基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC 2015368 β-淀粉酶的热稳定性

运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC2015368β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显著提高的突变体D476N。野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T_(50)值比野生型提高4℃。突变体D476N的K_m值为97.98μmol/L,是野生型(85.86μmol/L)1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的三维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。     

定向引入N-糖基化位点改进黑曲霉β-1,4-内切木聚糖酶热稳定性

【背景】木聚糖是生物圈中仅次于纤维素的第二大多糖,其结构复杂,完全降解需要多种木聚糖酶协同作用。β-1,4-内切木聚糖酶是木聚糖主链水解过程中最关键的酶,已广泛应用于饲料、造纸、能源、食品和医药等行业。但在实际应用中,由于真菌木聚糖酶的热稳定性较差,限制了其在工业中的应用。【目的】提高来源于黑曲霉(Aspergillusniger)的β-1,4-内切木聚糖酶(xynB)热稳定性。【方法】采用氨基酸虚拟突变技术对xynB定向引入一个N-糖基化位点,将虚拟突变后筛选获得的候选突变体和野生型在毕赤酵母SMD1168中表达,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和稳定性分析。【结果】经虚拟突变和筛选获得5个候选突变体,在毕赤酵母SMD1168中成功表达了4个突变体,其中3个突变体发生了糖基化。突变体和野生型酶均表现出宽范围的酸碱耐受性,且突变体xynB~(A92N/D94T)在pH4.0–11.0条件下的稳定性明显优于野生型;糖基化突变体xynB~(A92N/D94T)、xynB~(G66N/A68T)和xynB~(G66F/D67N/G69T)在温度为60–80°C时热稳定性明显高于野生型,xynB~(G66N/A68T)在80°C保温30 min后的残留酶活比野生型提高了约30%。【结论】本研究方法可为其他来源木聚糖酶和其他工业酶的热稳定分子改造提供参考。     

米根霉α-淀粉酶热稳定性的理性设计

真菌α-淀粉酶被广泛应用于麦芽糖浆生产工业,但其热稳定性普遍较差,在制糖工艺中增加了由于酶活力损失而引起的追加生产成本。在充分研究了热稳定性对于真菌α-淀粉酶应用于工业生产的重要性的基础上,为提高米根霉α-淀粉酶(ROAmy)的热稳定性,基于酶蛋白B-factor分析和分子动力学模拟,利用重叠PCR技术分别对ROAmy中的3个氨基酸残基G128、K269和G393进行了单点突变及组合突变。结果表明,所获得的7个突变体均比原酶具有更好的热稳定性,其中效果最好的为组合突变体G128L/K269L/G393P,其在55℃下的热失活半衰期(t_(1/2))约为原酶的5.63倍。同时,该突变体的最适温度由50℃提高到了65℃,最大反应速率(V_(max))和催化效率(k_(cat)/K_m)分别提高了65.38%和99.86%。通过蛋白结构功能比较分析,发现氢键数目的增多或脯氨酸在特殊位置中的引入可能是突变体热稳定性得到提高的主要因素。     

基于柔性区域的计算设计改造玉米赤霉烯酮水解酶热稳定性

来源于粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea的玉米赤霉烯酮水解酶 (ZHD101) 可以有效降解谷物农副产品和饲料中的霉菌毒素玉米赤霉烯酮 (Zearalenone,ZEN),但是,该酶的热稳定性较低,限制了其在工业中的应用。由于水解ZEN的反应没有吸光值的变化,不适合高通量筛选。本文以ZHD101为模式酶,进行计算虚拟突变并结合实验验证。通过比对不同温度下的分子动力学模拟轨迹,选取32个柔性位点;再通过位置特异性评分和酶构象自由能计算,从32个柔性位点上的608个虚拟饱和突变体中筛选出12个突变体。经实验验证,其中3个突变体N156F、S194T和T259F的热熔融温度有一定程度的提升 (ΔTm>4 ℃),且酶活性与野生型类似甚至更高 (相对酶活性为95.8%、131.6%和169.0%)。分子动力学模拟分析显示,导致3个突变体热稳定性提高的可能作用机理分别为NH-π作用力、盐桥重排和分子表面空穴填充。将3个突变体进行迭代组合突变,N156F/S194T表现出最高的热稳定性 (ΔTm=6.7 ℃)。这项工作表明基于柔性区域的虚拟饱和突变在酶稳定性改造上的可行性,探索计算虚拟改造结合实验验证的酶改造策略。     

定点突变提高苯丙氨酸羟化酶的热稳定性

嗜热菌中,蛋白质存在Ala替换Gly以及Arg替换Lys的趋势。为了提高紫色色杆菌来源的苯丙氨酸羟化酶的热稳定性,将该酶中所有Gly突变成Ala,Lys突变成Arg,筛选获得热稳定性提高的突变体,并进行组合突变,对突变酶的酶学性质进行研究。结果表明,突变酶K94R和G221A在50℃的半衰期分别为26.2 min、16.8 min,比原始酶(9.0 min)分别提高了1.9倍、0.9倍,同时组合突变酶K94R/G221A在50℃处理1 h后仍保留65.6%的酶活,比原始酶(8.6%)高出6.6倍。圆二色谱结果显示原始酶和突变酶K94R、G221A及K94R/G221A的T_m值分别为51.5℃、53.8℃、53.1℃和54.8℃。蛋白三维结构模拟推测突变体热稳定性提高机理为:突变体K94R中Arg94与Ile95之间形成额外氢键,稳定其所在的柔性区域;突变体G221A中Ala221与Leu281产生疏水作用,稳定酶分子C-端柔性区。该研究结果为蛋白质热稳定性改造提供了参考,也为苯丙氨酸羟化酶在功能性食品领域的应用奠定了基础。     

N13D、S40E点突变提高木聚糖酶XYNB的热稳定性

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性比XYNB分别提高了24.76%和14.46%;突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22%。在其他性质方面突变酶N13D、S40E与野生型酶XYNB基本相似。通过对木聚糖酶XYNB的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。     

基于结构基础的嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌木聚糖酶CbXyn10C的热稳定性分子改良

【背景】作为降解木聚糖的核心酶种,木聚糖酶可以有效促进木质纤维素的消化水解,在动物养殖领域应用广泛。来源于嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorbescii)的GH10家族木聚糖酶Cb Xyn10C最适温度为85℃,在80℃条件下具有良好的热稳定性,具有饲料工业应用潜力。【目的】为满足饲料制粒尤其是水产饲料加工过程的工艺要求,进一步提高木聚糖酶Cb Xyn10C的热稳定性并阐明其耐热机理。【方法】以Cb Xyn10C晶体结构为基础,采用刚性氨基酸引入、疏水作用网络重排2种策略对其热稳定性进行理性设计,获得在100℃条件下比活提高的单点突变体后,通过有益突变位点叠加策略进一步提升酶的热稳定性,最后采用分子动力学模拟技术分析其热稳定性提高的分子机制。【结果】共获得了4个稳定性提高的单点突变体A45P、T69P、F309V和A325P,其中突变体A45P效果最优。随着在A45P基础上另外3个突变位点的叠加,酶的热稳定性在不损失酶活的前提下得到了逐步提升。获得的四点突变体A45P/F309V/A325P/T69P的耐热性最好,其最适反应温度和熔解温度Tm值较野生型...     

通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性

纳豆激酶（Nattokinase, NK）是一种纤溶酶，可溶解血栓，常用于治疗心血管疾病（CVDs）。然而，野生型NK往往表现出很少的纤溶能力和较低的热稳定性，针对如何提高NK的热稳定性和活性开展研究。使用重叠延伸PCR法将NK中位于194位的Ser替换为Pro，为验证突变后的热稳定性，将野生型NK和突变体S194P均在不同温度下孵育相同时间，使用纤维蛋白板法测定二者酶活，验证热稳定性。成功构建了pET-26b-NK_S194P，测量酶活结果显示，野生型NK和突变体S194P酶活分别达到101.30 IU/mL和123.23 IU/mL，结果表明突变体S194P的酶活比野生型NK高（18.10±2）%，将野生型NK和突变体S194P在60~65 ℃温度下孵育30 min后测量酶活，野生型NK在63 ℃时丧失酶活，突变体S194P在65 ℃时丧失酶活，耐热温度提高2 ℃。结果表明，突变体S194p的蛋白结构在突变后发生了改变，使NK提高了耐热温度。     

过氧化氢酶Ⅰ结构延伸突变改善酶热稳定性的初步研究

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶Ⅰ及其取代突变酶８８（２５）的延伸突变是指在酶蛋白的Ｃ末端上连接一段随机肽链,从而改变了酶蛋白的结构．研究结果表明,这种延伸突变的方法非常有效地提高了酶的热稳定性,并且随机肽链的疏水性与其对应的延伸突变体酶的热稳定性呈现一定的负相关性,即随机肽链的疏水性越高,对应的突变体酶热稳定性越低     

基于空腔填充效应构建伯克霍尔德菌脂肪酶LipA的热稳定性突变体

【目的】中温伯克霍尔德菌胞外脂肪酶LipA在工业领域具有重要的应用价值。利用蛋白质工程技术来提高其热稳定性,对开发脂肪酶LipA酶制剂及提高其应用范围及应用效果,具有重要的意义。【方法】利用生物信息学软件Castp、Voronoia和Cave分析LipA分子中存在的空腔及其组成氨基酸残基;利用FoldX软件构建上述氨基酸残基的突变体电子文库,并基于空腔效应(体积变小)、自由能变化值(降低)和空间结构特点等对前述突变体电子文库进行筛选。从突变体电子文库中选择具有代表性的突变体,通过基因工程技术,引入突变。经诱导表达后,实验验证并筛选出热稳定性的突变体。【结果】构建了一个由58个突变体组成的电子文库;并对其中17个代表性的突变体进行了实验验证;筛选到2个热稳定性有明显提高的突变体LipA-His15Pro和LipA-Ala210Val;其叠加突变体LipA-His~(15)Pro/Ala~(210)Val的T50~(12)较野生型LipA提高了8°C,在55°C下的半衰期较野生型脂肪酶LipA提高了23.1倍。【结论】基于空腔填充技术构建热稳定性伯克霍尔德菌胞外脂肪酶LipA突变体,是一种行之有效的策略。     

过氧化氢酶Ⅰ结构延伸突变改善酶热稳定性的初步研究

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶Ⅰ及其取代突变酶８８（２５）的延伸突变是指在酶蛋白在Ｃ末上连接一段随机肽链,从而改变了酶蛋白的结构,研究结果表明,这种延伸突变的方法非常有效地提高了酶的热稳定性,并且随机肽链的疏水性一与其对应的延伸突变体酶的热稳定性呈现一定的负相关性,即随机肽链的疏水性越高,对应的突变体酶热稳定性越低。     

定点突变引入二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性的研究

拟对来源于华根霉(Rhizopus chinensis)的脂肪酶r27RCL进行二硫键的构建,从而提高该酶的热稳定性。利用二硫键构建软件Disulfide by Design 2. 0预测突变位点(T201),对野生型脂肪酶r27RCL进行定点突变。借助于毕赤酵母表达系统,对脂肪酶野生型r27RCL及突变体r27RCLT201C进行异源表达,并对其酶学性质进行研究和比较。热稳定性实验显示突变体r27RCL-T201C在60℃处理25 min后剩余酶活较野生型提高了17. 6%。此外,突变体的pH稳定性也较野生型有所提高。对脂肪酶r27RCL进行二硫键的构建有助于提高该酶热稳定性,使其能更有效地应用于工业生产。     

金属离子对重组深渊滕黄单胞菌低温α-淀粉酶LamA的活性和稳定性影响

【背景】深渊藤黄单胞菌XH031 (Luteimonas abyssi XH031)是从深海分离到的一株具有很强淀粉降解能力的细菌,前期实验显示其α-淀粉酶LamA在低温环境下仍能保持较高酶活力。若能够提升其热稳定性,会有更好的应用前景。【目的】分析钙离子的存在对LamA热稳定性的影响,并通过钙离子结合位点的关键氨基酸的定点突变,初步明确其作用机制。【方法】在不同的离子条件下检测LamA的热稳定性,利用生物信息学方法预测可能影响钙离子结合及耐热性的氨基酸位点,对目的氨基酸进行定点突变,表达和纯化突变蛋白,并进行功能鉴定。【结果】钙离子明显提高了LamA的热稳定性:在未添加钙离子时,于65°C处理30 min已完全失活;而在5 mmol/L钙离子条件下,于65°C处理30 min后仍具有36%的酶活力。对预测位点进行定点突变后,突变蛋白D200R和H233D/M234C完全失活;N120D、Q185E和T224D活性降低。在未添加钙离子时,突变蛋白稳定性受高温影响程度与野生型差别不大;而在钙离子条件下,N120D在65°C时的酶活力仅为野生型的27.8%,推测位点Asn120与钙离子的结合能够稳定低温酶LamA在较高温度下的结构。【结论】初步明确了钙离子可提升低温α-淀粉酶LamA的热稳定性,为今后相关酶类的工程改造提供理论基础。     

基于多重计算设计策略提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的热稳定性

提高酶的热稳定性是生物催化领域的热点和难点,计算机辅助的理性设计相比于传统的定向进化更加高效,在酶工程领域中的应用越来越广泛和深入。文中以枯草芽孢杆菌脂肪酶A为模式蛋白,首先,利用Rosetta-VIP计算设计对酶的结构空腔进行分析,选择了16个有利于结构空腔填充(ΔΔE0)的单点突变,并以突变位点的溶剂可及表面积和进化保守性为二次筛选依据,测定了其热稳定性与酶活性。有6个单点突变体(F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L)的热稳定性得到了提高,其中Tm值最大提高3.18℃。结果表明,单点突变体满足ΔΔE越低、蛋白溶剂可及表面积减少且符合序列保守性,则得到保留原有酶活力的正向突变的可能性越大。此外,将热稳定性提高的6个单点突变进行迭代组合突变,两点组合突变体的Tm最大提高4.04℃,三点组合突变体的Tm最大提高5.13℃,四点组合突变体的Tm提高了7.30℃,六点组合突变体的Tm提高了7.43℃。因此,基于酶的分子结构的空腔分析、溶剂可及表面积及氨基酸序列保守性计算的多重虚拟筛选方法,可有效提高酶的热稳定性。     

扩展青霉脂肪酶K56R叠加突变对热稳定性的影响

目的:扩展青霉脂肪酶随机突变体ep8是一株热稳定性比野生型有所提高的突变体.获得热稳定性提高的优良菌株.方法:在ep8的基础上利用重叠延伸PCR构建叠加突变重组质粒pPIC3.5K-ep8一K56R,将该质粒电转毕赤酵母(Pichia paaoris)GS115进行异源表达.结果:该叠加突变脂肪酶在毕赤酵母中获得了活性表达.15%SDS-PACE结果分析表明突变脂肪酶PEL-ep8-K56R-GS分子量与野生型PEL-GS一致,约为28kDa.叠加突变脂肪酶在37℃时酶活为852U/mL、野生型为760u/mL、随机突变体为824u/mL,叠加突变体酶活相比野生型提高了21.1%,相比随机突变体提高了3.4%.热稳定性分析数据表明叠加突变脂肪酶Tm值为40.1℃、野生型为38.7℃、随机突变体为39.9℃,Tm值相比野生型提高了1.4℃,相比随机突变体提高了0.2℃.     

定向进化提高来源于Arthrobacter ramosus的MTHase的热稳定性

麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mahosyhrehalose hydrolase,MTHase)是以淀粉或麦芽糊精为底物制备海藻糖的关键酶之一.来源于Arthrobacter ramosus的MTHase,表达量好,比活高,但热稳定性差,限制了其工业化应用.采用定向进化技术,筛选得到L137M和A216T两个突变体,在60℃...     

技术与方法理性设计改造牛肠激酶的热稳定性

以牛肠激酶作为研究对象,利用理性设计的方法提高其热稳定性。首先通过分子动力学模拟软件Gromacs v 4.5.5,FlexService以及B-FITTER软件预测出了肠激酶的柔性区Fragment 64～69,Fragment 85～90;然后结合β-转角序列统计学信息以及引入位置原有的残基不参与形成氢键的原则,确立了3个突变位点S67P,R87P以及Y136P;通过Quik Change^TM 定点突变的方法引入突变位点,并进行了酶热稳定性分析。结果表明,R87P突变体酶的失活半衰（t_1/2）和T₅₀¹⁰ 较野生型分别提高了3.1 min和11.8℃,同时,动力学常数（K_m/k_cat）测定结果显示酶活未受到显著影响。该策略有潜力应用于其他工业酶分子的热稳定性改造,为推动生物酶的工业化应用奠定基础。     

地衣芽胞杆菌来源角蛋白酶N端对活力及其热稳定性的影响

【目的】通过对一株地衣芽孢杆菌来源的角蛋白酶N端进行分子改造,研究其对角蛋白酶活力和热稳定性的影响,进而提高角蛋白酶的热稳定性。【方法】将角蛋白酶N端前5个氨基酸进行分段缺失,并通过序列比对将N端的前5个氨基酸替换为来源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜热蛋白酶的N端,将野生型和突变体角蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中进行表达,并对重组酶进行纯化与酶学性质研究。【结果】角蛋白酶N端不同长度的缺失大幅度地降低了角蛋白酶的活力,其中缺失前5个氨基酸完全丧失了酶活力。将角蛋白酶N端前5个氨基酸替换为嗜热蛋白酶N端前12个氨基酸,虽然降低了近70%的活力,但是却增加了角蛋白酶的热稳定性,60°C条件下的半衰期t1/2由原来的9 min提高到20 min。【结论】角蛋白酶的N端对其酶活力具有较大的影响,与嗜热蛋白酶来源的N端进行替换可以有效提高角蛋白酶的热稳定性。     

基于融合双亲短肽提高葡萄糖氧化酶的热稳定性

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,简称GOD)可氧化葡萄糖生产葡萄糖酸及其衍生物,在新型无抗饲料添加剂的开发中具有良好的应用潜力,但其生产加工过程中尚存在热稳定差的瓶颈问题。本研究采用融合双亲短肽技术提高葡萄糖氧化酶的热稳定性,分别选取8种不同氨基酸长度、不同Linker连接的双亲短肽(Self-assembling peptides,SAPs)融合至黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶的N端,构建了8种融合型酶SAP1-GS-GOD、SAP1-PT-GOD、SAP2-PT-GOD、SAP3-PT-GOD、SAP4-PT-GOD、SAP5-PT-GOD、SAP6-PT-GOD、SAP7-PT-GOD,并在毕赤酵母GS115中异源表达。获得的连接PT Linker的融合酶在60℃下孵育60 min后的相对酶活均高于初始酶。其中,融合酶SAP5-PT-GOD在60℃下孵育30 min的相对酶活为67%,是相同处理条件下初始酶相对酶活的10.9倍。同时,融合酶SAP1-PT-GOD、SAP2-PT-GOD、SAP3-PT-GOD、SAP5-PT-GOD的K_(cat)/K_m值较初始酶均有进一步的提高。研究表明,在葡萄糖氧化酶的N端融合以PT为Linker的目标双亲短肽能有效提高葡萄糖氧化酶的热稳定性,通过对融合酶分子内作用力进行分析,酶分子内氢键的增加对融合酶热稳定性的提高效果最为显著。上述研究获得的热稳定性提高的融合葡萄糖氧化酶及其效果机制分析对提高酶在加工和应用过程中的活性具有重要的研究意义和应用价值。     

结构指导的玉米赤霉烯酮水解酶的热稳定性改造

玉米赤霉烯酮是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌(Fusarium)毒素,严重危害牲畜以及人类的健康。来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase,ZHD)能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮,然而饲料加工中的高温环境限制了该酶的应用。基于结构特征的理性设计可为酶的热稳定性改造提供指导。本研究首先基于蛋白质结构比对(multiple structure alignment, MSTA)筛选ZHD的结构灵活区,随后基于序列保守性打分以及构象自由能计算设计突变文库,得到基于136号和220号残基的9个单点突变设计。结果表明,9个突变体的热熔融温度(Tm)提高了0.4–5.6℃,其中S220R和S220W热稳定性表现最好,Tm分别提高了5.6℃和4.0℃,45℃下的热半失活时间分别延长了15.4倍和3.1倍,相对酶活分别为野生型的70.6%和57.3%。分子动力学模拟分析表明突变位点及附近区域的作用力得到了增强,突变体S220R和S220W的220-K130氢键成键概率分别增加了37.1%和19.3%、K130-D223盐桥成键概率分别增加了30.1%和12.5%,为ZHD热稳定性的提高作出了贡献。这项工作表明结合天然酶的结构比对、序列分析及自由能计算的热稳定性改造策略的可行性,并获得了热稳定性增强的ZHD变体,为ZHD在工业上的应用打下基础。