木薯MeNCED3基因克隆、结构变异及其表达分析

旨在揭示木薯MeNCED3基因在干旱等非生物胁迫应答中的作用。用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆MeNCED3基因,用MEGA软件构建进化树;用Dna SP软件分析基因结构变异,用荧光定量PCR技术分析MeNCED3在不同非生物胁迫下的表达特性。结果显示,从木薯中克隆了一个NCED基因MeNCED3,该基因具有1 803 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸,含有NCED家族保守结构域。进化树分析表明,MeNCED3与杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别达到83.9%和82.5%。基因结构变异发现,木薯野生种和栽培种之间共有8个错义突变,其中5个可能与MeNCED3的表达量有关。实时荧光定量PCR分析表明,MeNCED3在根中的表达量要远远高于叶片和茎。而且,MeNCED3的表达能被PEG、ABA和NaCl处理显著诱导。因此,MeNCED3在转录水平对木薯渗透胁迫、盐胁迫起调控作用,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗旱中的功能。     

木薯MePIL1基因克隆与表达分析

旨在克隆木薯Me PIL1基因,揭示其在木薯遮荫等非生物逆境胁迫中的作用。用RT-PCR的方法从木薯栽培种Ku50叶片中克隆Me PIL1基因,对其进行序列比对和系统进化树分析,研究其在木薯野生种和栽培种之间的结构变异,并应用荧光定量PCR技术分析其表达特性。结果显示,克隆获得木薯Me PIL1基因,该基因具有一个1 578 bp的开放阅读框,编码525个氨基酸,含有一个HLH保守结构域。系统进化树分析表明,Me PIL1与其在杨树和杞柳中的同源基因聚在一起,亲缘关系较近。基因结构变异分析显示,Me PIL1在HLH结构域非常保守,其结构变异主要来自于栽培种与野生种之间的差异,且整体上分布比较均匀。表达分析结果显示,Me PIL1在叶片中高表达,而且其表达量受到遮荫和渗透胁迫的诱导。结果表明,成功克隆了木薯Me PIL1基因,并且Me PIL1在转录水平参与木薯对遮荫和渗透胁迫的应答。     

木薯MeASR基因克隆及表达分析

脱落酸-胁迫-成熟诱导蛋白(Abscisic acid-stress-ripening,ASR)在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。利用PCR技术从木薯中克隆了第一个ASR基因Me ASR,序列分析表明该基因开放阅读框(ORF)330 bp,编码109个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有ASR家族蛋白的保守结构域,与番茄ASR家族蛋白Sl ASR4具有较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明Me ASR定位在细胞核,实时荧光定量PCR分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和ABA诱导。结果表明,Me ASR可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及ABA信号调节。     

木薯MeTPS9基因克隆及表达特性分析

旨在揭示木薯Me TPS9基因在干旱、低温、遮荫等非生物胁迫应答中的作用。用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆Me TPS9基因(Gen Bank登录号:MF276889),用MEGA软件构建系统进化树,用Dna SP软件分析基因结构变异,用Plant CARE分析启动子元件,用荧光定量PCR技术分析Me TPS9在不同组织中以及响应不同非生物胁迫的表达特性。结果显示,从木薯中克隆了一个TPS基因Me TPS9。该基因具有2 598 bp的开放阅读框,编码865个氨基酸,含有TPS家族保守结构域。系统进化树分析表明,Me TPS9与荠菜花和拟南芥中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别为76.2%和75.6%。基因结构变异发现,木薯野生种和栽培种之间共有66个突变位点,其中11个为错义突变。启动子元件分析表明,Me TPS9含有干旱相关元件MBS、低温相关元件LTR、热胁迫相关元件HSE、以及ABA相关元件ABRE。实时荧光定量PCR分析表明,Me TPS9的表达量在须根中最高,在叶片中最低。而且,Me TPS9基因的表达能被干旱、低温、和遮荫处理显著诱导。Me TPS9在转录水平对木薯干旱、低温、和遮荫胁迫起调控作用,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的作用。     

油茶Pht1;1基因克隆及其表达分析

以油茶‘湘林4号’为材料,通过 RT-PCR 和 RACE 的方法克隆出油茶磷酸转运子Pht1基因家族一个成员的全长cDNA序列,命名为CoPht1;1（GenBank登录号：JX403969）,通过实时定量 PCR 的方法检测了不同磷浓度下该基因在根系中的表达水平。结果表明：CoPht1;1 CDS长度为 1 626 bp,编码 542 个氨基酸,与其他物种的Pht1氨基酸序列具有较高的相似性,其中与夹竹桃科长春花的 Pht1相似性最高,达到 88%;蛋白质二级结构和拓扑结构预测表明,CoPht1;1具有跨膜蛋白的主要特征,与其他物种的Pht1具有一致性;实时定量 RT-PCR 结果表明,油茶Pht1基因的表达受低磷因素诱导,并随磷处理时间的不同而变化。     

苋菜IRT1基因克隆、序列及表达分析

通过对镉超积累苋菜品种天星米铁转运蛋白基因( IRT1)的克隆、序列及表达分析,旨在为植物修复镉污染土壤奠定基础.依据同源克隆原理,通过RACE技术克隆苋菜IRT1基因及生物信息学方法分析基因序列结构和功能,Northern杂交研究基因表达.苋菜IRT1基因cDNA全长1135 bp,包含完整的阅读框,编码322个氨基酸.苋菜IRT1蛋白与已知铁转运蛋白相似性在53.70％-63.04％,具有铁转运蛋白典型的功能结构特征,即N端含有1个信号肽、氨基酸序列上具有完整的ZIP家族功能结构域( Pfam:Zip)和7个跨膜结构域(TMs).苋菜IRT1蛋白还具有1个COG0428超级家族(转运二价金属离子功能)、2个蛋白激酶C磷酸化位点和2个酪蛋白Ⅱ磷酸化位点.低铁胁迫时苋菜根中IRT1基因表达量增加,加镉处理没有改变IRT1基因表达量.因此,推断苋菜IRT1基因是ZIP家族的一员,具有转运二价金属离子功能,将基因在GenBank中注册,序列号为:GU363501,命名为AmIRT1.     

苹果MdKS、MdKOA1基因克隆与表达分析

内根-贝壳杉烯合成酶基因(KS)、内根-贝壳杉烯酸氧化酶基因(KOA)是赤霉素合成途径的关键基因。通过touchdown PCR从短枝富士茎尖组织中克隆得到KS和KOA基因的开放阅读框(ORF),分别命名为MdKS(GenBank登录号KF437681)和MdKOA1(GenBank登录号为KF437682)。MdKS和MdKOA1基因的ORF分别为2211 bp、1509 bp。氨基酸同源性分析表明,MdKS与其他物种的氨基酸序列具有45.2%~98.8%的同源性;而MdKOA1与其他物种的氨基酸序列同源性为42.8%~99.4%。亚细胞定位显示,MdKS蛋白定位于细胞核、细胞质和细胞质膜;而MdKOA1蛋白定位于细胞质和细胞质膜。荧光定量表明,MdKS与MdKOA1基因在SH40、SH28嫁接品种短枝富士不同组织中的表达模式基本一致。MdKS和MdKOA1在半矮化类型SH28嫁接短枝富士的茎尖、幼果与枝条中的表达量高于矮化类型SH40的嫁接品种。     

水曲柳BZR1基因克隆及其表达模式分析

研究水曲柳BZR1基因应答非生物胁迫及激素信号的表达模式,对探究BR在水曲柳生长发育及响应环境胁迫方面的作用有重要意义。本研究以水曲柳为材料,PCR克隆得到目的基因,通过生物信息学软件分析分子结构特征,利用荧光定量PCR探究FmBZR1在低温、盐胁迫及ABA、IAA、GA3诱导下的表达模式。生物信息学分析表明,FmBZR1基因全长984 bp,编码327个氨基酸,FmBZR1蛋白为亲水性蛋白,与樟子松BZR1蛋白的同源性较高。在非生物胁迫与激素诱导下,结果表明,与对照组相比,FmBZR1基因表达量有显著差异。低温处理6 h、盐处理24 h后表达量最高,分别为对照组的1.98、10.13倍。ABA、IAA、GA3处理3 h后基因表达量最低,分别为对照组的0.52、0.41、0.50倍;GA3处理24h后基因表达量最高,为对照组的6.23倍。FmBZR1基因在水曲柳生长发育及各种胁迫应答的过程起到了十分关键的作用。     

CARP1基因克隆、表达及其泛素连接酶活性的鉴定

目的：克隆并表达caspase-8／10相关RING结构域蛋白1（CARP1）基因,检测其泛素连接酶活性。方法：提取结肠癌HCT116细胞总RNA,RT-PCR扩增CARP1基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3-Flag中,序列正确的阳性克隆进行扩增,提取质粒转染至293T细胞中进行瞬时表达,通过体内泛素化检测其泛素化酶活性,通过萤光素酶报告基因的方法检测其对NF-kB转录活性的影响,利用细胞生长曲线检测CARP1基因对结肠癌细胞生长的影响。结果：免疫印迹实验表明CARP1基因在293T细胞中获得有效表达;免疫共沉淀实验表明,当CARP1存在时,受体相互作用蛋白1（RIP1）被泛素化;萤光素酶实验结果表明CARP1抑制肿瘤坏死因子a（TNFa）引起的NF-kB报道基因的激活;通过生长曲线发现CARP1能促进结肠癌细胞系HCT116生长,并能部分抵抗顺铂抑制细胞生长的作用。结论：构建的人CARP1基因真核表达载体在293T细胞中获得表达,表达产物具有RIP1泛素连接酶的活性,可抑制TNFa引起的NF-kB报告基因的激活,并且促进结肠癌细胞的生长,为进一步的基因功能研究奠定了基础。     

麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测

脂酶(Lipase, EC3.1.1.3)是普遍应用于皮革、饲料及生物柴油工业的工业酶制剂, 具有广泛的应用价值。目前对植物来源的脂酶研究较少。本研究用在生物柴油中具有应用前景的油料植物——麻疯树(Jatropha curcas)作为研究对象, 克隆了该物种的脂酶基因(JcLIP)。通过多序列比对并结合物种的亲缘关系设计了具有较高特异性的简并引物, 通过使用RT-PCR和RACE技术, 最终获得了麻疯树脂酶基因的全长序列并成功地在大肠杆菌中表达, 酶活测定结果表明, 麻疯树脂酶在大肠杆菌中表达在包涵体中, 但是能产生具有活力的蛋白质, 酶活约为0.8 U.mL-1。结构预测和比较表明, JcLIP蛋白质具有脂酶的结构核心和催化活性中心, 而在非核心区具有较毛霉脂酶更多的插入和随机卷曲, 这可能是决定二者之间酶活差异的重要原因。     

麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测

脂酶(Lipase,EC3.1.1.3)是普遍应用于皮革、饲料及生物柴油工业的工业酶制剂,具有广泛的应用价值。目前对植物来源的脂酶研究较少。本研究用在生物柴油中具有应用前景的油料植物——麻疯树(Jatrophacurcas)作为研究对象,克隆了该物种的脂酶基因(JcLIP)。通过多序列比对并结合物种的亲缘关系设计了具有较高特异性的简并引物,通过使用RT-PCR和RACE技术,最终获得了麻疯树脂酶基因的全长序列并成功地在大肠杆菌中表达,酶活测定结果表明,麻疯树脂酶在大肠杆菌中表达在包涵体中,但是能产生具有活力的蛋白质,酶活约为0.8U.mL-1。结构预测和比较表明,JcLIP蛋白质具有脂酶的结构核心和催化活性中心,而在非核心区具有较毛霉脂酶更多的插入和随机卷曲,这可能是决定二者之间酶活差异的重要原因。     

家蚕蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表达纯化与结构分析

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC 3.1.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyx mori蛋白酪氨酸磷酸酶h(BmPTP-h)参与了核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)在家蚕体内的复制过程,但目前对于BmPTP-h结构和性质的了解并不多。本文从家蚕中肠克隆了BmPTP-h基因编码序列,分析了BmPTP-h的基因组结构、mRNA结构、序列特征、二级结构和溶液中的状态。同源氨基酸序列比对分析表明BmPTP-h与多种昆虫NPV的PTP序列具有高相似度,暗示了它们可能具有共同的起源和相似的功能。文中构建了原核表达载体,通过大肠杆菌在25℃下表达获得了可溶性的重组BmPTP-h,利用Ni-NTA亲和层析纯化了BmPTP-h。凝胶过滤分析显示BmPTP-h在溶液中可以形成聚集体和单体。圆二色光谱分析显示重组的BmPTP-h包含α螺旋结构,升高温度导致BmPTP-h的α螺旋结构去折叠,α螺旋结构含量下降。这些研究为深入研究BmPTP-h的结构和调控机理提供了基础。     

绵羊CCNG1基因克隆及表达分析

细胞周期蛋白cyclin G1(CCNG1)是一个重要的细胞周期调控因子,参与哺乳动物颗粒细胞增殖、卵母细胞成熟等繁殖生物学过程,但其在绵羊中鲜有报道。为了研究CCNG1基因对绵羊发情调控以及季节性繁殖的影响,文章对绵羊CCNG1基因进行了克隆和组织表达谱分析,利用Real-time PCR对该基因在多浪羊(常年发情)与中国美利奴羊(季节性繁殖)发情周期不同阶段性腺轴组织的表达变化进行了实时检测。获得了绵羊CCNG1基因部分cDNA序列,其中编码区全长885 bp,编码294个氨基酸。CCNG1蛋白结构经预测存在多个磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点。CCNG1基因在所检测绵羊各组织中均有表达,但在卵巢与肾脏中为高丰度表达;CCNG1在不同绵羊品种发情周期不同阶段性腺轴组织的表达变化规律基本一致,卵巢、子宫、松果体、垂体均是在发情期达到峰值。但是在发情期和发情后期卵巢CCNG1的表达量存在显著的品种间差异(P<0.01)。研究结果表明,CCNG1可能通过参与卵泡的生长发育继而达到对绵羊发情和季节性繁殖的调控。     

中华鳖IGFBP1基因克隆及表达分析

[目的]克隆中华鳖IGFBP1 mRNA基因,分析基因生物信息,检测基因在胚胎和组织中表达情况。[方法]从中华鳖转录组中发掘IGFPB1 mRNA基因,并分析基因序列物信息;利用RT-PCR技术,从肝脏组织克隆IGFPB1c DNA基因,并检测其在胚胎和几种组织中的表达情况。[结果]从转录组中发掘到中华鳖IGFPB1 mRNA基因,基因长3 410 bp,包含81 bp的5’UCR序列,2 531 bp的3’UCR序列,798 bp开放阅读框,编码266个氨基酸,蛋白质分子量29.1 k Da,预测IGFPB1蛋白有1个α结构;对其构建的氨基酸序列系统进化树与传统形态分类相吻合;并在中华鳖受精卵孵化30d和45d的胚胎组织及300日龄的肝脏、肌肉和肾脏组织均检测到基因的表达。[结论]克隆到中华鳖IGFBP1基因,检测到该基因在30 d后的胚胎组织及300日龄的3种组织存在表达。     

慈竹BeSUS1基因克隆与表达分析

从慈竹转录组数据库中克隆得到了一个SUS基因,命名为Be SUS1,进行了生物信息学分析和组织表达分析。本研究表明,该基因该序列长为2 536 bp,ORF框长度为2 451 bp,编码816个氨基酸,具有N端的蔗糖合成功能域和C端的糖基转移功能域,Be SUS1属于单子叶SUS一簇,与绿竹、水稻、玉米等氨基酸序列,理化性质以及蛋白结构具有高度的同源相似性。组织表达分析显示Be SUS1在慈竹各个部位均有表达,但在各组织中表达具有一定差异,其在未展开叶中表达较低,而在成熟叶与茎段组织中表达较高。     

胡杨锌指蛋白基因克隆及其结构分析

锌指蛋白属于核转录因子家族,在原核生物与真核生物基因转录调控中发挥作用。分析了耐盐锌指蛋白Alfin-1基因在苜蓿与拟南芥中的保守性后,设计了一对引物。以胡杨水培叶片为材料,从总RNA中通过RT-PCR分离得到一个锌指蛋白基因,其cDNA长924bp。分析其氨基酸序列表明,存在一个典型的Cys2/His2锌指结构,从第556位开始有一个富含G的启动子结合位点GTGGGG。由于具有相同功能的转录因子在结构和DNA结合区的氨基酸序列上具有保守性,因此,从结构分析上可以推测该基因与Alfin-1在功能上是有一定的相关性。     

牦牛HYOU1基因克隆及组织表达分析

为探究HYOU1基因在牦牛中的组织表达谱,通过对西藏牦牛HYOU1基因的CDS区进行克隆测序,分析该基因的结构和功能,采用RT-PCR技术检测黄牛和牦牛肺脏、心脏、肝脏、乳腺、大脑及肌肉中HYOU1基因的相对表达量。结果表明:(1)HYOU1基因CDS区长度为3 006 bp,其中A、G、C和T含量分别为25.0%、31.1%、26.7%和17.1%,存在一定碱基偏好性;发现1个(ACG→ACA)SNP位点,为同义突变。(2)生物信息学分析表明该蛋白呈中性,为较不稳定、亲水性分泌信号蛋白;存在一个跨膜螺旋(TMhelix)区位于13-35氨基酸位置;二、三级蛋白结构分析发现其主要的空间构象为:无规则卷曲及α-螺旋。(3)聚类分析显示,西藏牦牛与野牦牛的遗传距离最近,与瘤牛及普通牛的遗传距离次之,与水牛最远。(4)RT-PCR结果显示HYOU1基因在黄牛和牦牛肝脏、乳腺、肺脏、大脑、心脏、肌肉6个组织中均有表达,且相对表达量依次递减;在相同组织中,黄牛组织的表达量均显著高于牦牛组织中的表达量(P0.05),其中黄牛肝脏组织的表达量为牦牛表达量的4.4倍。     

黄花草木樨MoSOS1基因克隆及表达分析

植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因SOS1是植物耐盐性必需的基因之一,在抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。以黄花草木樨叶片总RNA为模板,通过RT-PCR结合RACE方法克隆得到黄花草木樨MoSOS1基因全长序列,命名为MoSOS1。序列分析表明该基因全长为3 931 bp,开放阅读框(ORF)为2 874 bp,编码957个氨基酸,分子量为112.8 k D,等电点为5.31。TMHAM软件跨膜区的预测分析表明,黄花草木樨MoSOS1蛋白具有8个跨膜结构区域,N端和C端都位于细胞外。氨基酸序列分析表明,MoSOS1蛋白含有1个Na+/H+Exchanger superfamily和一个c NMP(Cyclic nucleotide-monophosphate)结合位点以及1个CAP_ED(Catabolite gene activator protein-effector domain)superfamily结构域。生物信息预测显示,MoSOS1的编码蛋白为不稳定酸性蛋白,不存在信号肽,二级结构多为α-螺旋和无规则卷曲。荧光实时定量RT-PCR分析表明:随着Na Cl浓度的增加,黄花草木樨地上部和根中MoSOS1基因表达水平呈增加趋势,根中表达量大于地上部,表明MoSOS1基因的表达受盐胁迫诱导和调节。     

路易斯安那鸢尾LiPCS1基因克隆和表达分析

通过对路易斯安那鸢尾转录组进行分析,获得路易斯安那鸢尾络合素合酶基因(LiPCS1)的中间片段,利用RACE技术分别克隆到其全长,并对该基因进行生物信息学分析。结果表明,该基因全长1 683bp,预测编码501aa,含有半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)和天冬氨酸(Asp)3个必需氨基酸活性位点和重金属离子传感器基序(C368 C369 RMTC373 VRC376),与猴面花等植物同源PCS的相似位点达91.6%。表达分析结果表明,LiPCS1基因在内花瓣表达量最高,与其他组织差异显著,雄蕊、叶和茎的表达量基本在同一水平,外花瓣、根和雌蕊表达较低,雌蕊最低;随着铅处理时间增加,LiPCS1基因表达量在根系和叶片中表现先升高后下降的趋势,在铅处理3h达到最大并且差异显著。