降钙素原荧光免疫层析方法的建立

降钙素原(Procalcitonin,PCT)是降钙素的前体物质,与人体细菌感染情况严重程度相关。通过PCT抗体与量子点偶联,自制试纸条,开发一种高灵敏度、快速便捷的PCT检测产品,对其初步应用。PCT单抗效价达107,PCT蛋白与量子点偶联,具有较好稳定性。试纸条线性检测范围0.15–120μg/L,灵敏度0.007μg/L,回收率范围91%–113%,批内批间变异系数小于8%。自制的荧光检测试纸条与市场上已有的降钙素原ELISA试剂盒进行比对,检测结果良好,基本能够完成临床样品的检测。     

胶体金免疫层析法检测猪链球菌2型的研究

目的:制备胶体金免疫层析试纸检测猪链球菌2型.方法:用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒,标记猪链球菌2型多克隆抗体,通过免疫层析作用对猪链球菌2型进行检测,并对试纸条的敏感性、特异性、稳定性进行评价.结果:每毫升胶体金最佳抗体标记量为22μg/mL,最佳包被抗体浓度为2 mg/mL,最佳BSA封闭浓度为1.5%,建立的胶体金免疫层析试纸条栓出猪链球菌2型的下限为106 CFU/mL,从检测到结果判断时间为5～15 min,与其他常见致病菌及链球菌属中15个群无交叉反应.结论:获得了检测猪链球菌2型的胶体金免疫层析试纸,该法操作简便,灵敏度高,特异性强,可用于猪链球菌的快速初筛和检测.     

三聚氰胺胶体金免疫层析试纸条的研制

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法,对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体,喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA(三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物)和纯化的羊抗鼠IgG分别喷于试纸的T(检测线)处和C(质控线)处,通过挑选试纸条材料和调试工艺参数,并最终组装成试纸条。结果显示,制备的试纸监测体系方法检出限为50 g/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100 g/L、100 ng/g和200 ng/g。将该法与LC-MS/MS法对比检测牛奶、奶粉和饲料样品,在试纸条检测范围内,与LC-MS/MS法检测结果一致性好,从而验证了该方法的有效性。制备的三聚氰胺胶体金检测试纸在常温干燥环境下至少可保质6个月,能够检测出三聚氰胺含量大于50 g/L的样品,适用于现场实际样品三聚氰胺残留水平监测,具有良好的应用前景。     

CA19-9时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立

本研究旨在建立一种定量检测血清中CA19-9含量的时间分辨荧光免疫层析检测方法。采用双抗体夹心法与荧光免疫层析技术,以羧基荧光微球和NC膜为载体将CA19-9配对抗体进行标记和包被,制备CA19-9检测试纸条。通过标记、包被抗体量对工艺进行优化,并通过线性范围、最低检出限、精密性等性能指标对CA19-9时间分辨荧光层析检测方法进行评价。最终确定20μL荧光微球的标记抗体量为80μg,检测线包被抗体浓度为1.5 mg/mL时,检测时间为15 min,线性范围为12.5–800 U/mL,最低检出限为6.32 U/mL,批内精密性与批间精密性均小于15%,平均回收率为101%,与罗氏电化学发光检测试剂盒平行检测50份临床样本,两者相关系数为0.980 6。初步建立了定量检测血清中CA19-9的荧光免疫层析检测方法,有较好的临床应用前景。     

基于铈元素的荧光侧向液流免疫层析用于降钙素原测定

基于铈元素(Ce)的荧光侧向液流免疫层析(lateral-flow immunoassays,LFIA)技术,开发一种用时短、检测限低的方法,定量测定降钙素原(procalcitonin,PCT),以满足临床检测和诊断的需求。经反向微乳化、氨基修饰、包被Ce,合成Ce微球;其经活化、洗涤,用PCT抗体标记结合和封闭制备微球悬浮剂,固化液相、固定包被和质控抗体、组装和切割等步骤制备PCT试纸条,检测PCT标准品;通过精密度、正确度、回收率、交叉反应和热稳定实验分析该PCT试纸条的临床价值。实验结果显示:用1%含量的Ce微球、100μg标记抗体、Blockmaster TM CE510封闭剂制备的PCT试纸条,采用LFIA法检测PCT,仅需4 min完成检测,大大缩短实验时间;检测限达0.10μg/L;且无边缘和钩状效应、交叉反应;成本低、精密度和准确度高、回收率佳、热稳定性好。因此,本实验基于Ce的LFIA法,成功研发了一种快速、灵敏的PCT床旁定量检测。     

基于胶体金的8-羟基-2′-脱氧鸟苷免疫层析试纸条北大核心CSCD

8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine,8-OHdG)是评价DNA氧化损伤较灵敏和稳定的生物标志物。文中采用竞争法建立一种快速、灵敏检测8-OHdG的胶体金免疫层析试纸条。将样品垫(玻璃纤维素膜)、结合垫(玻璃纤维素膜)、硝酸纤维素膜和吸水垫依此粘贴在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板上,构建试纸条。通过柠檬酸钠还原三水合四氯金酸制备胶体金(gold nanoparticles,AuNPs),8-OHdG配对的抗体(antibody,Ab)包被于AuNPs的外层(Ab coated AuNPs,Ab@AuNPs)作为探针。牛血清蛋白(bovine serum protein,BSA)与8-OHdG用碳二亚胺盐酸盐偶联制备人工抗原,作为检测线的包被抗原。羊抗鼠多抗(imunoglobulin G,IgG)作为质控线的包被抗体。对试纸条的硝酸纤维素膜、上样液的配方、金标抗体喷涂量等实验参数进行了优化。结果表明,硝酸纤维素膜(nitrocellulose film,NC)膜采用CN 95,上样液的最优配方为1%BSA+3%吐温-20+3%蔗糖+0.9%NaCl溶液,最适金标抗体喷涂量为4μL。利用试纸条在可见光下检测8-OHdG,根据检测线(test line,T线)和质控线(control line,C线)的显色强度对比,可初步判断尿液中8-OHdG的含量水平。并通过T线的灰度值计算尿液中的8-OHdG的浓度,检测限为2.55μg/L。该方法简单、快速且有较好的特异性,可检测人体尿液中的8-OHdG含量,以初步评价人体的健康状态。     

纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人乙型肝炎表面抗原

目的:应用纳米磁性颗粒标记的免疫层析法,研制可应用于乙肝表面抗原(HBsAg)快速定量检测的层析试纸条。方法:用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联的方法标记纳米磁珠,喷膜仪喷点硝酸纤维膜;根据双抗体夹心法原理建立免疫层析试纸条,对HBsAg特异性抗体捕获的磁信号进行检测,并对磁信号检测结果进行统计学分析和评价。结果:建立了HBsAg纳米磁性免疫层析试纸条,最低限度检测为0.1 ng/mL的HBsAg抗原,检测灵敏度达到了同类产品ELISA分析法的标准,且检测时间控制在5 min内;经检测临床血清标本证实,该方法可根据磁信号定量检测乙肝患者血清中HBsAg的浓度。结论:HBsAg纳米磁性免疫层析方法具有简单快速、灵敏度高的特点,可应用于临床血清样本中HBsAg的检测;该方法为体内极微量抗原抗体的快速检测建立了新模式。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型抗体胶体金检测试纸条的制备和分析

【背景】由鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus-2, CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血坏死病在鲫和金鱼中的暴发给水产养殖业造成了巨大的经济损失。【目的】开发一种快速、现场检测鲫是否感染过CyHV-2和监测鲫CyHV-2IgM抗体水平的胶体金检测试纸条。【方法】将CyHV-2与胶体金结合作为金标抗原、Protein A作为检测线、兔源rORF66多克隆抗体进行划线作为质控线,分析胶体金试纸条最佳制备及组装条件,确定胶体金标记最适pH、金标抗原最适浓度,以及检测线(test line, T线)、质控线(control line, C线)最适划线浓度等。【结果】本研究制备的CyHV-2抗体胶体金试纸条可以使用全血测试,与常见的其他鱼类抗体血清无交叉反应,如草鱼呼肠孤病毒抗体阳性血清、鳜虹彩病毒抗体阳性血清等。试纸条最低限度可以检测到1:100稀释的阳性血清抗体,由试纸条检测线的深浅可以初步判断鱼体中抗体水平。试纸条通过对10条鲫鱼血清样品检测并和金鱼造血器官坏死病毒检测方法(GB/T 36194—2018)进行Kappa分析,Kappa值为0.80,表明二者有较高的符合...     

狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫 (金标垫),将SPA (葡萄球菌表面A蛋白) 和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (对照线) 处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验 (RFFIT) 检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体 (VNA) 大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体 (VNA) 小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。     

一种超高灵敏的埃博拉病毒胶体碳侧流免疫层析检测方法的建立

埃博拉出血热 (Ebola hemorrhagic fever, EHF) 由于其高感染性和高致死率特点,快速鉴别诊断并实施隔离是最有效的防止疫情扩散的措施。文中建立了一种可以快速、高灵敏筛查埃博拉病毒 (Ebola virus,EBOV)感染的现场检测技术,用碳纳米颗粒标记抗EBOV基质蛋白VP40兔多克隆抗体,组装成一种可在15 min内检测埃博拉病毒的胶体碳侧流免疫层析试纸条。将标记胶体碳颗粒的兔多抗喷涂于玻璃纤维素膜上制备碳标垫;以1 mg/mL的抗VP40单克隆抗体 (McAb,4B7F9) 和羊抗兔IgG,按照2 μL/cm的包被量印迹于硝酸纤维膜上,分别作为检测线与质控线,组装试纸条。该试纸条能够特异地检测EBOV重组VP40蛋白、EBOV病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP) 和灭活EBOV,而与马尔堡病毒样颗粒 (MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8 (IAV/PR/8)、黄热病毒 (YFV-17D)、登革热病毒2型 (DEN2) 无交叉反应,显示良好的特异性,对1 500份阴性血清进行检测,假阳性率为1.3‰,仅为WHO授权ReEBOV?胶体金试纸的1/100;该胶体碳试纸条检测灭活EBOV的最低检出限为100 ng/mL (相当于106 copies/mL),远优于ReEBOV?胶体金试纸条检出限 (10 μg/mL,相当于108 copies /mL)。热稳定性评价显示试纸条可在室温稳定保存1年以上。文中建立的EBOV胶体碳免疫层析试纸条能够快速、超高灵敏、特异地检测EBOV,为现场快速筛查EBOV感染提供一种新方法。     

纳米磁性颗粒标记的免疫层析法定量检测人绒毛膜促性腺激素

目的:应用纳米磁性颗粒标记的免疫层析法研制用于早孕检测的快速定量层析试纸条。方法:应用EDC/NHS法标记纳米磁珠、Biodot喷膜仪喷点NC膜、双抗体加心法建立免疫层析试纸条、对磁信号进行检测并与ELISA实验做对比,并对结果进行评价。结果:建立了HCG纳米磁性免疫层析试纸条,检测到底线为1miu/ml的HCG抗原,检测灵敏度达到了同类产品ELISA分析法的标准;用此方法与商品化免疫胶体金试纸条对临床样本进行检测,检测符合率达99%,与ELISA法比较符合率达100%,且检测时间控制在5min以内。结论:该方法简单快速,灵敏度高,不仅可以应用于HCG的检测,同时为体内极微量抗原抗体的快速检测建立了新模式。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测HBV DNA

目的：本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法。方法：利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5＇端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素。核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体。将扩增产物与展开液混合后点样,10 min后即可用肉眼判读结果。在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价。最后收集15例阴性样本及33例HBsAg阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较。结果：试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250copies/mL。在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%。且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异。结论：核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测 HBV DNA

目的:本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法.方法:利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5'端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素.核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体.将扩增产物与展开液混合后点样,10min 后即可用肉眼判读结果.在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价.最后收集15例阴性样本及33例HBsAg 阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较.结果:试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250eopies/mL.在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%.且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异.结论:核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用.     

噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选

利用小白鼠免疫和噬菌体展示技术构建了噬菌体展示抗体文库,从文库中筛选获得了一株抗克伦特罗单克隆抗体。该抗体的氨基酸序列尚未在世界基因数据库中登录,是一个新的抗体。该抗体对于游离克伦特罗的半抑制率IC50为0.602μg/mL。该噬菌体展示的抗体片段可以用于竞争法检测克伦特罗的含量,其能够检测出的最低浓度为15.6 ng/mL,具有较大的实用价值。     

高效液相色谱-串联质谱法测定六堡茶中黄曲霉毒素B1的研究

目的建立以多壁碳纳米管作为QuEChERS吸附剂,高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定六堡茶中黄曲霉毒素B_1的分析方法。方法采用乙腈提取,并在样品提取液中加入分散固相基质净化后进行测定。结果在2.6~41.6μg/kg浓度范围内具有良好线性关系,黄曲霉毒素B_1的回收率为83.8%,相对标准偏差(RSD)4.7%,n=10,方法检测限为2.6μg/kg。结论该法有较好的灵敏度,能够满足六堡茶中黄曲霉毒素B_1测定的要求。     

基于垂直流向纸基微流控芯片检测人尿液中IgG蛋白

肾脏是人体最重要的器官,可以通过检测尿液中的蛋白成分来诊断某些疾病。尿液中IgG蛋白的含量可以用来判断肾功能受损伤程度。本研究采用垂直流向的纸基微流控芯片,利用双抗夹心免疫反应显色,手机拍摄图像处理的方法对人尿液中IgG蛋白进行了检测。结果表明,在IgG抗体浓度为500μg/mL,金标抗体浓度为100μg/mL的条件下图像信号在IgG浓度为0.2–3.2μg/mL范围内具有良好的线性关系,R²=0.973 3。设计了一套完整的检测装置,并且该检测方法具有良好的非特异性。     

细胞骨架蛋白4荧光免疫层析检测方法的建立

采用基于免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式,建立一种快速、简单的定量检测肝癌肿瘤标记物的方法。依据双抗体夹心原理,将细胞骨架蛋白4(CKAP4)配对抗体分别作为标记与包被抗体,羊抗兔多抗作为质控线包被抗体,制备CKAP4荧光免疫层析试纸条,并对试纸条的线性、精密性、稳定性等各项性能指标进行评价。结果表明,采用时间分辨荧光微球所制备的CKAP4免疫层析试纸条灵敏度高,特异性好,精密性在15%以内,回收率在85%–115%之间,线性范围为25–1 000 pg/mL,可在37℃稳定保存20 d,与商业化的ELISA试剂盒的相关性良好。结论:初步建立了CKAP4荧光免疫层析方法,能够定量检测血清中CKAP4的含量,且具有快速、灵敏、简便、经济、可单人份操作等优点,有望成为肝癌辅助诊疗的新方法。     

诺如病毒常见流行株胶体金免疫层析快速检测方法

【背景】诺如病毒是全球引发急性胃肠炎的最主要病原之一,具有丰富的遗传多样性。【目的】建立一种简便快捷、适用于诺如病毒常见流行株的胶体金免疫层析检测方法。【方法】将抗诺如病毒衣壳蛋白的单克隆抗体1B10作为金标抗体、抗诺如病毒衣壳蛋白的单克隆抗体1D6作为检测线、羊抗鼠抗体作为质控线组装成胶体金试纸条。对试纸条的组装条件进行优化,确定最佳标记pH、金标抗体最佳浓缩比例及检测线(test line,T线)、质控线(control line,C线)最佳划线浓度等。对新方法进行性能评价,包括灵敏性试验、特异性试验、保存期试验及符合率实验等。【结果】所建立的诺如病毒胶体金试纸条检测方法最低检测浓度为5.9×105copies/μL。本方法与常见的腹泻病毒,如轮状病毒、星状病毒、腺病毒、肠道病毒均无交叉反应。批次间与批次内重复较好,保存期试验表明试纸条至少可以室温密封干燥保存一年时间。应用所建立的胶体金检测方法对24份临床粪便样本进行检测,检测结果与实时荧光RT-PCR方法的阳性符合率约为83%(15/18),常见流行株GII.2型、GII.4型、GII.17型均被成功检出。【结论】建立的胶体金试纸条检测方法具有较好的特异性与稳定性,可用于诺如病毒常见流行株检测及大规模流行病学调查。     

辣椒制品中苏丹红Ⅰ快速检测的方法研究

为建立一种辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测方法,通过直接提取法、固相萃取法和皂化法对辣椒制品中苏丹红Ⅰ进行提取净化,用胶体金免疫层析法对其进行检测,并进行方法学验证。结果显示:辣椒制品直接提取法在检测时,检测限较高,无法满足检测要求;固相萃取法适用于辣椒酱和辣椒油的快速检测,检测限为10μg/kg;皂化法适用于辣椒粉的快速检测,检测限为10μg/kg。方法学验证表明:以辣椒酱、辣椒油和辣椒粉作为空白基质的检测限为10μg/kg,灵敏度均为100%,特异性为87.5%~100%,假阳性率为12.5%,假阴性率为0。该方法快速准确、灵敏度高,可适用于辣椒制品苏丹红Ⅰ的快速检测。     

抗EGFRvⅢ单链抗体间接ELISA方法的建立及条件优化北大核心

[目的]以合成抗原EGFRvⅢ-BSA作为被检测物,建立检测抗EGFRvⅢ单链抗体的间接ELISA检测方法并优化其反应条件。[方法]利用N-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)将EGFRvⅢ与BSA偶联制备抗原。利用方阵滴定法对间接ELISA法的抗原包被浓度,单链抗体的稀释度、包被时间和温度、包被液、抗His-tag多抗稀释度和酶标抗体的稀释度进行优化,并对建立的间接ELISA方法的方法学进行验证。[结果]通过SDS-PAGE电泳和全波长紫外扫面显示EGFRvⅢ-BSA合成成功。用PBS于37℃包被1.25μg/m L的EGFRvⅢ-BSA 2 h,加入19.044μg/L的ChiMR1、1∶8 000的兔抗His-tag多抗和1∶10 000酶标抗体可获得最佳ELISA检测结果。应用优化后的条件检测4.761~152.35μg/L范围内的ChiMR1显示线性良好。线性方程为y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A:1.99706;B:-1.09760;C:35.54885;D:0.01558),R2=0.99923;60μg/L和20μg/L的质控品的检测精密度分别为7.142%和4.828%;准确度分别为91.8%和82.90%,准确度和精密度良好。[结论]建立的间接ELISA方法的线性、准确度和精密度良好,为临床疾病的检测奠定良好基础。