Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体p Cas-g RNA和同源重组供体DNA载体p Back Zero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成c DNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:g RNA表达质粒p Cas-g RNA和DNA供体质粒p Back Zero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。q RT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。     

利用CRISPR/Cas9技术构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株及其功能鉴定

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人肝癌细胞HepG2中的四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)基因,构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别FHL1基因第三外显子相关序列的上下游小向导RNA,构建真核重组表达质粒,测序鉴定后,将重组质粒包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素抗性筛选稳定敲除FHL1基因的细胞株,用免疫印迹法鉴定HepG2细胞中FHL1基因的敲除效果,利用生长曲线实验和划痕实验检测基因敲除对细胞生长和迁移的影响。结果:筛选出敲除FHL1基因的HepG2细胞株,且FHL1基因敲除显著促进细胞的增殖和迁移。结论:利用CRISPR/Cas9技术获得了内源FHL1基因敲除细胞株,初步实验提示敲除FHL1基因可以促进肝癌细胞增殖和迁移,为后续研究FHL1在肝癌中的功能奠定了基础。     

沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株的建立及其生物学特性的研究

B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertionsite 1,Bmi-1)基因是多梳基因家族成员,参与细胞增殖调控.研究发现Bmi-1基因可能参与肿瘤的形成,可能成为肿瘤潜在的治疗靶点.用RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默Bmi-1基因表达观察其对乳腺癌细胞株MCF-7侵袭和转移等生物学特性的影响,以探讨Bmi-1在乳腺癌发生发展中的作用.PT67细胞包装质粒后产生的逆转录病毒感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株,稳定抑制Bmi-1的细胞株命名为MCF-7/Bmi-1si.通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1的表达量;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭和转移能力.MCF-7/Bmi-1si组与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,Bmi-1 mRNA和蛋白表达量明显减少,克隆形成数及形成率也明显减少(P<0.05).侵袭和转移实验表明:与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,MCF-7/Bmi-1si组细胞在Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数明显减少(P<0.05).结果表明沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株构建成功,Bmi-1基因表达的沉默能显著降低MCF-7细胞的体外增殖及侵袭转移能力.     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白Esp F与宿主膜联蛋白A6 (ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA (single guide RNA,sgRNA),基于Lenti CRISPRv2载体构建Lenti CRISPRv2-sg RNA重组质粒,转入293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8 (cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力...     

稳定表达人SidT2基因细胞系的建立及其dsRNA转运功能的研究

目的:构建稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,探讨SidT2基因过表达与细胞转运双链RNA(dsRNA)能力的关系。方法:根据人SidT2基因序列设计引物,克隆其编码区序列,经双酶切后与pEGFP-N3载体连接,构建其真核表达载体,分别瞬时转染BHK及MDCK细胞,并使用G418筛选稳定表达细胞系;在此基础上,体外转录合成绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA,以GFP基因为报告基因,进一步分析过表达人SidT2基因对BHK及MDCK细胞转运dsRNA能力的影响。结果:经基因克隆、酶切、连接后,构建了人SidT2基因真核表达载体pEGFP-SidT2;经瞬时转染及G418筛选,获得稳定过表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,实时荧光定量RT-PCR分析表明,其SidT2基因转录水平分别提高71、64.5倍;稳定表达SidT2基因后,在培养液中添加GFP dsRNA,GFP荧光强度较对照细胞分别降低88.1%、73.7%,表明稳定表达SidT2基因的BHK、MDCK细胞转运dsRNA的能力显著增强。结论:构建了稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,SidT2基因过表达可显著提高外源性dsRNA的转运能力。     

HepG2/mdrl稳定细胞系的建立及特性研究

将已构建好的含有人多药耐药(muhidrug resistance,MDR)全长基因的真核表达质粒pCI-neo-mdrl,应用脂质体导入人肝癌HepG2细胞,应用C418筛选出人肝癌多药耐药细胞株HepG2/mdrl.通过对HepG2/mdrl细胞形态学的观察和生物学特性的研究,成功地建立了高效、稳定的HepG2/mdrl细胞系;为深入研究肝癌的MDR及其逆转提供了理想的细胞模型,并为探索建立肝癌MDR细胞株提供新的方法和思路,同时为研究肝癌细胞胰岛素抵抗与MDR的关系提供了模型细胞.     

猪链球菌2型菌毛骨架蛋白编码基因SSU2101敲除突变株的构建及其生物学功能

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)中国强毒株05ZYH33菌毛骨架蛋白(Backbone protein,BP)编码基因SSU2101敲除突变株。采用引物特异性PCR分析、Southern杂交及RT-PCR等方法鉴定,证实成功构建了BP基因缺失突变株。生物学特性显示,突变株的菌落形态、溶血活性以及染色特性方面与野生株之间均无明显差异。小鼠致病性试验结果显示,突变株的毒力比野生株显著减弱。研究结果提示菌毛在S.suis2感染致病过程中起重要作用,为系统研究S.suis2菌毛分子装配机制及其生物学功能奠定了基础。     

白色念珠菌CRK1基因的敲除及其功能研究

在筛选白色念珠菌促分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）相关蛋白激酶基因的过程中,得到了ＣＲＫ１（ＣＤＣ２－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １）基因。利用同源重组原理,敲除了ＣＲＫ１双拷贝基因片段,构建了ＣＲＫ１纯合缺失株,发现ＣＲＫ１基因的缺失影响到白色念珠菌的生长速度,絮凝生长和形态发生。     

利用慢病毒载体建立fractalkine基因敲低的HK-2稳定细胞株

目的利用慢病毒载体建立fractalkine(FKN)基因敲低的HK-2稳定细胞株,为探讨FKN基因在肾脏组织肾小管上皮细胞转分化(EMT)重构中的作用奠定实验基础。方法通过双酶切将FKN目的基因连接到GV248载体(hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin),经扩增、转化、验证、测序、质粒抽提,将携带目的基因的工具GV248载体质粒及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0转染293T细胞,完成慢病毒包装及质量检测后获取慢病毒工具载体LV-FKN-RNAi,病毒感染HK-2细胞72h后筛选稳定表达的细胞株HK-2/LV-FKN-RNAi,采用Western blot测定FKN的表达水平,CCK-8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果经对比,构建LV-FKN-RNAi阳性克隆序列与目的基因FKN相符;HK-2细胞达到80%感染效率的最佳感染条件为:在Enhanced Infection Solution(ENi.S)培养基中进行感染,设定感染复数(MOI)为10,感染时间为72h。Western Blot结果显示,经筛选的HK-2/LV-FKN-RNAi细胞中FKN基因表达水平降低;细胞形态成梭形,多有伪足出现。CCK-8检测显示,FKN基因敲低组细胞活力降低;流式细胞术检测显示,FKN基因敲低组细胞凋亡率增加。结论本研究成功构建一种低表达FKN基因的慢病毒载体;LV-FKN-RNAi感染HK-2细胞后可实现目的基因的低表达,并且FKN基因敲低后HK-2细胞活力下降,凋亡率增加。经筛选的HK-2/LV-FKN-RNAi细胞株可用于后续实验研究。     

利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除稳定细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除的细胞株,研究α-ENaC基因对细胞增殖的影响。构建敲除α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,通过转染和嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株,Western Blot、测序确定突变的细胞株,CCK-8检测突变细胞株的增殖活力。成功构建靶向α-ENaC基因第一外显子的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,嘌呤霉素筛选后,挑选8个单细胞克隆中有两个单细胞克隆α-ENaC蛋白表达下降,一个单细胞克隆α-ENaC蛋白不再表达,测序结果显示3个单细胞克隆分别为2个单等位基因突变和1个双等位基因突变,且未发现脱靶现象。突变细胞株的增殖活力降低,其中双等位基因突变细胞株增殖活力降低更为显著。因此,利用CRISPR/Cas9结合SSA-RPG报告载体成功获得了α-ENaC基因敲除的L2细胞株,α-ENaC与细胞增殖有关。     

HepG2/mdr1稳定细胞系的建立及特性研究

将已构建好的含有人多药耐药（multidrug resistance, MDR）全长基因的真核表达质粒pCI-neo-mdr1,应用脂质体导入人肝癌HepG2细胞,应用G418筛选出人肝癌多药耐药细胞株HepG2/mdr1。通过对HepG2/mdr1细胞形态学的观察和生物学特性的研究,成功地建立了高效、稳定的HepG2/mdr1细胞系;为深入研究肝癌的MDR及其逆转提供了理想的细胞模型,并为探索建立肝癌MDR细胞株提供新的方法和思路,同时为研究肝癌细胞胰岛素抵抗与MDR的关系提供了模型细胞。 将已构建好的含有人多药耐药（multidrug resistance, MDR）全长基因的真核表达质粒pCI-neo-mdr1,应用脂质体导入人肝癌HepG2细胞,应用G418筛选出人肝癌多药耐药细胞株HepG2/mdr1。通过对HepG2/mdr1细胞形态学的观察和生物学特性的研究,成功地建立了高效、稳定的HepG2/mdr1细胞系;为深入研究肝癌的MDR及其逆转提供了理想的细胞模型,并为探索建立肝癌MDR细胞株提供新的方法和思路,同时为研究肝癌细胞胰岛素抵抗与MDR的关系提供了模型细胞。     

条件性基因敲除:骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定

Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响。根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小鼠,繁殖建立了骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因的小鼠,并提供了用鼠尾做基因型鉴定的简便方法。     

稳定的RNA发夹结构及其生物学功能

以UNCG、GNRA、CUUG(N=A、U、C或G,R=G或A)为端环能够形成稳定的、保守的发夹结构。高分辨率的溶液结构、晶体结构和计算机模拟等方法从原子水平上解析了这些发夹特殊的结构特征。在体内,它们发挥着重要的生物学功能:在折叠过程中作为折叠的起始位置帮助组织RNA分子正确折叠;与核酸受体结合参与三级相互作用;与蛋白质发生相互作用;阻止逆转录酶的延伸等等。另外,由于C(UUCG)G发夹极其稳定的特征,在体外RNA分子的实验测定中它还是稳定核酸结构的理想工具。这些稳定的发夹广泛分布于体内rRNA、催化RNA和非编码mRNA中。但在对人类编码区mRNA结构特征的研究当中,却未发现C(UUCG)G发夹。     

NPAS2基因敲除的HepG2细胞系构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建生物节律基因NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系,并初步探讨NPAS2基因敲除对肝癌细胞凋亡的影响。方法:利用sgRNA在线设计工具,针对NPAS2设计两条sgRNA;利用PX459质粒构建分别含有两条sgRNA的敲除载体PX459-sgRNA1;PX459-sgRNA2;利用T7核酸内切酶I检测两条sgRNA活性;将活性较高的打靶载体瞬时转染HepG2细胞,经过药物筛选,克隆化培养及基因测序后得到NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系;利用Western blot检测NPAS2蛋白的表达和凋亡相关蛋白Caspase3的活化;利用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平。结果:成功构建了针对NPAS2的打靶载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体;经过药物筛选和克隆化培养得到的NPAS2敲除肝癌细胞系未检测到NPAS2蛋白的表达;进一步发现NPAS2敲除的肝癌细胞Caspase3明显活化,凋亡水平显著升高。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了NPAS2基因敲除的HepG2肝癌细胞系,并发现NPAS2敲除可以促进肝癌细胞凋亡,为进一步研究生物节律基因NPAS2及其它相关基因在肝癌发生发展中的作用机制提供了有力的工具。     

2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33 sao基因敲除突变株的构建及其生物学功能

构建2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)中国强毒株05ZYH33的sao基因敲除突变株。构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为sao编码基因上下游同源序列的基因敲除载体,同源重组筛选sao基因敲除突变株。PCR、RT-PCR、Western Blot对疑似突变株进行验证,实验结果均证实sao基因完全被spc抗性基因替代,成功构建了突变株05ZYH33-sao。对野生型菌株和突变株进行菌落溶血活性、生长特性、小鼠致病性比较,结果表明sao基因的敲除并未使野生型菌株在以上三方面产生明显的变化。筛选获得的05ZYH33 sao基因突变株为进一步研究sao基因在05ZYH33致病过程中的作用奠定了基础。     

运用改良的CRISPR/Cas9系统建立HtrA2敲除细胞株

能识别特定基因组DNA序列的核酸酶是基因编辑的重要工具。在单链RNA引导下,来源于一种产脓链球菌的成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)关联蛋白(CRISPR-associated protein 9,Cas9)能够发挥其核酸酶功能对基因组特定序列进行剪切。这种功能依赖于单链引导RNA(single-guide RNAs,sg RNAs或g RNAs)中20 nt的核心靶向序列。在该研究中,作者对已有的CRISPR/Cas9系统载体进行了优化,简化了g RNA表达载体的构建。运用优化后的CRISPR/Cas9系统,我们敲除了HEK293T细胞中HtrA2基因的第一个外显子。这一改进大幅度降低了CRISPR/Cas9技术的使用成本。     

高致病性2型猪链球菌plcR基因敲除株的构建及其相关生物学特性的研究

【目的】构建高致病性2型猪链球菌05ZYH33菌株plcR基因敲除株,通过比较突变株与野生株生物学特性的差异,研究plcR基因在2型猪链球菌致病过程中的作用。【方法】利用同源重组技术敲除plcR基因,多重交叉PCR及RT-PCR鉴定并测序验证。比较野生株与突变株基本生物学特性的差异,小鼠攻毒实验分析plcR基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】经RT-PCR证实05SSU0241与05SSU0242共转录,通过多重交叉PCR及RT-PCR证实成功构建plcR基因缺失突变株,基本生物学特性显示突变株的生长速率、菌落形态、溶血活性均无显著改变,小鼠致病性试验结果显示,野生株攻毒的小鼠死亡率为70%,突变株攻毒的小鼠死亡率为40%,毒力较野生株显著降低。【结论】plcR基因作为2型猪链球菌有毒株基因组中特有的外源基因,在细菌致病过程中具有重要作用。     

人肝癌细胞株H9101的建立及其细胞生物学特性研究

从厦门市肝癌高发的同安地区肝癌病人肝癌组织建立了人原发性肝细胞癌细胞系H9101.它生长迅速,群体倍增时间平均为38小时,对小牛血清的依赖性较低(1%).体外培养的H9101细胞贴壁生长,扫描和透射电镜下见细胞有丰富细长微绒毛.H9101细胞具有较高的软琼脂克隆形成率(1/200细胞)和裸鼠异种移植成瘤能力(100%).瘤细胞在ConA处理后呈较强的凝集性,在ConA 50ug/ml和100μg/ml时细胞凝集率分别为61%和92%.瘤细胞分泌微量的AFP,用1%DMSO和1.5×10-5mol/L地塞米松处理10天后上升到(140ng/ml/1×105细胞/24小时),且HBsAg转呈阳性.H9101细胞γ-谷氨酰转肽酶活性达5.42U±0.11U/mg,酪氨酸α酮戊二酸转肽酶活性达14.24U±1.50U/mg,与正常人肝细胞者相比差异显著(分别为P＜0.001和P＜0.01).H9101细胞染色体数为非整倍体,众数分布在52条-82条,具人类细胞染色体特征,其DNA经PCR扩增显示HBV DNA特异性条带.H9101细胞具端粒酶活性,是细胞连续传代和建系的保证;它恶性程度高、整合HBVDNA和具人肝细胞癌生物学基本特征,可为肝癌分子生物学研究提供有价值的实验材料.     

高转移潜力食管癌细胞株的建立及其生物学特征

目的建立具有高转移潜力食管癌细胞株并研究其生物学特征。方法将食管癌细胞系EC109细胞悬液异位移植到SCID小鼠胃壁,约3个月后或动物濒临死亡时处死,行病理学解剖,将肉眼可见的纵隔淋巴结转移瘤块接种于SCID鼠皮下扩增,然后取小鼠皮下瘤组织块进行细胞培养,得到性状稳定的细胞株NMC109后,用MTT法分析细胞生长曲线,Western bloting法检测与细胞分裂增殖能力密切相关的TopoⅡα表达,酶谱法检测MMP-2和MMP-9的活性,划痕实验和Transwell体外移动实验检测细胞的移动能力。结果与母本细胞EC109相比,所获得的细胞株NMC109其增殖能力和TopoⅡα表达明显增强,MMP-9的活性明显升高,移动能力明显增强。结论获得了具有高转移潜力的食管癌细胞株。