天蓝色链霉菌胞内蓝色素提取方法研究

对天蓝色链霉菌— 10 0胞内蓝色素提取方法进行了研究 ,结果表明碱提取法、SDS法、研磨法的色素提取得率分别为 90 2 %、95 2 %和 54 6 % ;酶水解法的色素提取得率 <30 % ;细胞在pH9缓冲液中自溶 ,浓度为 1/4原发酵浓度 ,4 0℃保温搅拌 4 8h ,色素提取得率为 33 8%。     

黄精中阿维菌素残留量检测方法研究

研究了高效液相色谱法(HPLC)检测中草药黄精中阿维菌素残留量.以丙酮为提取溶剂,经酸性氧化铝柱层析净化,用紫外检测器(UVD)在245 nm处进行检测,流动相为甲醇-水(体积比为85∶15),流速为1 mL/min.结果表明:阿维菌素在质量浓度为0.01~200μg/mL范围内有良好的线性关系,该方法添加回收率为87.74%~103.47%,变异系数为1.73%~4.43%,检出限为0.01 mg/kg.符合阿维菌素残留的检测要求.     

定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子BA-ELISA方法的建立与评价

目的:建立一种定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)方法并评价其可靠性。方法:优选设计CFTR三个表位的大肠杆菌表达抗原,免疫新西兰白兔获得CFTR多克隆抗体,用纯化后的抗体包被酶标板,并用生物素对其标记,从人精子提取CFTR作为抗原,用辣根过氧化物酶偶联的亲和素检测,优化两种抗体浓度及实验参数,建立可定量检测CFTR蛋白的双抗体夹心BA-ELISA方法;用临床精子标本评估所建立方法的重复性、特异性等。结果:CFTR包被抗体和生物素化CFTR抗体最适浓度分别为4μg/ml和10μg/ml,最佳封闭液为1%BSA-PBST,抗原与包被抗体最佳反应时间60 min,底物显色最佳时间15 min。批内、批间变异系数分别为2.16%~9.23%和2.29%~11.71%,包被的CFTR抗体与精子胞浆蛋白无交叉反应,最低检出下限为0.15 ng/ml,标准反应曲线具有良好的线性关系R2=0.962。结论:成功创建了定量检测CFTR蛋白的ELISA方法,具有特异性强、灵敏度高等特点。     

降钙素原荧光免疫层析方法的建立

降钙素原(Procalcitonin,PCT)是降钙素的前体物质,与人体细菌感染情况严重程度相关。通过PCT抗体与量子点偶联,自制试纸条,开发一种高灵敏度、快速便捷的PCT检测产品,对其初步应用。PCT单抗效价达107,PCT蛋白与量子点偶联,具有较好稳定性。试纸条线性检测范围0.15–120μg/L,灵敏度0.007μg/L,回收率范围91%–113%,批内批间变异系数小于8%。自制的荧光检测试纸条与市场上已有的降钙素原ELISA试剂盒进行比对,检测结果良好,基本能够完成临床样品的检测。     

高效液相色谱法同时测定儿童血清中视黄醇、25-OH-维生素D3和α-生育酚浓度

目的:建立能同时测定儿童血清中视黄醇、25-OH-维生素D3和a-生育酚的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法.方法:以无水乙醇沉淀蛋白质后,血清中的脂溶性维生素用正己烷提取,吹氮气浓缩后用HPLC测定.结果:视黄醇、25-OH-维生素D3和a-生育酚的线性范围分别为0.015-500μg/mL、0.012-500μg/mL和0.1-500 μg/mL;检出限分别为0.015μg/mL、0.012μg/mL和0.1μg/mL;相对标准偏差分别为0.98%、2.09%和4.63%.三种脂溶性维生素各个浓度的提取回收率均大于80%,方法回收率均大于90%.结论:本法简便快速,适于血清样品中视黄醇、25-OH-维生素D3和a-生育酚三种脂溶性维生素的同时测定.     

离子对色谱法测定盐酸达克罗宁中的杂质

采用Kromasil C18色谱柱,以磷酸盐缓冲液(称取辛烷磺酸钠2.34 g及KH_2PO_4 6.8 g,加H_2O 1 L使溶解,用H_3PO_4调节pH至3.0):甲醇(体积比40∶60)为流动相,流速1.0 mL/min,检测波长282 nm,柱温25℃。杂质A、B与盐酸达克罗宁在0.05~0.5μg/m L范围内线性关系良好。杂质A、B的平均回收率分别为99.66%和105.1%,相对标准偏差(RSD)分别为2.12%和4.17%。本方法为盐酸达克罗宁杂质的检查提供了科学依据。     

东北设施黑土土壤微生物总DNA提取方法探讨

目的:找到一种适合东北设施高腐殖含量黑土土壤微生物总DNA简单易行的提取方法。方法:采用5种不同的DNA提取方法进行土壤总DNA提取。结果:5种提取方法的DNA产量在6.88～29.71μg/g,OD260/OD280值为1.03～1.27,OD260/OD230值为0.65～0.88,经纯化后均可进行PCR扩增。但经改进的方法 E提取DNA产量最高,纯度最好。结论:方法 E—加入TENP和PBS缓冲液预处理的提取方法是一种适宜东北设施黑土土壤微生物总DNA批量提取简单易行的方法。     

辣椒制品中苏丹红Ⅰ快速检测的方法研究

为建立一种辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测方法,通过直接提取法、固相萃取法和皂化法对辣椒制品中苏丹红Ⅰ进行提取净化,用胶体金免疫层析法对其进行检测,并进行方法学验证。结果显示:辣椒制品直接提取法在检测时,检测限较高,无法满足检测要求;固相萃取法适用于辣椒酱和辣椒油的快速检测,检测限为10μg/kg;皂化法适用于辣椒粉的快速检测,检测限为10μg/kg。方法学验证表明:以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉作为空白基质的检测限为10μg/kg,灵敏度均为100%,特异性为87.5%~100%,假阳性率为12.5%,假阴性率为0。该方法快速准确、灵敏度高,可适用于辣椒制品苏丹红Ⅰ的快速检测。     

胃蛋白酶原双标记时间分辨荧光免疫分析及其初步临床应用

采用钐(Sm3 )标记抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体(PG Ⅰ)及铕(Eu3 )标记抗胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体(PGⅡ),建立了双标记时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA),同时检测人血清PGⅠ和PGⅡ.将抗PG Ⅰ单克隆抗体8003#、抗PGⅡ单克隆抗体8101#以一定比例共包被于96孔微孔板上,用Sm3 标记抗PGⅠ单抗8016#、Eu3 标记抗PGⅡ单抗8102#,采用双抗体夹心法建立PGⅠ/PGⅡ的双标记TRFLA.标准曲线由TRFLA检测仪自带的Log-LogB函数处理.PGI可测范围为0.2～300μg/L,批内和批间变异系数(CV%)分别为5.2%和8.1%,平均回收率为96.9%;PGⅡ可测范围为0.05～55μg/L,批内和批间变异系数(CV%)分别为7.1%和11.7%,平均回收率为103.7%;双标记PGⅠ/PGⅡ-TRFLA与PGⅠ-ELISA法、PGⅡ-ELISA法的测定结果高度相关,具有较好的一致性,相关系数分别为0.9426和0.9396.检测300例健康人员的PGⅠ为(157.3±51.0)μg/L,PGⅡ为(10.6±5.9)μg/L,PGⅠ/pGⅡ比值为(14.8±4.3)μg/L.PGⅠ的正常参考值范围在55.3～259.3μg/L之间,PGⅡ正常参考值为<23μg/L,PGⅠPGⅡ>6.双标记PGI/PGⅡ-TRFLA方法的研究在国内外尚未见报道,是一种灵敏、简便、快速、经济并可用于大批量样品筛查的方法,有利于各种胃病的大规模普查筛选及患者病程监测.     

獐子岛及邻近海域秋季浮游植物的粒级结构及其影响因素

于2015年10月对獐子岛及邻近海域进行了航次调查,研究了獐子岛及邻近海域浮游植物粒级结构的空间分布特征及其环境影响因素。结果表明,秋季表层总叶绿素a、小型(20μm)、微型(2—20μm)和微微型(0.45—2μm)浮游植物叶绿素a浓度的范围分别为0.52—1.25、0.03—0.81、0.33—0.91、0—0.09μg/L,平均叶绿素a的浓度分别为0.76、0.19、0.53、0.03μg/L,对叶绿素a总量的贡献率分别为23.77%、72.26%和3.98%;底层总叶绿素a、小型(20μm)和微型(2—20μm)浮游植物叶绿素a浓度的范围分别为0.14—1.5、0.04—1.04、0.08—0.47μg/L,平均叶绿素a的浓度分别为0.46、0.22、0.24μg/L,对叶绿素a总量的贡献率分别为41.46%、58.50%。从垂直分布上来看,总叶绿素a浓度垂直变化为,表层底层;小型浮游植物垂直分布较为均匀;微型浮游植物垂直变化为,表层底层;微微型浮游植物垂直变化为,表层底层,且在表、底层均保持较低水平。秋季表层微型浮游植物(2—20μm)浓度与盐度呈正相关。底层总叶绿素a浓度与磷酸盐浓度呈正相关,小型浮游植物(20μm)浓度与磷酸盐和硅酸盐浓度均表现为正相关,微型浮游植物(2—20μm)浓度与温度呈正相关。统计分析结果表明,温度、盐度、磷酸盐及硅酸盐浓度是影响獐子岛及邻近海域秋季浮游植物粒级结构变动的重要因素。     

硫酸庆大霉素中RNA和DNA的检查

目的为检查硫酸庆大霉素中的RNA与DNA,方法先用凝胶柱色谱法分离出RNA与DNA,再采用改良苔黑酚法检查RNA,采用二苯胺法检查DNA。结果 RNA在1~20μg范围内,吸光度与浓度线性回归的相关系数r=0.9993,检测限和定量限分别为0.28μg和0.85μg,平均回收率为96.1%;DNA在5~200μg范围内,吸光度与浓度线性回归的相关系数r=0.9995,检测限和定量限分别为2.8μg和6.3μg,平均回收率为93.3%。结论所建立的方法专属、灵敏、准确,可用于硫酸庆大霉素中RNA和DNA的检查。     

用氨基酸分析仪测定棉花幼苗叶片中的还原型谷胱甘肽含量

以3%三氯乙酸提取棉花幼苗叶片中还原型谷胱甘肽(GSH),在2.8mm×80mm色谱柱、柱温54℃、缓冲液流速10mL·h-1、茚三酮溶液流速5mL·h-1、波长570nm的条件下,用Beckman 121 MB型氨基酸自动分析仪测定含量为40~500μmol·L-1的GSH,与色谱峰面积呈良好的线性关系,GSH回收率为99.5%~100.4%,检出限为4μmol·L-1,测定结果的相对标准偏差为0.51%~1.05%。     

检测马铃薯S、X和Y病毒的灵敏度及其改进技术

用5.3M的NaOH:乙醇(EtOH)予处理新的聚苯乙烯微皿,以酶联免疫吸附法在病毒的特异吸光率(A405)处测定马铃薯S、X及Y病毒,其平均数增加14.8%,与对照PBS—T相比,在磷酸盐缓冲液中(PBS—T)加入0.01M二乙基二硫代氨基甲酸酯钠则增加了对PVY的特异吸光率37.3%。用0.2M二乙醇胺pH10.5和6～12%亚硫酸钠对PVX进行碱性降解后,比单用PBS—T增加了特异的对PVX的吸光率约2.06%。从logA405和log汁液的稀度之间的相关回归分析得出进一步增强灵敏度的特性。由回归方程来予测病毒的稀释限点,用未稀释的被侵染汁液测定相应增加的病毒特异光吸收值。一个改进的双抗体夹心酶联免疫吸附测定法,提高检测PVS稀释终点约达30～32%,这一数值比曾在其它植物病毒上报道过的要少。血清学测定在植物病理学上的一个主要应用方面,是对马铃薯病毒的大量测定。即检疫证明和抗病育种的鉴定两个方面。酶联免疫吸附测定(ELISA)是测定病毒最灵敏有效的方法之一,它可能对某些植物病毒的检测效率达1μg/ml。本研究的目的是测定和评价改进马铃薯S、X及Y病毒的ELISA灵敏性方法的效果。这些改进方法包括,用於清洗聚苯乙烯微皿以便用作ELISA的洗剂,病毒提取缓冲液的添加剂,以及一个双抗体夹心ELISA(DASELISA)的改进方法。     

不同提取方法对豫产白花蛇舌草多糖及抗氧化活性的影响

为评价不同提取方法对河南地区白花蛇舌草粗多糖的得率、总碳水化合物含量、杂质含量和抗氧化活性的影响,本实验分别以传统热水提取法、超声波辅助提取法、纤维素酶提取法从该药材中提取多糖。同时测定了粗多糖中总碳水化合物含量、杂质含量(总蛋白和总酚含量)以及羟基自由基清除能力、DPPH自由基清能力、还原力等抗氧化能力。实验结果显示三种提取法所得粗多糖相对于原药材的得率分别为6.77±0.09%、6.37±0.01%和4.81±0.90%;粗多糖中的总碳水化合物含量分别为289.14±1.33、246.83±2.33和278.92±2.92mg/g。粗多糖中总蛋白含量分别为28.59±2.21、23.26±2.43和4.96±0.18mg/g,总酚类成分含量分别为5.9±0.08、5.31±0.40和2.82±0.07mg/g。抗氧化活性实验结果表明,三种粗多糖的羟基自由基清除能力呈现出浓度依赖性,且均在3.0mg/mL时达到最大,对应最大清除率分别为89.13%、85.87%和74.71%。另外,三种粗多糖的DPPH自由基清除率分别在0.75~3.0mg/mL的浓度区间内达到最大并保持稳定,对应清除率的稳定区间分别为77.02%~77.90%、77.06%~77.96%和83.16%~85.73%。综上所述,以上三种不同提取方法对白花蛇舌草多糖的品质影响较大,可以为豫产白花蛇舌草的品质鉴别、多糖质量控制和开发利用提供依据。     

三种黑曲霉细胞基因组DNA提取方法的比较

采用三种方法提取黑曲霉基因组DNA,比较了各方法的提取时间、DNA纯度和产量,结果表明：二次沉淀法耗时5-6h,但提取的黑曲霉细胞基因组DNA质量好,产量高达130μg／g菌丝体;其次为中性裂解法耗时1—2h,产量约13μg／g菌丝体;再次为氯化苄法耗时3—4h,产量约3μg／g菌丝体。     

两种从土壤中提取DNA方法的比较

为土壤微生物多样性研究选取理想的DNA提取方法,该文比较了直接法和间接法从土壤中提取微生物总DNA的效果。结果表明：直接法提取量大,每克土壤提取到DNA约10．26μg,而间接法仅提取到0．55μg,直接法DNA提取量约为间接法的19倍。直接法得到的DNA包含细菌种群较间接法丰富,DGGE分析结果显示,二者的条带数分别为35条和28条,占检测条带总数的92．1%和78．9%。间接法提取到DNA纯度较直接法高,不需纯化即可用于PCR扩增和BamHⅠ酶切反应。     

UV和HPLC法测定黄芩黄酮总苷元提取物中总黄酮和3种主要成分的含量

本文建立了黄芩黄酮总苷元提取物中总黄酮和3种主要成分的含量测定方法。采用HPLC法测定黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A的含量。使用Agilent 1200型高效液相色谱仪,Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-0.2%磷酸水(50∶50),流速1 m L/min,柱温35℃,检测波长275 nm的方法。黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A线性范围分别为3.501~70.016μg/m L(r=0.9999),0.832~16.640μg/m L(r=0.9998),0.418~8.352μg/m L(r=0.9999);平均加样回收率(n=6)分别为99.55%、98.86%、9.997%,RSD分别为1.74%、1.74%、1.70%。采用UV法测定总黄酮含量,黄芩素线性范围为1.71~8.54μg/m L(r=0.9991);平均加样回收率(n=6)为100.93%,RSD为2.63%。黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A和总黄酮的含量分别为48.22%~60.36%、12.09%~14.46%、5.05%~8.81%、78.11%~90.12%;研究结果表明该方法准确、可靠,适用于黄芩黄酮总苷元提取物的含量测定。     

高粱基因组DNA提取方法的比较与优化

目的：比较CTAB法和高盐低pH法提取高粱总DNA效果,进一步优化建立高盐低pH值法提取高粱基因组DNA的方法。方法：采用CTAB法、高盐低pH法对高粱叶片DNA进行提取,并从电泳结果、纯度、得率三方面进行比较研究。通过提取缓冲液中SDS浓度的优化,不同组织器官的DNA提取纯化以及不同沉淀方法的优化,比较不同方法对高粱基因组DNA提取的影响。结果：高盐低pH法DNA平均得率为689.36μg/g,略小于CTAB法的718.26μg/g,但其A260/A230平均值为1.854,比CTAB法的2.164更接近标准要求。高盐低pH法提取高粱基因组DNA的适宜条件确定如下：提取液中含有2%SDS、2%PVP、2%β-巯基乙醇;水浴时间30min;沉淀方法采用0.7体积异丙醇室温沉淀的沉淀方法。结论：综合考虑高盐低pH法是提取高粱基因组DNA的最佳方法。     

热休克蛋白表位肽免疫对动脉粥样硬化斑块的影响

利用HSP65(heat shock protein 65,HSP65)中与炎症性自身免疫性疾病相关的两段功能表位EE14(176-189)、DL18(215-232),通过戊二醛偶联法与BSA(bovine serum albumin,BSA)制备成多肽-BSA偶联蛋白,获得可用于免疫高脂膳食动物的蛋白。与PBS(phosphate buffer saline,PBS)组比较,多肽免疫组抗HSP65抗体滴度与总胆固醇(total cholesterol,TC)含量无明显区别(P0.05),抗自身肽的抗体在两免疫组的结果不同,但两组主动脉粥样硬化斑块的面积都显著增加,两免疫组斑块面积与血管总面积百分比分别为39.61%与36.75%,为PBS组(斑块面积占血管总面积百分比为10.35%)的3.8倍和3.6倍,有显著性差异(P0.05)。实验结果表明HSP65相关B细胞表位肽,皮下免疫能显著促进AS(atherosclerosis,AS)斑块生成。在后续研究中可利用以上表位,通过改变免疫方式,设计可用于抑制AS斑块生成的免疫调节剂,进一步考察HSP65功能性B细胞表位的免疫预防及治疗效果。     

抗EGFRvⅢ单链抗体间接ELISA方法的建立及条件优化

[目的]以合成抗原EGFRvⅢ-BSA作为被检测物,建立检测抗EGFRvⅢ单链抗体的间接ELISA检测方法并优化其反应条件。[方法]利用N-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)将EGFRvⅢ与BSA偶联制备抗原。利用方阵滴定法对间接ELISA法的抗原包被浓度,单链抗体的稀释度、包被时间和温度、包被液、抗His-tag多抗稀释度和酶标抗体的稀释度进行优化,并对建立的间接ELISA方法的方法学进行验证。[结果]通过SDS-PAGE电泳和全波长紫外扫面显示EGFRvⅢ-BSA合成成功。用PBS于37℃包被1.25μg/m L的EGFRvⅢ-BSA 2 h,加入19.044μg/L的ChiMR1、1∶8 000的兔抗His-tag多抗和1∶10 000酶标抗体可获得最佳ELISA检测结果。应用优化后的条件检测4.761~152.35μg/L范围内的ChiMR1显示线性良好。线性方程为y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A:1.99706;B:-1.09760;C:35.54885;D:0.01558),R2=0.99923;60μg/L和20μg/L的质控品的检测精密度分别为7.142%和4.828%;准确度分别为91.8%和82.90%,准确度和精密度良好。[结论]建立的间接ELISA方法的线性、准确度和精密度良好,为临床疾病的检测奠定良好基础。