极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis胞外硫活化蛋白质基因的筛选及鉴定

以极端嗜酸热古菌(Acidianus manzaensis)为研究对象,基于比较蛋白质组学的研究方法筛选和鉴定了13个A.manzaensis胞外与硫活化相关的蛋白质基因,并从转录水平对其进行了验证。首先通过80℃缓慢摇动水浴30 min分别对A.manzaensis在单质硫(S0)和亚铁(Fe2+)为能源底物进行生长时的胞外蛋白质进行提取,并用双向电泳(2-DE)进行分离,然后选取在S0底物下差异表达的蛋白质斑点进行串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定和生物信息学分析及功能预测,最后用实时定量PCR(RT-q PCR)对筛选得到的胞外S0活化相关蛋白基因进行转录水平的验证;最终获得了13个极端嗜酸热古菌A.manzaensis胞外活化S0相关的蛋白质基因。筛选得到的蛋白质中一半以上含有较多的半胱氨酸残基(Cys),说明胞外富含巯基(-SH)的蛋白参与了S0活化;其中谷氧还蛋白(glutaredoxin)和FAD键合氧化酶均含有-CXXC-结构域,且两种蛋白质的基因表达量较高,说明含有-CXXC-结构域的蛋白质在极端嗜酸热古菌A.manzaensis活化S0的过程中起重要的作用。     

万座嗜酸两面菌硫代谢相关膜蛋白基因的筛选

活性巯基在浸矿微生物硫代谢的过程中起着重要的作用,半胱氨酸残基作为蛋白质中活性巯基的提供者,为筛选硫代谢相关蛋白质基因提供了依据。本研究以极端嗜酸热古菌万座嗜酸两面菌Acidianus manzaensis为研究对象,基于其全基因组注释信息,筛选出编码富半胱氨酸残基的潜在硫代谢相关膜蛋白基因,并通过RT-qPCR实验对筛选出来的基因进行表达水平验证,同时利用生物信息学方法对其进一步分析。研究表明,与在亚铁中生长的细胞相比,单质硫培养下的细菌中与能量代谢相关的β-葡糖苷酶,与电子传递相关的ATP合成酶、NADH-辅酶Q氧化还原酶基因均表达上调,说明硫代谢途径可能与能量代谢和电子传递有着重要的联系。此外,还有三个假定蛋白基因表达上调,这三个假定膜蛋白中,ARM75161.1、ARM75436.1中的半胱氨酸都位于保守区域,且均有一个半胱氨酸残基暴露于膜外,而ARM75580.1中的半光氨酸不位于保守区域。其中ARM75436.1具有CXXXC结构域,且该结构域中半胱氨酸残基处于同一个β-折叠中。这些假定蛋白可能参与A. manzaensis中硫代谢途径。     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞色素C家族afe_0378基因转录表达差异及生物信息学挖掘

嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种极为重要的浸矿微生物,具有氧化各种还原性含硫物及亚铁等功能。采用实时荧光定量PCR技术及生物信息学等手段对该菌一个涉及铁硫氧化由afe_0378基因编码的细胞色素C家族蛋白CycA2进行了研究。结果表明,afe_0378基因在单质硫培养条件下转录水平是亚铁培养条件下的2.67倍。生物信息学分析表明afe_0378编码蛋白CycA2是分子质量为22.959 ku,pI为9.75的结合内膜的周质蛋白,二级结构为全α-螺旋,无β-折叠,包含2个相似结构域及N端一段跨膜疏水螺旋,属于细胞色素C4型蛋白家族。CycA2蛋白分子三维结构模建表明,双血红素与CycA2蛋白序列片段域C48-X-X-C51-H52及C149-X-X-C152-H153中的半胱氨酸共价连接。结合该菌硫代谢背景知识,推测CycA2蛋白的功能是介导细胞色素bc1复合体及终端氧化酶细胞色素aa3复合体之间的电子传递而参与硫代谢。     

硫氧化细菌源单质硫的生成、转运和回收

单质硫(硫粒)是硫化物生物氧化的中间产物.按化学计量式精准调控O/S比(溶解氧与硫化物的摩尔比),单质硫可成为硫氧化细菌(Sulfur-oxidizing bacteria,SOB)的主要代谢产物.根据单质硫的分布,单质硫可分为胞内硫粒和胞外硫粒.单质硫由胞内向胞外的跨膜转运过程是泌硫型SOB的重要生理特征.从生物脱硫...     

极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis膜蛋白提取方法的建立及应用

以万座嗜酸两面菌(Acidianus manzaensis)为研究对象,探索并优化其膜蛋白提取方法,以优化后的方法提取该菌分别以单质硫(S0)和亚铁(Fe2+)为能源底物进行生长时的膜蛋白质,并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)研究膜蛋白在两种能源底物培养下的表达差异。首先通过80℃水浴60-70 min对A.manzaensis胞外黏附蛋白进行初步分离。其次比较了不同提取剂(Triton X-110,SDS和Triton X-114)对膜蛋白的提取效果,结果表明Triton X-114的提取效果较好,其最佳浓度为10%(w/v);比较了不同沉淀剂(三氯乙酸(TCA),丙酮,三氯乙酸/丙酮,甲醇和乙醇)对膜蛋白质沉淀的效果,结果表明TCA/丙酮的沉淀效果最不理想,会导致沉淀后低分子量蛋白发生缺失,而其他几种没有明显差别,综合比较选择较常用的丙酮作为膜蛋白提取的沉淀剂。最后基于优化后膜蛋白提取方法,分别对S0和Fe2+培养的A.manzaensis膜蛋白质进行提取及SDS-PAGE,结果发现分子量为35.6 k D和16.9 k D的蛋白只在A.manzaensis以S0生长时出现,表明这些蛋白质很可能在A.manzaensis硫氧化中发挥了重要作用;分子量为72 k D和26 k D的蛋白质在A.manzaensis以Fe2+生长时比其以S0生长时显著表达上调,表明此蛋白可能与A.manzaensis铁氧化相关。     

氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化系统的研究进展

氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)为无机化能自养菌,革兰氏阴性,能在极端酸性环境中生长.由于在生物冶金中的应用及特殊的生理学效应,该菌受到研究者的广泛关注.A.ferrooxidans能氧化亚铁、元素硫及还原态硫化物获得电子,并通过一系列电子载体将电子传递给氧生成水,同时释放能量供生命活动需要.目前对A.ferrooxidans电子传递系统的研究主要集中于亚铁氧化电子传递系统,已发现多种与亚铁氧化电子传递相关电子载体和操纵子,如电子载体铜蓝蛋白(Rustocyanin,Rus)、细胞色素C(Cytochrome C,Cyc)、细胞色素C氧化酶(Cytochrome Coxidase,Cox)、亚铁氧化酶(Iro)、细胞色素bc1复合物(cytochrome bc1 complex,bc1)等,以及rus操纵子和pet操纵子.综述了近年来有关A.ferrooxidans 亚铁氧化电子传递链相关蛋白载体,rus和pet操纵子结构与功能及表达调控等方面的研究进展.     

海底热液环境中嗜中性微需氧铁氧化菌的多样性、生物矿化作用及其代谢特征

铁元素是深海热液活动产物的主要成分之一,也是热液喷口处化能自养微生物生态系统的重要驱动元素。以Zetaproteobacteria为典型代表的嗜中性微需氧铁氧化菌是海底喷口及其周围环境中生物介导的Fe²⁺氧化这一生物矿化作用的主要驱动者。这些铁氧化菌通过氧化Fe²⁺获取维持自身代谢所必需的能量,同时分泌有机质将氧化后的不溶铁（氧化物或氢氧化物）沉淀于细胞外,形成具有螺旋丝带状、中空长杆状、分叉管状以及其他具有特殊形貌特征的显微结构体,进而堆积成广泛分布于海底的富铁氧化物/氢氧化物。越来越多的研究表明,编码细胞色素孔蛋白的cyc2基因是Zetaproteobacteria铁氧化菌进行Fe²⁺氧化的关键基因,而细胞色素c或其他周质细胞色素则是Fe²⁺氧化过程中的关键电子传递载体。基于宏基因组分析的系列研究揭示了Zetaproteobacteria普遍具有多种与氮、硫、氢以及砷元素循环密切相关的功能基因与代谢途径,暗示了其在上述元素循环过程中的潜在作用。本文系统地总结了海底热液喷口及其周围环境中发现的嗜中...     

醌蛋白研究进展

醌蛋白又称醌酶,是一类以吡咯喹啉醌(PQQ)或其结构类似物(TTQ、TPQ或LTQ)为辅助因子的氧化还原酶。以PQQ为辅酶的醌蛋白是其中最重要的一类醌蛋白。按其在氧化还原反应过程中包含辅酶的种类和数量可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等3种型别。Ⅰ型醌蛋白是一类简单的醌蛋白,只含有1分子的PQQ作为辅酶;而Ⅱ型和Ⅲ型醌蛋白含有PQQ和血红素c作为辅酶。Ⅱ型醌蛋白包含1分子PQQ和1分子血红素c,广泛存在于假单胞菌属、丛毛单胞菌属细菌的胞外周质中,参与催化反应过程。Ⅲ型醌蛋白仅存在于醋酸菌属细菌的细胞膜上,由3个亚基组成,即含有1个PQQ/血红素的催化亚单位、1个含有3个血红素c的亚单位和1个不含辅酶的功能未知的亚单位。综述了几种主要醌蛋白的结构、催化机制、电子传递,以及它们的应用情况。     

嗜热古菌异化型硫氧化途径的研究进展

微生物参与的还原性无机硫化合物的氧化过程是硫地球化学循环的重要组成部分,也可应用于生物冶金工业及酸性矿水治理等方面。嗜热古菌是高温环境中存在的一群特殊的微生物,其所参与的异化型硫氧化途径复杂多样,涉及众多氧化还原酶以及硫转运蛋白。本文将结合我们的研究工作,就参与异化型硫氧化代谢过程的嗜热古菌的种类,以及它们所参与的硫氧化过程进行系统的介绍。     

极端嗜盐古菌蛋白类抗生素——嗜盐菌素

古菌 (Ａｒｃｈａｅａ)是一类与细菌及真核生物显著不同的生命的第三种形式[1] ,大多生活在极端或特殊环境 ,主要包括产甲烷古菌 (ＭｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃＡｃｈａｅａ)、极端嗜盐古菌 (ＥｘｔｒｅｍｅｌｙＨａｌｏｐｈｉｌｉｃＡｒｃｈａｅａ)和极端嗜热古菌 (ＥｘｔｒｅｍｅｌｙＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃＡｒｃｈａｅａ)等三大类。极端古菌是极端环境微生物的重要成员 ,也是极端环境微生物资源开发的重要领域。其中 ,嗜盐古菌可产生一类蛋白类抗生素 ,称为嗜盐菌素 (ｈａｌｏｃｉｎ)。与细菌素相似[2 ] ,嗜盐菌素是由质粒编码、核糖体合…     

盐单胞菌DSM 16354T中新型耐盐基因的克隆及解析*

目的: 嗜盐菌分布广泛且适应能力极强,为加强对嗜盐菌耐盐机制的探索与研究,从盐单胞菌Halomonas alkaliphila DSM 16354^T中筛选出潜在的与耐盐有关的基因,对其进行生物信息学分析,并验证相关蛋白的生理功能。方法: 利用基因文库筛选和功能互补相结合的方法,通过与大肠杆菌(Escherichia coli)盐敏感缺陷株KNabc(ΔnhaA、ΔnhaB、ΔchaA)的耐盐功能互补实验,筛选出具有耐盐功能的蛋白编码基因,并通过荧光猝灭恢复实验测定蛋白的逆向转运活性以及底物亲和力。结果: 筛选得到两个具有耐盐功能的蛋白编码基因,生物信息学分析结果表明该基因编码来自于DUF1538(domain of unknown function with No.1538 family)家族功能未知的膜蛋白,分别命名为duf1和duf2。系统发育树分析结果表明,来自盐单胞菌DSM 16354^T中的DUF1、DUF2属于一个独立的分支,预测这两个蛋白可能是DUF1538家族转运蛋白的新成员。对DUF1和DUF2的生理功能进行分析,发现duf1和duf2单独表达时均不具有耐盐碱能力,而共同表达时则表现出显著的耐盐碱功能,表明DUF1和DUF2两个亚基共同支持了蛋白的耐盐碱功能。蛋白的逆向转运测定活性结果表明双组份蛋白DUF1-2具有Na⁺(Li⁺、K⁺)/H⁺逆向转运活性。结论: 筛选得到的基因duf1和duf2共同表达时具有盐碱耐受功能以及逆向转运蛋白活性,这为筛选出新的DUF1538家族转运蛋白基因和进一步探究DUF1538家族转运蛋白功能奠定了基础。     

褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基全长cDNA序列的克隆及分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基(NQO)基因的全长cDNA片段,并进行了核苷酸序列测定.结果表明,该cDNA片段长度为1930 bp,所编码的蛋白与家牛、小家鼠、食蟹猴、人和蟾蜍的NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基的氨基酸序列的同源性分别达到77%、76%、76%、75%和75%.Southern杂交分析表明,NQO基因在褐飞虱基因纽中以单拷贝形式存在.     

嗜盐菌素HalC8基因簇克隆与分析

采用基因组部分文库及锚定PCR技术,克隆了嗜盐菌素HalC8编码基因及其上下游可能的相关基因共约9.3kb的DNA序列。序列分析表明已知序列至少含有6个ORF,包括上游编码跨膜蛋白的halU基因、编码可能的调节蛋白的halR基因,编码嗜盐菌素HalC8及其免疫蛋白HalⅠ的proC8基因、以及位于proC8基因下游的编码可能的转运蛋白的halT1,halT2和halT3基因。这是国际上首次对嗜盐菌素基因簇可能的相关基因的克隆。     

喜盐芽孢杆菌D8基因文库的构建及甘氨酸甜菜碱转运蛋白betH基因的筛选

喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)D8是一株产生芽孢的革兰氏阳性中度嗜盐菌,能够耐受2 5 %NaCl。以其总DNASau3AI部分酶切的片段为供体、pUC18为载体,构建了该菌株的基因文库,共获得约90 0 0个重组质粒。通过菌落原位杂交、菌落PCR检测及DNA序列测定,从该文库中筛选到含有完整的甘氨酸甜菜碱次级转运系统基因的重组质粒,将此基因命名为betH基因。序列分析发现,betH基因的大小为15 15bp ,编码由5 0 5个氨基酸组成的BetH蛋白,分子量为5 6 1kD。经蛋白疏水性分析,推测为含有12个跨膜区的跨膜蛋白,与Oceanobacillusiheyensis甘氨酸甜菜碱转运蛋白、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)OpuD、楚氏喜盐芽孢杆菌(Halobacillustrueperi)BetH、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)BetL、嗜盐海球菌(Marinococcushalophilus)BetM和耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)甘氨酸甜菜碱转运蛋白的氨基酸同源性分别为6 4 %、5 1%、4 9%、4 8%、4 3%和4 4 %。     

苯并噻唑醌类化合物对呼吸链酶系的抑制作用

合成了2-氯-5-正十二硫烷基-6-甲基-4,7-苯并噻唑醌(2-Cl-DMMDBT)和2-氯-5-正丁烷氨基-6-甲基-4,7-苯并噻唑醌(2-Cl-BAMDBT)两种化合物,研究了它们对线粒体呼吸链酶系的抑制作用.结果表明:2-Cl-DMMDBT和2-C1-BAMDBT对琥珀酸氧化酶及泛醌氧化酶的电子传递活性均表现一定的抑制作用,而对细胞色素氧化酶无作用,说明二者的抑制作用发生在泛醌反应区.二者对NADH氧化酶的抑制行为略有不同,2-Cl-DMMDBT是一个逐渐加强的过程,最终可致酶活性完全抑制,而2-Cl-BAMDBT则表现为瞬间抑制.比较了2-Cl-DMMDBT和2-Cl-BAMDBT对琥珀酸氧化酶的抑制能力,长侧链的2-Cl-DMMDBT比短侧链的2-Cl-BAMDBT抑制能力强很多.     

吡咯喹啉醌研究进展

吡咯喹啉醌（PQQ）是继烟酰胺和黄素核苷酸之后发现的氧化还原酶的第3种辅酶,具有多种生理功能,在食品、医药及农业等行业有广泛的应用前景。我们简要综述了PQQ参与醌酶电子传递、增强微生物对极端环境的适应能力、促进植物生长、刺激神经生长因子生成等生物学功能及相关作用机制,介绍了PQQ生产菌、PQQ合成基因及PQQ生物合成的调控等方面的研究进展。     

一株嗜酸硫杆菌M4-422-6的分离及其全基因组测序和比较基因组学分析

【目的】开展具有硫氧化能力的嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)的分离及其比较基因组学分析,不仅可以丰富硫氧化细菌菌种资源,而且有助于加深理解嗜酸硫杆菌的分子进化与生态适应机制。【方法】利用以硫代硫酸钠为唯一能源的培养基分离具有硫氧化能力的细菌;利用Illumina HiSeq X和Oxford Nanopore测序平台对一株嗜酸硫杆菌M4-422-6进行全基因组测序;利用相关生物信息学分析软件对原始数据进行组装和基因组注释,并与一株亲缘关系最近的菌株Igneacidithiobacillus copahuensis VAN18-1进行比较基因组学分析。【结果】分离获得一株具有硫氧化能力的嗜酸硫杆菌M4-422-6。基因组注释结果显示,菌株M4-422-6基因组由1个染色体和2个质粒组成,基因组大小为2 917 823 bp,G+C含量为58.54%,共编码2 925个蛋白。16S rRNA基因和基因组系统发育树显示,菌株M4-422-6代表嗜酸硫杆菌属的一个潜在新种。功能基因注释结果显示,菌株Acidithiobacillus sp. M4-422-6拥有与菌株特性相关的众多基因,包括硫氧化相关基因、CO₂固定相关基因和耐酸相关基因。比较基因组学分析发现,虽然菌株M4-422-6与VAN18-1的亲缘关系最近,但两者仍拥有众多的差异基因,主要包括噬菌体抗性相关基因和移动元件编码基因。【结论】菌株M4-422-6代表嗜酸硫杆菌属的一个潜在新种,该菌株具有同种内菌株所不具有的特有基因,并据此推测嗜酸硫杆菌种内分化可归因于对特定生态位的适应。     

嗜盐古生菌AJ4中BR蛋白基因部分片段和16S rRNA基因序列研究

为了研究分析新疆阿尔金山国家自然保护区阿牙克库木湖嗜盐古生菌物种与细菌视紫红质(bacteriorhodopsin ,BR)蛋白资源 ,对分离纯化到的极端嗜盐古生菌AJ4 ,采用PCR方法扩增出其 16SrRNA基因 (16SrDNA)和编码螺旋C至螺旋G的BR蛋白基因片断 ,并测定了基因的核苷酸序列 .通过BR蛋白部分片段序列分析表明 ,BR蛋白中对于完成质子泵功能以及与视黄醛结合的关键性氨基酸残基均为保守序列 ,位于膜内侧的序列比位于膜外侧的序列更保守 ;基于BR蛋白基因和16SrDNA序列的同源性比较以及 16SrDNA序列的系统发育学研究表明 ,AJ4是Haloarcula属中新成员 .由此建立了一种快速筛选具有新BR蛋白的新嗜盐古生菌的方法 .     

两种新呼吸链抑制剂对心肌制剂抑制作用的比较

用抑制剂作为分子工具研究呼吸链的电子传递机制已有相当长的历史,电子传递链各个区段均有酶专一的抑制剂被发现和使用.鉴于呼吸链中三个与泛醌反应相关的酶[还原辅酶Ⅰ:泛醌还原酶(NADH-Q reductase NQR)、琥珀酸:泛醌还原酶(succinate-Q reductase SQR)和泛醌:细胞色素 c 还原酶(QH₂-cytochrome c re-ductase QCR)]均催化同一底物反应,从酶学角度看应存在一类抑制剂能对三个催化泛醌反应的酶兼有抑制作用.经合成和筛选发现3-硝基-N-十二烷基水杨酰胺和2-羟基-3-N-十二烷基酰胺吡啶具备这类性质,它们对催化泛醌反应的三个酶都有抑制作用,而对与泛醌无关的末端氧化酶(cytochrome c oxidase)无任何作用.3-硝 基-N-十二烷基水杨酰胺对检测的心肌制剂各段酶活性的抑制能力均强于2-羟基-3-N-十二烷基酰胺吡啶.     

好客嗜酸两面菌W1寡营养酸性热泉环境的适应机制

【目的】从基因组水平揭示好客嗜酸两面菌(Acidianus hospitalis)W1对寡营养酸性热泉环境的适应机制。【方法】使用NCBI非冗余蛋白数据库、Uniport蛋白数据库以及Sulfolobus数据库对好客嗜酸两面菌W1基因组序列进行功能注释,使用KEGG数据库对基因组进行In slico代谢途径重构,在此基础之上,采用比较基因组学方法对代谢途径进行鉴定和完善。【结果】好客嗜酸两面菌W1具备多样化的代谢方式以适应寡营养酸性热泉环境。W1菌株通过3-羟基丙酸/4-羟基丁酸和乙二酸-4-羟基丁酸循环进行CO2固定、通过氧化还原型无机硫化物(Reduced inorganic sulfur compounds,RISCs)获取能量营自养型生长。但W1菌株与模式菌株Acidianus ambivalens的硫代谢方式不同,W1基因组中缺少编码亚硫酸-受体氧化还原酶(SAOR)、腺苷硫酸(APS)还原酶、硫酸腺苷酰转移酶(SAT)和腺苷硫酸:磷酸腺苷转移酶(APAT)的基因。此外,W1菌株可以通过非磷酸化的分支的ED途径和TCA循环进行葡萄糖代谢,糖类和氨基酸转运蛋白以及相应水解酶的存在表明W1能够利用部分有机物营兼性自养型生长。与A.ambivalens不同,W1菌株不能利用H2作为电子供体。【结论】多样化的代谢方式为好客嗜酸两面菌W1更好地适应寡营养酸性热泉环境提供了重要保障,对于W1菌株特有代谢方式的揭示也丰富了对于嗜酸两面菌(Acidianus)属物种代谢多样性的认知。