同源克隆栀子玉米黄素合成途径酶基因保守区

目的:玉米黄素生物合成途径在植物中高度保守,由7个酶催化步骤组成。本研究从栀子果实中克隆这些酶基因的保守区段。方法:利用简并引物,优化PCR扩增体系和扩增条件,胶回收后进行T-A克隆和测序。结果:成功扩增出八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)(GenBank accession JQ690895)503bp、八氢番茄红素脱饱和酶(phytoene desaturase,PDS)(Gen-Bank accession JQ690896)544bp、胡萝卜素脱饱和酶(carotene desaturase,ZDS)(GenBank accession JQ690897)611bp、胡萝卜素顺反异构酶(carotene cis-trans isomerase,CRTISO)(GenBank accession JQ690898)567bp、番茄红素β-环化酶(lycopene-β-cyclase,LYC)(GenBank accession JQ690899)745bp和β-环羟化酶(β-ring hydroxylase,β-OHase)(GenBank accession JQ690900)594bp的基因保守区段,序列已经提交GenBank登陆。结论:该研究克隆了玉米黄素合成途径中6个酶基因的保守区段,为今后应用于生物合成途径的遗传操作奠定了基础。     

重叠延伸PCR法合成栀子两个糖基转移酶基因

[目的]糖基转移酶UGT94E5和UGT75L6催化栀子果实中西红花总苷生物合成途径的末端步骤。该研究利用重叠延伸PCR法,合成编码这两个酶的基因序列。[方法]首先将基因分段,每段两端均加上p UC57载体的多克隆位点作为接头,拼接成800 bp以下的片段,再输入到DNAWorks软件中,获得最优寡核苷酸片段组合;将合成的寡核苷酸片段混合,用作模板,进行两次PCR扩增,获得加了接头的各段序列,亚克隆到自制的p UC57 T载体上。酶切后回收插入片段,混合,用作模板,扩增全长基因,产物克隆到自制的p UC57 T载体上。[结果]成功合成了栀子Gj UGT9(编码UGT94E5)和Gj UGT1(编码UGT75L6)基因,分别长1 496 bp和1 583 bp。[结论]重叠延伸PCR法能够有效地合成栀子两个糖基转移酶基因序列,为遗传操作奠定了基础。     

栀子类胡萝卜素剪切双加氧酶基因GjCCD4的克隆与原核表达

[目的]类胡萝卜素剪切双加氧酶(Carotenoid cleavage oxygenase,CCD)是西红花总苷生物合成途径的关键酶,本研究拟从栀子果实中克隆CCD基因。[方法]在NCBI数据库中搜索CCD蛋白,获得种子序列后,构建系统进化树,按照亲缘关系分组。再利用CODEHOP法,针对每个组设计简并引物,在栀子果皮和果肉c DNA中扩增,获得保守区段。然后通过RACE获得基因全长。构建pet28a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌株后在30℃培养4 h,转化菌株Aritic Expression(DE3)后在15℃培养过夜,诱导蛋白表达。[结果]克隆了一个GjCCD4基因,长1 863 bp,编码的蛋白质N端序列变动较大,C端保守性强,N-末端含有一个叶绿体定位的信号肽。系统发育分析表明,GjCCD4蛋白与拟南芥和西红花的同源蛋白聚在同一个簇。在BL21(DE3)和AE(DE3)菌株的沉淀中表达出大量包涵体形式的融合蛋白,在BL21(DE3)菌株的上清中表达出少量可溶蛋白。[结论]获得了一个类胡萝卜素剪切双加氧酶基因GjCCD4,通过原核表达获得了少量可溶蛋白。     

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1的克隆及原核表达

本研究以‘明丰香菇’芥蓝叶片总RNA为模板,采用同源克隆法设计并合成特异性引物,采用反转录PCR技术克隆得到芥蓝类胡萝卜素生物合成关键结构基因-八氢番茄红素脱氢酶基因Ba PDS1。序列分析表明,该基因c DNA序列长1 692 bp,编码563个氨基酸,推测蛋白等电点为5.96,理论分子量为63.15 k D;序列比对发现芥蓝Ba PDS1基因编码的氨基酸序列与甘蓝、花椰菜、油菜等植物的PDS具有很高的同源性;系统进化树分析表明,芥蓝PDS1与甘蓝PDS1蛋白的亲缘关系最为接近。之后构建p EASY-Blunt E1-Ba PDS1原核表达载体,转入Transetta(DE3)感受态细胞中,诱导后获得特异表达蛋白条带,且大部分以包涵体形式存在。本研究为揭示芥蓝Ba PDS1基因功能提供了一定的理论依据。     

栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析

为探讨栀子(Gardenia jasminoides)果实中藏花素的合成机理,克隆了栀子类胡萝卜素生物合成的关键酶八氢番茄红素合成酶(GjPSY)基因的全长cDNA。结果表明,推导的GjPSY氨基酸序列与双子叶植物来源的GjPSY亲缘关系较近。采用HPLC检测栀子果实中的藏花素-1含量为(3.96±1.48) mg g-1,在叶片中未检出。通过RT-PCR分析表明,GjPSY在栀子叶片和果实中均有表达,且表达水平一致。因此推测,GjPSY的转录水平与果实中藏花素-1的合成无关。     

金鱼草AmPDS基因克隆及调节类胡萝卜素合成功能分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素进行生物合成途径中的关键酶。为了深入探究金鱼草PDS基因的功能,该研究以‘马里兰’金鱼草(Antirrhinum majus‘Maryland True Pink’)为材料,对其PDS基因(AmPDS)全长序列及蛋白结构进行分析,并克隆了AmPDS基因片段;采用qRT-PCR技术检测AmPDS基因在不同时期及部位的相对表达水平,利用VIGS技术验证AmPDS基因功能,用紫外分光法测定叶片中各类色素含量。结果显示:(1)成功克隆AmPDS基因片段(500 bp);AmPDS基因cDNA全长1743 bp,编码580个氨基酸;其蛋白分子量为64.75 kD,理论等电点6.66;同源比对分析显示AmPDS基因与芝麻(Sesamum indicum)的序列相似性最高。(2)qRT-PCR分析表明,AmPDS基因在全株均有表达,且在全盛期花朵的上瓣和叶片中表达量最高。(3)构建pTRV2-AmPDS载体,建立了金鱼草的VIGS沉默体系,AmPDS基因沉默效率约为53%,与阴性对照相比叶片中各类色素含量均显著降低。研究认为,AmPDS基因是金鱼草类胡萝卜素生物合成途径中的关键基因,可作为金鱼草VIGS沉默体系的指示基因,为后续研究金鱼草其他基因功能奠定基础。     

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

三角褐指藻八氢番茄红素脱氢酶1-2基因启动子克隆和表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)是类胡萝卜素合成的关键酶，在光合生物的类胡萝卜素代谢调控中发挥了重要的作用。本研究根据三角褐指藻基因组数据库，克隆三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子序列，采用启动子缺失技术研究启动子活性，利用Plant CARE预测三角褐指藻PDS1和PDS2启动子顺式作用元件，采用qRT-PCR技术检测三角褐指藻PDS1和PDS2基因在不同胁迫下的相对表达量。结果表明，三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子全长分别为2 000 bp和920 bp,不同长度的5′端缺失后启动子均能驱动绿色荧光蛋白表达，具有较强启动子活性。Plant CARE分析结果表明，三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子中均含有与光照和植物激素响应有关的顺式作用元件。光照和植物激素胁迫处理结果表明，三角褐指藻PDS1基因受光合诱导因子(photosynthetic induction factor, PIF)的诱导表达，但在其他因子处理下表达均显著下降(P<0.05)或无显著性差异。三角褐指藻PDS2基因在PIF、红光、茉莉酸甲酯、乙酰水杨酸和脱落酸...     

盐藻PDS基因的同源克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】八氢番茄红素脱氢酶PDS为真核膜结合蛋白,我们通过更换不同的表达策略,探索在大肠杆菌中表达真核膜结合蛋白的方式。【方法】利用RACE的方法克隆盐藻PDS的全长c DNA序列。利用原核表达载体p ET-28a构建p ET-28a-PDS表达载体;使用PLtac启动子替换T7启动子构建p ET-PLtacPDS表达载体;合成Mistic序列融合入p ET-28 a中构建了p ET-Mistic-PDS融合表达载体。分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。【结果】获得了盐藻PDS基因的全长c DNA序列2237 bp,开放阅读框为1749 bp,共编码582个氨基酸(NCBI登录号为GQ923693.1)。利用p ET-28a-PDS和p ET-PLtacPDS表达的PDS蛋白表达量低,并以包涵体形式存在;利用p ET-Mistic-PDS载体表达的PDS蛋白表达量明显提高,且大部分以可溶蛋白形式存在,具有脱氢酶活性。【结论】实验结果表明Mistic作为促溶标签能促进膜蛋白的正确折叠,提高蛋白的可溶性。蛋白酶活测定结果证明了Mistic的融合可以保持蛋白的天然活性。     

番茄GRAS转录因子家族基因SIGLD1的克隆及VIGS载体构建

本研究以醋栗番茄(LA2184)为材料,运用生物信息学方法和PCR技术,预测SIGLD1基因与番茄抗冷的相关性,设计SIGLD1基因的特异性引物,克隆出片段长度为413 bp的序列。以番茄八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,PDS)基因作为阳性对照,该基因克隆片段长度为427 bp。系统进化树显示,SIGLD1基因与拟南芥中已发表过的抗冷基因聚类在一起,利用RT-PCR技术,检测SIGLD1基因在不同冷处理时间点上的表达量,发现SIGLD1基因在3~6 h的表达量最高,说明该基因在番茄的抗冷过程中发挥重要作用。本研究成功构建出SIGLD1、PDS基因的病毒诱导基因沉默的重组载体。构建的p TRV2-SIGLD1、p TRV2-PDS重组载体将为下一步研究番茄中SIGLD1基因的功能验证奠定实验基础。     

西双版纳黄瓜Cs-Psy1基因的序列特征与表达分析

西双版纳黄瓜是我国特有的果肉橙黄色的黄瓜变种资源,不同种质间的β-胡萝卜素含量差异明显。PSY是胡萝卜素生物合成途径中的第1个限速酶。本文以西双版纳黄瓜为试材,分别克隆西双版纳黄瓜八氢番茄红素合成酶(Cs-PSY1)的DNA和c DNA序列,结果显示,DNA长2797 bp,包含5个内含子和6个外显子,c DNA序列长1385 bp,编码421个氨基酸。Psy1推测的氨基酸序列包含该家族的2个特征序列,保守性很高。该蛋白为不稳定蛋白,无明显疏水区,未预测到跨膜结构;系统进化分析结果显示,西双版纳黄瓜的Cs-PSY1蛋白与甜瓜的同源性较高;与栽培黄瓜深度测序材料"9930"和"GY14"的序列进行比较分析,结合115份黄瓜重测序结果,共发现5个SNP,其中2个位于起始密码子上游27 bp处和971 bp处,3个位于内含子区域。其中SNP4在重测序的19份西双版纳黄瓜中的突变率为100%,在96份栽培黄瓜中的特异性为5.3%。转录因子结合位点预测结果显示,在普通栽培黄瓜该位点处存在一个CTAG motif,在西双版纳黄瓜中该位点突变后则不存在该motif。利用实时荧光定量PCR技术分析Cs-Psy1的表达量变化趋势,结果表明,在黄瓜不同果实发育时期,该基因的表达量均呈现先上升后下降的趋势,在西双版纳黄瓜中表达量变化的差异明显,在授粉后50 d达到最大值,是果实发育初期表达量的8倍多,是同时期普通黄瓜的4倍多,而普通黄瓜表达量的总体变化相对平缓。西双版纳黄瓜果实内果皮的表达水平明显高于中果皮,最高相差约5倍,普通黄瓜差异不明显。从上述研究结果推测Psy1基因可能影响西双版纳黄瓜的β-胡萝卜素积累。     

山葡萄谷胱甘肽S-转移酶基因（VAmGST4）克隆及表达分析

采用RT-PCR和SMART RACE技术克隆了山葡萄VAmGST4基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ645770,基因全长885bp,包括开放阅读框（ORF）642bp,编码213个氨基酸。该基因表达产物相对分子质量为24.24kDa,等电点为5.72,是不稳定蛋白;该基因属于GST超基因家族,不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄（AY971515）、荔枝（EF613493）、矮牵牛（Y07721）、紫苏（AB362191）和玉米（EU964162）等植物的GST氨基酸序列的同源性系数分别为99%、67%、64%、61%和47%。半定量PCR显示,在果实着色过程中,VAmGST4在果皮中表达随花色苷的合成上调;在茎、果肉和果皮中均有表达,而在叶片中不表达,表明VAmGST4的表达与花色苷的生物合成密切相关。     

香蕉谷氨酸脱羧酶基因克隆与表达

根据抑制缩减杂交文库获得的香蕉谷氨酸脱羧酶基因片段,利用RACE技术,首次从香蕉果实中克隆了谷氨酸脱羧酶基因的cDNA全长.结果表明,该cDNA的ORF全长1 500 bp,编码499个氨基酸.Blast分析表明,该基因所推导的氨基酸序列与水稻、柑橘、白杨、番茄等具有较高的一致性,分别为82%、81% 、79% 、78%,推测其编码的蛋白质分子量为56.25 kD,等电点5.21,具有与钙调蛋白结合的C端延伸区域和磷酸吡哆醛结合位点.组织特异性和果实采后正常成熟不同阶段表达结果显示,该基因在香蕉根、茎、叶、花、果实中均有表达,果实中的表达量较高,正常成熟表达量的增加可能受内源乙烯诱导并促进乙烯生物合成,推测其可能在不同的生理过程中起作用,并且与果实成熟及乙烯生物合成密切相关.     

大豆GmPDS基因的克隆及VIGS表达载体构建和鉴定

病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究基因功能的方法,对于植物特别是难于转化的大豆而言尤其适用。本研究采用PCR技术从大豆(Glycine max)基因组中克隆了八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,PDS)基因的部分序列,命名为GmPDS(Glycinemax PDS)。该片段长430bp,序列分析表明,该基因与大豆八氢番茄红素去饱和酶(GenBank登录号:M64704)cDNA序列同源性为99%。双酶切GmPDS片段和烟草脆裂病毒载体(pTRV2),构建了重组载体pTRV2-GmPDS,并将该重组载体分别转化农杆菌C58C1/pMP90、GV3101和LBA4404,为分析pTRV载体是否可以浸染大豆奠定了基础。     

枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞(Lycium barbarum L.)为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp(编码588个氨基酸)、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%~90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。     

西瓜八氢番茄红素合成酶基因片段的克隆和序列分析

以西瓜品种ZXG00152为材料,提取瓜瓤总RNA,进行反转录,依据植物八氢番茄红素合成酶(PSY)的氨基酸保守序列设计引物,以cDNA第一链为模板,扩增得到长约750 bp的cDNA片段。将该片段克隆到pMD19-T载体,测序结果表明该基因片段长748 bp,编码249个氨基酸,Blast搜索结果表明,由该片段推导出的氨基酸序列与其它植物的八氢番茄红素合成酶有较高的同源性,其中与甜瓜的一致性达到97.8%。该片段已在GenBank中登录(登录号:DQ494214)。     

普通烟草八氢番茄红素脱氢酶基因的原核表达及表达谱分析

基于NCBI数据库中本氏烟(Nicotiana benthamiana)的烟草八氢番茄红素脱氢酶PDS基因(ABE99707)的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以烟草栽培品种红花大金元叶片总RNA为模板,通过PCR方法获得了烟草NtPDS基因的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1749 bp,编码582个氨基酸,推测该蛋白等电点为7.53,理论分子量为65.04 kD。通过构建融合表达载体pET-32a-NtPDS,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃下经1 mmol/L IPTG诱导4 h表达后,产生了以可溶性蛋白形式存在的NtPDS融合蛋白,并通过Western blotting验证融合蛋白获得表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在烟草的叶片、花和茎中均有表达,在根中没有表达。该结果为进一步研究烟草八氢番茄红素脱氢酶NtPDS的活性和生物学功能奠定了基础。     

植物八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因保守结构域模式与系统进化分析

八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase,PDS）是类胡萝卜素生物合成过程中催化无色的八氢番茄红素形成有色的一类胡萝卜素的关键酶。本文选取公开发表的PDS72．通过在NCBI数据库中搜索得到的43条来自于不同物种的PDS的氨基酸序列进行分析。通过CDD在线软件预测每条氨基酸序列保守结构域,结果表明,所选取序列均包含一个NAD（P）-bindingdomain4守结构域,其长度为51个氨基酸,不同物种保守结构域中氨基酸的突变集中在8个不同的位置上;利用MEGA等软件进行多序列比对后构建系统进化树,可以看到不同物种的PDS蛋白清晰地分类到各自的类群内,和传统的分类学结果一致,表明所有不同分支的PDS蛋白都是单系同源,并不存在物种间的水平基因转移。     

葡萄果实(E)-β-丁香烯合酶基因的克隆及其表达分析

利用生物信息学方法,通过电子克隆获得葡萄(Vitis vinifera Linn.) (E)-β-丁香烯合酶基因的cDNA序列;以从葡萄品种‘德引84-1’(‘Deyin 84-1’)果肉中提取的mRNA为cDNA模板,利用特异PCR技术克隆得到1个全长1 880 bp的基因,被命名为Vv-ECar(GenBank登录号JF808010),该基因序列包括开放阅读框1 674 bp、3’非翻译编码区209 bp和poly+ (A) 28 bp,可编码557个氨基酸.比对结果显示:葡萄Vv-ECar基因的核苷酸序列与葡萄VvGwECar2基因的同源性达93％,二者编码的氨基酸序列同源性达90.8％,均含有植物萜类合酶家族共有的保守域DDXXD;葡萄Vv-ECar与茶[Camellia sinensis (Linn.)0.Kuntze]和杨(Populus balsamifera subsp.trichocarpa×P.deltoids)的萜类合酶相关基因同源性均在73％以上;分子进化树的分析结果也显示葡萄Vv-ECar基因编码的氨基酸序列与其他植物的同源序列具有高度保守性.半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析结果显示:在葡萄果实发育的不同阶段均有Vv-ECar基因的表达,但其相对表达量随果实的发育呈先低后高的趋势,其中在幼果期相对表达量最高.     

香蕉果实软化相关β-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达分析

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）通过分解细胞壁半纤维素切除半乳糖键而参与果实软化。为了阐明香蕉（Musasp．）果实成熟过程中的软化与细胞壁代谢酶β-半乳糖苷酶基因表达之间的关系,采用RT-PCR方法,从成熟香蕉果实果肉中分离了编码β-半乳糖苷酶基因的部分cDNA（MA-Gal）,序列分析表明,MA-Gal包含927bp,编码309个氨基酸,包含5个β-半乳糖苷酶结构域（典型真核生物中β-半乳糖苷酶包含7个结构域）,推导的MA-Gal蛋白质中有β-半乳糖苷酶蛋白的催化活性部位GGPIILSQIENEY（F）;系统进化树分析结果表明MA-Gal属于第一类β-半乳糖苷酶基因（该类主要在果实中表达）;β-半乳糖苷酶活性和硬度的变化表明其与香蕉果实硬度变化密切相关;Northern分析显示,跃变前期的果肉中,MA-Gal基因的表达量很低,后随着果实的软化表达量不断增加,并在呼吸跃变后达到最高。所有结果表明,MA-Gal参与香蕉果实成熟过程中的软化。