCs相比具有相似的生物学性状,可作为再生医学自体移植的理想种子细胞来源。     

猫骨髓间充质干细胞的体外分离培养、纯化、鉴定

目的:分离、培养、纯化家猫的骨髓间充质干细胞,并对获得细胞的表面标志物进行鉴定,为进一步利用骨髓间充质干细胞的细胞移植实验奠定基础。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化家猫骨髓间充质干细胞,通过多次更换培养液获得较纯化的骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下对细胞形态进行观察;根据第1、3、5、7、9代细胞的镜下增殖情况绘制出生长曲线;通过流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD34、CD44和CD90的表达率。结果:在倒置相差显微镜下观察,分离培养的骨髓间充质干细胞贴壁呈梭形或纺锤形;原代细胞生长丛集成片,5~7 d达到融合,进行传代;培养到第三代以后,细胞出现相对均匀的梭形扁平外观,迅速增殖的细胞呈涡流样排列;第3、5代骨髓间充质干细胞增殖能力强于第7、9代;采用流式细胞仪分析结果显示细胞的CD34、CD44和CD90阳性率分别为17.5%、97.9%和91%,这与骨髓间充质干细胞表面抗原的表达一致。结论:分离培养的细胞具有骨髓间充质干细胞特性,成分相对单一,第3、5代细胞纯度高,增殖能力强,适用于进一步的实验研究。     

人尿源干细胞的提取和鉴定

目的从正常人尿液中分离得到具有增殖和分化能力的人尿源干细胞(h USC)。方法收集16例健康成人新鲜尿液,分离培养得到贴壁细胞,显微镜观察拍照。WST-1检测并绘制细胞生长曲线。流式细胞术分析细胞表面分子表达率。成骨和成脂诱导培养基诱导h USC分化。结果采用优化的细胞培养基得到12株具有较快增殖能力的h USC。分离的细胞中表达CD13、CD29、CD73、CD105的细胞数目均大于97﹪,表达CD90的细胞数目不足50﹪,表达造血系表面抗原CD14、CD19、CD34、CD45,内皮细胞表面抗原CD31以及HLA-DR的细胞数目均小于1﹪。h USC经诱导可分化成为骨和脂肪细胞。结论采用本研究自建培养体系可培养得到形态单一、具有较强增殖分化能力的人尿源干细胞。     

长期传代培养对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

该课题研究长期体外传代培养对人脐带间充质干细胞重要生物学属性的影响。采用组织块法分离人脐带间充质干细胞,体外反复传代培养后比较第5、10、20代细胞的主要生物学属性:采用细胞计数法与流式细胞仪检测不同代次细胞增殖活性和表面免疫标志物;染色体常规核型分析和微阵列分析检测其基因稳定性;成脂、成骨诱导分化检测其多向分化潜能;定量RT-PCR检测端粒酶反转录基因hTERT的表达; SA-β-gal活性确定细胞老化状态。第5、10、20代脐带间充质干细胞呈现相同的增殖曲线,各代次干细胞的增殖速率无显著性差异。不同培养代次的脐带间充质干细胞表面均呈现CD105、CD90、CD44、CD73高表达, CD19、CD34、CD45及HLA-DR不表达或低表达。基因稳定性分析证实三个代次干细胞均为正常二倍体核型,染色体基因组未发生基因拷贝数缺失、重复和大片段纯合子现象。成脂和成骨分化潜能以及hTERT表达均未见显著性差异。SA-β-gal活性检测显示,随培养代次的增加,脐带间充质干细胞开始呈现衰老征象,尤以第20代明显。体外反复传代长期培养对人脐带间充质干细胞的基本生物学属性、基因稳定性及其多向分化潜能均无显著性影响。过度长期培养有可能导致干细胞老化,活性降低。     

体外培养传代人脂肪、脐带、胎盘间充质干细胞的遗传特性比较研究

该文利用无血清培养基对脐带间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)、脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)和胎盘间充质干细胞(placenta derived mesenchymal stem cells,PMSCs)进行了体外传代培养,通过比较此三种不同来源间充质干细胞生物学特性及遗传特性在传代过程中的变化及差异,为间充质干细胞临床应用安全性及细胞来源的选择提供实验和理论依据。通过细胞形态观察、细胞周期检测、表面标记物检测、染色体核型分析、相关基因表达及细胞因子的定量分析,结果发现,UC-MSCs和ADMSCs在体外培养时呈长梭形旋涡状贴壁生长,而PMSCs则呈短梭形旋涡状或网状贴壁生长,细胞核较大。通过长期传代培养及细胞周期分析发现,PMSCs增殖活性最强,UC-MSCs次之,AD-MSCs最弱。三种细胞均表达CD73、CD90和CD105,且阳性率大于98%;均低表达CD11b、CD19、CD34和CD45,且阳性率低于1%;HLA-DR均为阴性。三种细胞染色体核型稳定,没有缺失、易位和倒位等现象。7种基因表达均有差异,但在7代内各基因表达量仅有微小变化,细胞因子在传代过程中均比较稳定。以上结果提示,利用无血清培养基体外传代培养至7代以内,PMSCs比AD-MSCs和UCMSCs更安全。     

人蜕膜组织子宫内膜干细胞的分离、培养及鉴定

目的:研究人蜕膜组织中子宫内膜干细胞(endometrial stem cells,EnSCs)的分离、培养及鉴定方法。方法:取人工流产患者的蜕膜组织,用胰酶和II型胶原酶消化分离子宫内膜细胞,计数后,以极低密度接种于10 cm培养皿,分离单克隆贴壁细胞。倒置显微镜观察EnSCs形态变化及克隆形成情况;CCK-8法绘制EnSCs生长曲线,计算倍增时间;流式细胞仪分析EnSCs细胞周期及表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146表达情况。结果:EnSCs呈长梭形,成纤维细胞样,可见粗细不等的胞质突起,增殖至80-90%呈漩涡状生长,其克隆形成率分别为3.91%和9.14%;EnSCs生长曲线呈"S"型,接种48 h至60 h后进入对数生长期,于第9天达到平台期,倍增时间为37-52 h;流式细胞仪测定EnSCs表面抗原CD29(99.13%),CD44(97.39%),CD73(99.68%),CD90(96.76%),CD105(89.64%),CD146(77.96%)呈阳性表达,而CD31(1.30%),CD34(0.68%),CD45(1.26%)呈阴性表达,有61.79%的细胞处于G0/G1期,22.37%的细胞处于S+G2/M期。结论:采用组织消化法分离单克隆贴壁的子宫内膜细胞,能够获得纯化的EnSCs。     

人胰腺干细胞建系及移植诱导胰岛治疗大鼠糖尿病

供体不足已成为移植胰岛治疗Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的主要障碍,分离克隆胰腺干细胞作为种子细胞并诱导其分化为功能性胰岛可提供丰富的移植资源．本研究从人流产胎儿胰腺组织分离获得1例单克隆胰腺干细胞系．无菌取流产胎儿胰腺组织,0．1％Ⅳ型胶原酶消化分离为单个细胞和细胞团．低糖DMEM＋10％FBS培养,单个细胞和细胞团贴壁,原代上皮样胰腺干细胞克隆性生长．0．25％胰蛋白酶＋0．04％已二胺四乙酸（EDTA）消化传代,成纤维样细胞和其他细胞逐渐被消除,上皮样胰腺干细胞逐渐被纯化．克隆环筛选,获得单克隆人胰腺千细胞．在培养液中添加10ng／mL表皮生长因子（EGF）,单克隆人胰腺干细胞快速生长至单层,呈铺路石样．继续传代培养,1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺干细胞已传50代．液氮冷冻保存细胞1×10^9个以上．染色体核型分析,该干细胞系为正常的二倍体细胞．免疫组织化学反应,共表达pdx1,glucagon,nestin及CK19蛋白,不表达insulin,CD34,CD44及CD45．RT-PCR检测,转录pdx1,glucagon,nestin及CK19的mRNA,不转录insulin．β-巯基乙醇诱导,分化为神经细胞,免疫组织化学反应表达NF蛋白．烟酰胺诱导,分化为DTZ染色阳性,转录表达insulin,分泌insulin和C肽的功能性类胰岛．将单克隆人胰腺干细胞体外诱导胰岛移植在STZ制备的糖尿病大鼠肾囊内,能降低糖尿病大鼠血糖水平,延长寿命．     

人尿源性干细胞的分离培养及应用研究新进展

人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)是从人尿液中通过常温离心分离培养出来的具有良好增殖活性和多向分化能力的成体干细胞,具有间充质干细胞的生物学特性,其在组织器官修复、疾病治疗、药物活性及毒性替代筛选等领域均有重要的应用前景,且已能实现多种途径向尿源性多潜能干细胞(urine-induced pluripotent stem cells,u-iPSCs)转化,但在研究过程中发现仍然存在一些值得深入研究的问题,如人尿液源性干细胞的来源尚不明确,定向诱导多潜能干细胞分化的条件选择及如何提高重编程效率等.本文对hUSCs的来源、分离培养方法、生物学特性及其应用研究最新进展进行综述,总结了由hUSCs向u-iPSCc诱导的方法及其应用前景,为hUSCs的研究和应用提供参考.     

脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定

目的探讨脐带间充质干细胞的外泌体的获取与鉴定方法。方法通过组织块贴壁法从胎儿脐带分离和培养脐带间充质干细胞并通过RiboTMExosome Isolation Kit收集外泌体,采用电镜和流式细胞仪鉴定外泌体。结果第二代脐带间充质干细胞表面CD45、CD34和HLA-DR呈阴性表达,CD29、CD44和CD105呈阳性表达;在透射电镜下观察到脐带间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形,大小不均匀,直径30~100 nm,有完整的膜结构,内含低密度物质;流式细胞检测外泌体CD9、CD63、CD81和CD83呈阳性表达。结论在培养脐带间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体,可以通过电镜和流式细胞仪对脐带间充质干细胞的外泌体进行鉴定。     

诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

选用Wistar大鼠分离骨髓间充质干细胞作体外培养及鉴定其表达抗原CD44、CDw90;采用10μmol／L 5-氮胞苷诱导第1代的骨髓间充质干细胞,于诱导后2、4周进行免疫细胞化学反应检测α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T。证实体外培养的第1代骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞,为指导体外诱导的心肌细胞应用于。临床提供一定的理论依据和技术手段。     

脱细胞神经移植物对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探讨脱细胞神经移植物诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞的可行性。方法将分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增,行表型鉴定后,取第5代细胞,诱导组采用脱细胞神经移植物匀浆进行诱导,非诱导组加入等量无血清培养基,倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测诱导后细胞S-100,神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的表达情况。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,免疫细胞化学染色GFAP、S-100的阳性表达率分别为为(42±4)%和(64±5)%。结果 脱细胞神经移植物可诱导骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞。     

比格犬会厌黏膜来源干细胞的分离培养与生物学特性鉴定

目的:探讨建立喉部黏膜间充质干细胞的分离培养方法,并对其生物学特性进行鉴定,为进一步研究其在喉部瘢痕中形成的作用及喉部组织工程提供参考.方法:以比格犬喉部会厌背侧(舌面)黏膜为研究对象,采用消化培养的方法分离具有间充质干细胞样细胞.选取第3代细胞对其进行生物学特性鉴定,首先利用MTT法检测其增殖活性及克隆形成情况,然后通过流式细胞术检测细胞表面分子标记物CD29及CD34的表达情况,最后应用第3代细胞对其进行成脂肪细胞和成骨细胞分化培养,观察其分化能力.结果:分离培养细胞形态较为一致,绝大多数呈梭形,排列不规则.MTT增殖活性实验及克隆形成试验结果显示,所分离的细胞具有良好的增殖活性和克隆形成率;流式细胞术结果显示,该细胞表达CD29间充质干细胞细胞表面标记物,低表达造血干细胞细胞表面标记物CD34;同时,该细胞诱导分化成脂肪细胞和成骨细胞实验表明,其具有多向分化潜能.结论:从比格犬会厌背侧黏膜分离的细胞具有间充质干细胞样特性,为进一步研究喉部瘢痕形成机制及喉部组织工程提供了技术基础.     

糖尿病肾病患者尿源性干细胞的分离鉴定及与健康人尿源性干细胞的细胞生物学比较研究

干细胞移植是糖尿病肾病新的治疗途径,但异种干细胞存在伦理及免疫排斥等问题。该研究从糖尿病肾病患者尿液中提取出一种类似干细胞的细胞,称之为糖尿病病人尿源性干细胞(USCs from patients with diabetic nephropathy,D-USCs),并比较了与健康人尿源性干细胞(urine derived stem cells,USCs)生物学特性的差异。通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物,茜素红及油红O染色分别检测成骨和成脂分化潜能,以鉴定其干细胞特性。通过绘制生长曲线比较D-USCs与USCs增殖能力,人促血管生成因子检测试剂盒检测细胞外分泌因子的表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡率的差异。结果表明,此类细胞可以在体外分离培养,连续传代生长,细胞形态保持米粒状,表达间充质干细胞标志物(包括CD 24、CD 29、CD 73、CD 90、CD 105)、周细胞标志物(CD 146),不表达造血干细胞标志物(包括CD 31、CD 34、CD 45),具有成骨和成脂分化的潜能。与USCs相比,D-USCs的增殖能力受到损伤,分泌因子种类基本保持一致,但数量上有所减少,细胞凋亡率升高。综上所述,该研究成功从糖尿病肾病病人尿液中提取出尿源性干细胞,为干细胞移植治疗肾损害提供了可能的新的细胞来源,避免了异体免疫排斥反应。     

胎儿胰岛样细胞团源上皮样细胞分离、纯化和鉴定

旨在优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系,为糖尿病研究和治疗提供种子细胞。采用胶原酶消化法,分离培养出胰岛样细胞团(ICCs),对其进行贴壁培养,从中纯化出上皮样细胞。采用MTT法测定其生长情况并绘制生长曲线。采用免疫组织化学染色检测分离得到细胞的PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nestin、Glut2、Vimentin、Insulin表达情况。应用流式细胞仪检测其表面标志。由分离培养的ICCs成功纯化出上皮样细胞;传40代,每代冻存106~108个细胞;生长曲线显示其传代第3天进入对数生长期,第5天进入平台期;免疫组织化学染色显示其表达PDX-1、PCNA、CK-7、CK-19、Nestin、Glut2、Vimentin;不表达Insulin;流式细胞仪分析表明其表达CD29、CD44、CD166,不表达CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。由胎儿胰腺能分离出具有自我更新能力的上皮样细胞,为导管来源,具干细胞特性。     

慢病毒介导神经生长因子过表达诱导脐带间充质干细胞向神经元样分化

目的探讨神经生长因子(NGF)过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞(UMSCs)对细胞分化的影响。方法分离培养UMSCs,流式细胞术鉴定后利用慢病毒载体感染细胞,使其过表达NGF,72h后,通过免疫荧光检测NGF和GFP的表达,Western blot检测NGF蛋白表达水平,ELISA法检测细胞上清液NGF的含量,qRT-PCR检测相关神经因子基因的表达。结果流式细胞术显示细胞表面CD105、CD90、CD73阳性而CD34、CD45、CD19和CD14阴性,鉴定为脐带间充质干细胞。慢病毒转染后细胞NGF和GFP阳性,细胞内NGF和培养液中b-NGF含量都显著性增加,NGF、nestin、GFAP、MAP2及tubulin等mRNA的表达显著性增加。结论神经生长因子过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞会促使细胞向神经元样细胞分化,可应用于后续研究。     

cxcr2基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定

目的构建小鼠CXC型趋化因子受体2(CXCR2)基因cxcr2过表达的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mes-enchymal stem cell,BMSC)并进行鉴定。方法全骨髓贴壁法分离培养小鼠BMSC,采用流式细胞术检测干细胞抗原1(stem cell antigen-1,SCA-1)、CD44、CD43、CD45、IA/IE表达率,并诱导成骨分化。以含有小鼠cxcr2的质粒为模版进行PCR扩增,将获得的cxcr2克隆到慢病毒载体,命名为p Lenti-cxcr2-GZ;将其与慢病毒包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒后,通过离心法感染BMSC,经过1μg/mL zeocin压力选择建立了稳定表达CXCR2的小鼠BMSC(CXCR2-BMSC)。采用流式细胞术和RT-PCR分别检测其CXCR2蛋白和m RNA表达水平,Transwell趋化实验检测其迁移能力。结果 90%以上的第3代BMSC表达CD44、SCA-1,几乎不表达IA/IE、CD34、CD45,且成功诱导成骨分化。菌液PCR、质粒双酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定结果得到特异、大小正确的条带及测序鉴定正确,表明成功构建了p Lenti-cxcr2-GZ表达质粒。流式细胞术和RT-PCR结果显示,CXCR2-BMSC的CXCR2蛋白和m RNA表达水平均明显高于对照组BMSC,差异有统计学意义(P<0.001)。Transwell结果显示,CXCR2-BMSC迁移能力高于对照组BMSC,差异有统计学意义(P<0.01)。结论利用慢病毒系统成功构建了稳定表达CXCR2的BM-SC,cxcr2基因修饰BMSC后可明显增加BMSC的迁移能力。     

人脐带干细胞来源的外泌体促进体外培养雪旺细胞迁移的研究

目的:外泌体是活细胞分泌的来源于多囊泡体的膜性囊泡,其主要作用包括携带与运输。雪旺细胞是周围神经再生中非常优秀的种子细胞,但其迁移能力较差,影响修复效果。本文旨在探讨外泌体和雪旺细胞共培养是否可以促进雪旺细胞迁移。方法:本实验通过分离纯化人脐带干细胞外泌体和大鼠坐骨神经雪旺细胞并鉴定,随后将其共培养于Transwell小室观察雪旺细胞迁移率。结果:通过人脐带干细胞超高速离心法得到的外泌体高表达干细胞标志物CD44(92.2±3.6%)、CD73(99.1±0.6%),并且低表达单核细胞表面抗原CD14(0.5±0.06%)以及造血干细胞表面抗原CD34(0.4±0.07%),外泌体鉴定高表达CD81和CD9;雪旺细胞培养鉴定纯度达(92.3±2.7)%;均符合实验要求。通过Transwell小室实验发现外泌体可以明显促进雪旺细胞的迁移,并且具有一定剂量关系。结论:外泌体可以提高雪旺细胞的迁移能力,从而使雪旺细胞在组织工程领域中的应用产生巨大突破。     

胎盘间充质干细胞的体外培养及其生物学特性研究

目的：探讨胎盘间充质干细胞（PMSCs）的体外分离和培养方法,建立稳定的PMSCs体外培养扩增体系。方法：将胎盘组织经胶原酶消化、密度梯度离心、贴壁筛选法分离,获得并培养人PMSCs,观察细胞形态及其超微结构;应用流式细胞术测定细胞周期及CD14、CD29、CD34、CD44、CD45的表达,研究其增殖和生长特性。结果：在体外培养条件下,人PMSCs贴壁生长,为成纤维细胞样,与骨髓间充质干细胞相似;CD14/CD34/CD45阴性,CD29/CD44阳性,核浆比大,细胞周期检测G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。结论：体外获得的PMSCs形态单一、生长稳定、增殖能力较强,具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞形态、表面标志。由于其来源方便、丰富,无伦理学限制,因此可进一步用于细胞治疗的研究。     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的表达为阳性,SSEA1表达为阴性,体外悬浮培养可以形成拟胚体。结论人脐带间充质干细胞可以作为人胚胎干细胞的饲养层细胞,支持其生长,并维持其未分化生长状态。