布氏菌104M变异株毒力及保护力研究

目的研究皮上划痕人用布氏菌活疫苗104M变异株的残余毒力及保护力。方法对布氏菌104M变异株进行菌种检定。通过测定布氏菌104M变异株与未变异株的半数致死量(50%lethal dose,LD50),比较两者的残余毒力;用布氏菌104M变异株与未变异株分别免疫小鼠,4周后用羊型弱毒或强毒布氏菌皮下攻击,4周后测定脾脏细菌数,比较布氏菌104M变异株与未变异株的保护效果。结果菌种检定结果显示,布氏菌104M变异株与未变异株分别符合变异及未变异布氏菌株特征。104M未变异株LD50为1.1×109,变异株LD50为2.2×1010。用羊型弱毒及强毒布氏菌攻击后,布氏菌104M变异株与未变异株均具有较好的保护效果,但104M变异株保护力低于未变异株,差异具有统计学意义(P0.05)。结论布氏菌104M变异株残余毒力比未变异株明显降低,保护力略低于未变异株。     

布鲁菌omp19原核表达和间接酶联免疫吸附试验检测布鲁菌方法的建立

本研究原核表达并纯化了布鲁菌脂蛋白Omp19,并通过蛋白免疫印迹法对其免疫原性进行验证。采用Omp19作为包被抗原,建立检测羊种布鲁菌的间接酶联免疫吸附试验(iELISA),检测90份羊血清样本,并与标准血清凝集试验(SAT)比较,用SPSS软件进行数据分析。结果显示,iELISA与SAT的阳性符合率为95.12%,阴性符合率为67.35%,Kappa值为0.607 7。对2种方法进行McNemar卡方检验,结果有显著性差异(P0.05)。本研究建立的iELISA与SAT的总符合率达80%,可作为羊种布鲁菌病血清学诊断的备用方法。     

omp25c基因对马耳他布鲁菌疫苗株M5的毒力及免疫保护性的影响

目的：初步评价马耳他布鲁菌M5疫苗株omp25c基因对其毒力及免疫保护性的影响。方法：利用同源重组的方法,用卡那霉素抗性基因替换M5的omp25c（BMEI1829）基因,得到缺失突变株M5Δomp25c;分别用M5Δomp25c和M5免疫小鼠,在免疫后不同时间点处死小鼠,通过脾脏细菌计数分析缺失突变株在小鼠体内的毒力,通过检测IgG和IFN-γ的水平分析缺失突变株在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答能力,通过攻毒实验评价突变株的免疫保护效果。结果：与M5株相比,M5Δomp25c在小鼠脾脏内的存活时间较短,在第4周时未能检出;M5Δomp25c免疫小鼠诱导产生的IgG水平在第4周达到最高,第6周开始下降;M5Δomp25c免疫小鼠诱导分泌的IFN-γ水平在第4周达到最高为790pg/mL,第6周时浓度降至530pg/mL,整体趋势显著低于阳性对照组;接种了M5Δomp25c的小鼠用布鲁菌强毒株16M攻毒后,免疫保护效果也下降。结论：缺失omp25c的突变株毒力减弱,诱导的体液和细胞免疫水平及免疫保护效果下降,说明omp25c基因是马耳他布鲁菌M5疫苗株的毒力相关基因,对疫苗株M5的免疫应答和免疫保护效果有一定的影响。     

布鲁菌抗原的快速克隆与高效表达

目的:通过Gateway技术构建布鲁菌抗原表达载体,并筛选出高效可溶性表达载体。方法:以山羊布鲁菌16M株染色体DNA为模板,扩增4个布鲁菌抗原基因BMEI2002、BMEI1069、BMEI1483和BMEI0748,利用GatewayBP反应将基因克隆到入门载体pDONR201中,构建重组质粒,然后用Gateway LR反应将基因重组到3种表达载体(pDEST17、pHXGWA、pHGGWA)中,构建相应的重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3)并诱导表达,分析利用3个不同载体所表达蛋白的表达量及表达形式。结果:利用BP反应构建了4个基因的重组质粒,用LR反应将这些基因分别克隆到表达载体,构建得到了相应的表达载体;诱导表达后的可溶性分析显示,含6×His和TRX标签的pHXGWA所表达的蛋白在表达量和可溶性方面均优于pDEST17和pHGGWA。结论:通过Gateway技术实现了布鲁菌抗原的快速克隆,筛选到的pHXGWA可作为后续大规模克隆表达载体,为布鲁菌抗原的大规模克隆表达和保护性抗原的筛选奠定了基础。     

鸡白痢沙门菌sptP基因缺失株的构建及其免疫保护效力评价

旨在评价鸡白痢沙门菌sptP基因缺失突变株对雏鸡的免疫保护效力,研制有效的鸡白痢沙门菌减毒活疫苗.利用λ-red同源重组技术构建鸡白痢沙门菌C79-13株的sptP基因缺失株C79-13ΔsptP,并分析其基本生物学特性;以1.0×108菌落形成单位(CFU)的C79-13ΔsptP经口服免疫3日龄雏鸡,对雏鸡的体重与...     

构建稳定过表达转录辅助因子LBH的人间充质干细胞株

目的:构建转录辅助因子LBH(limb-bud and heart)过表达的人间充质干细胞(MSC)株,研究Lbh基因对人MSC功能的调控。方法:通过分子克隆的方法构建人Lbh基因的慢病毒表达质粒p CDHP-Lbh,经限制性内切酶酶切和核酸测序鉴定,利用293T细胞包装表达Lbh基因的慢病毒及对照;将包装的病毒感染人MSC,利用表达载体携带的GFP报告基因,采用流式细胞术分选GFP阳性目的细胞;通过油红O染色鉴定阳性细胞的成脂分化能力,通过茜素红和硝酸银染色鉴定阳性细胞的成骨分化能力。结果:双酶切和测序结果表明正确克隆了人Lbh基因的全长CDS序列,定量PCR和Western印迹结果表明构建的p CDHP-Lbh重组质粒能够表达Lbh基因;流式分选获得LBH稳定表达的人MSC细胞株,该细胞株经成骨和成脂诱导分化培养后,油红O染色、茜素红染色和硝酸银染色结果均呈阳性。结论:构建了人Lbh基因的慢病毒表达质粒p CDHP-Lbh,并获得稳定表达Lbh基因的人MSC细胞株,该细胞株保留了向脂肪细胞和成骨细胞定向分化的能力。本研究为进一步探讨Lbh基因对人MSC功能的调控提供了重要的实验基础。     

猪链球菌2型菌毛样结构蛋白SSU2101原核表达及其免疫保护性

为了研究猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)05ZYH33株预测的菌毛样结构蛋白(Pili-like protein,PLP)SSU2101的免疫保护性作用,本试验通过PCR扩增出plp基因片段,进一步将目的基因克隆到表达载体pET32a中,IPTG诱导重组蛋白表达,亲和层析法纯化目的蛋白.Western blot分析表明该重组蛋白具有良好的免疫原性,动物试验结果证实PLP蛋白对S.suis 2强致病株感染小鼠具有显著的免疫保护作用,提示菌毛样结构蛋白SSU2101是理想的猪链球菌 2型亚单位疫苗的候选分子.     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M.RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表达M基因的mRNA和M蛋白.纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8TCID50/mL.动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础.     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人 血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M。RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表 达M基因的mRNA和M蛋白。纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8 TCID50／ mL。动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd-M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应 答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础。     

鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株的构建及其耐药性

[背景]鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种重要的人兽共患病原菌,其多重耐药性问题日益严重,双组分系统可调控鼠伤寒沙门氏菌的耐药性。[目的]通过构建鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株及回补株探究BaeSR双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响。[方法]在BaeSR双组分系统和AcrB外排泵双缺失株（CRΔbaeSRΔacrB）的基础上构建baeR过表达株（CRpbaeRΔbaeSRΔacrB）及baeR回补株（CRcbaeRΔbaeSRΔacrB）,测定双缺失株、回补株和过表达株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并对其生长特性、生物膜形成能力及运动性进行分析。采用转录组学技术筛选与耐药相关的差异表达基因,RT-qPCR验证耐药相关基因。[结果]构建了鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株和baeR回补株。与双缺失株相比,过表达株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、乙酰甲喹、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林和氨苄西林的MIC分别升高2-256倍,对大观霉素、安普霉素的MIC下降了50%;与双缺失株相比,回补株对头孢他啶...     

布鲁菌与巨噬细胞相互作用的研究进展

布鲁菌是兼性胞内寄生菌,其最主要的致病机制是长期在宿主单核巨噬细胞内存活和繁殖。它可以调控其自身的运输来避免溶酶体的降解,并在宿主细胞内广泛的复制但又不限制细胞基础功能或诱导程序性死亡,这是造成布鲁菌与宿主交互作用发生、发展的重要原因。     

表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

目的:应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4(NSP4)的重组腺病毒,初步评价其免疫保护效果。方法:构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4,与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果:获得了滴度为108.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4,免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1∶320和1∶1436.8;中和抗体效价1∶45.3和1∶71.8。结论:表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。     

表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

目的：应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4（NSP4）的重组腺病毒,初步评价其免疫保护效果。方法：构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4,与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果：获得了滴度为10^8.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4,免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1：320 和1：1436.8;中和抗体效价1：45.3和1：71.8。结论：表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

表达SLTEC保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的构建及生物学特性

摘要:【目的】 利用平衡致死系统构建表达产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichia coli , SLTEC)保护性抗原的减毒猪霍乱沙门氏菌。【方法】 构建表达SLT-IIeB－FedF的重组质粒 ,再将其电转入终宿主菌减毒猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株中构建成口服活疫苗株 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SLT-IIeB－FedF融合蛋白的表达情况,并观察重组菌体外培养的稳定性。【结果】 　利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达SLTEC保护性抗原的重组减毒猪霍乱沙门氏菌     

日本血吸虫中国株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的克隆、表达及其免疫保护性研究

根据基因库中日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT) EST (BU803192) 以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgt11多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjHGPRT基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接,获得SjHGPRT全长cDNA (1 270 bp),经序列分析,推断该片段含有编码SjHGPRT基因的完整阅读框,其编码基因与曼氏血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (SmHGPRT) 全长编码基因碱基一致性为82%,其理论推导的氨基酸组成与曼氏血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的一致性约为83%. 将其编码基因克隆到表达载体pQE30上,在大肠杆菌M15中获得准确、高效表达,表达产物分子质量约为28 ku. 用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对表达产物进行蛋白质印迹检测,在预测位置上出现明显的识别条带. 重组蛋白动物免疫保护性结果显示：在虫荷、每克肝卵、每克粪卵和雌子宫内卵数方面,疫苗组与对照组比较差异均具有显著性 (P < 0.05,P < 0.01). 结果表明,日本血吸虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (SjHGPRT) 全长cDNA成功克隆并在大肠菌中得到表达,表达产物具有良好的抗原性和动物免疫保护效果,是一种潜在的具有部分免疫保护性的抗血吸虫病疫苗候选分子.     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A N端保护区在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A(SpaA)N端保护区(SpaA-N),并检测其抗原性.方法:利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spoA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),再经IFrG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化.结果:扩增得到的spaA基因长1 881 bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64 000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应.结论:获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础.     

MicroRNA-9过表达载体的构建与鉴定

目的:MicroRNA(miRNA)是一类对基因表达起着转录后调控的小分子RNA,在正常发育和疾病发生过程中都发挥着重要的功能。其中,miR-9是一个序列高度保守的成员,在神经发育中调节神经干细胞的多种行为,包括分化、迁移等。但是,目前研究发现的miR-9的功能还存在一些相互矛盾和不清楚的地方,因此,我们拟构建miR-9的过表达载体,以便于对miR-9进一步的仔细研究。方法:我们采用分子克隆的常用方法,以pcDNA6.2-GW/miR为基础,构建出pcDNA6.2-GW/miR-9的表达质粒,分别用PCR、酶切和测序的方法验证质粒构建的正确性,并在Hela细胞和NIH3T3细胞中验证该质粒是否可以过表达miR-9小分子。结果:我们成功构建出正确的pc DNA6.2-GW/miR-9表达质粒,并且该质粒无论在人源的Hela细胞还是在小鼠源性的NIH3T3细胞中都可以过表达miR-9小分子。结论:构建了一个在不同种属间通用的miR-9过载体,为我们进一步研究miR-9的功能奠定了基础。     

两株产生免疫抑制剂的小双孢菌分离株的鉴定

从江苏无锡土壤中分离到两株玫瑰小双孢菌SIPI226和SIPI207,经形态、化学分析、Ribotyping及16S rRNA分析,两菌株细胞壁含meso\|DAP、磷酸类脂PIV、无枝菌酸,醌为MK9(H0,H2,H4),G+C mol%分别为683和694。经初步鉴定为玫瑰小双孢菌的两个新亚种：玫瑰小双孢菌无锡亚种(Microbispora rosea subsp. wuxiensis)和玫瑰小双孢菌鼋头渚亚种(Microbispora rosea subsp. yuantouzhuensis)。菌株SIPI226和SIPI207分别为玫瑰小双孢菌无锡亚种和玫瑰小双孢菌鼋头渚亚种的典型菌株。