KISS-1/GPR54基因及其在生殖中的作用

KISS-1及其受体GPR54基因对青春期的正常启动具有重要作用。青春期开始前后, 动物下丘脑中KISS-1和GPR54 mRNA水平很高, Kisspeptins(KISS-1基因产物)通过激活GPR54增加促性腺激素的释放, KISS-1基因的表达受性腺类固醇激素的调控。GPR54基因突变可以导致人和鼠的特发性促性腺激素分泌不足性腺机能减退症和促性腺激素依赖性性早熟。文章还介绍了KISS-1、GPR54基因的结构、表达、多态性以及和其它生殖调控因子之间的相互关系。     

小梅山猪Ghrelin基因的克隆及其在生殖轴的表达

以小梅山母猪为试验材料,通过RT-PCR、克隆及荧光定量,研究Ghrelin在其生长发育不同阶段生殖轴表达情况,旨在探究Ghrelin对动物繁殖性能的影响。结果表明,初生、初情期至性成熟卵巢Ghrelin mRNA表达量呈上升趋势,不同阶段间差异显著(P<0.05)。性成熟时生殖轴不同组织Ghrelin mRNA表达量,卵巢明显高于垂体和下丘脑(P<0.05),而垂体与下丘脑间差异则不显著(P>0.05)。     

牦牛Endothelin-1基因CDS序列克隆及其真核表达质粒构建

Endothelin-1主要通过促进血管平滑肌细胞增殖引起血管结构和功能的改变,从而刺激血管收缩,Endothelin-1在动物血管生成和低氧适应等关键发育和生理过程发挥重要的作用。为了进一步探讨高原动物脑Endothelin-1对其极端低氧适应调控的分子机理,本研究对牦牛(Bos grunniens)脑Endothelin-1基因CDS全长序列进行了克隆及其真核表达载体的构建。结果表明,牦牛Endothelin-1基因的CDS全长序列含有一个609bp的开放阅读框,编码202个氨基酸,该蛋白分子量为22.98 kDa,理论等电点（pI）为9.63;成功构建出带有CMV启动子,绿色荧光蛋白标记的牦牛Endothelin-1真核表达质粒pEGFP-C1-Endothelin-1;牦牛Endothelin-1基因CDS全长序列编码的氨基酸序列与黄牛(Bos taurus)、藏羚羊（Pantholop shodgsoni）、绵羊(Ovis aries)、野猪(Sus scrofa)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的同源性分别为100%、95%、93%、81%、77%、70%;且该氨基酸序列的系统进化情况与其亲缘关系远近一致。因此,我们认为高原动物牦牛Endothelin-1的结构和功能在进化上均具有高度保守性,其在低氧适应中的作用可能是通过表达差异或转录后修饰实现的,且本研究构建的真核表达质粒为进一步探讨该基因在青藏高原动物脑对极端低氧生境适应中的生物学功能及其调控机理提供了支持。     

牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析

旨在对牦牛CAV-3基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在牦牛组织中的表达规律进行初步研究。根据Gen Bank数据库中已知的黄牛CAV-3基因的m RNA序列并设计特异性引物,应用RT-PCR技术克隆牦牛CAV-3基因的编码区。运用生物信息学方法,分析并预测牦牛Caveolin-3蛋白的理化性质、疏水性、蛋白结构域以及蛋白质二级结构。通过半定量PCR技术检测CAV-3基因m RNA在牦牛和黄牛各组织中的表达;利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和黄牛肌肉组织中CAV-3基因m RNA表达水平。牦牛CAV-3的编码区全长631 bp,共编码151个氨基酸。CAV-3在牦牛肺、脾脏、肾脏、肝脏、卵巢组织中均不表达,仅在心脏和肌肉组织中表达,且在心脏组织的表达水平高于肌肉组织,CAV-3基因在黄牛各组织中的表达结果与牦牛一致。CAV-3基因在牦牛肌肉中的表达低于黄牛肌肉组织,但差异不显著(P0.05)。     

牦牛LIFR 基因的克隆及其在繁殖周期卵巢中的表达

白血病抑制因子受体(LIFR)与白血病抑制因子(LIF)结合,在排卵、胚胎发育及胚胎附植等过程中起重要的调节作用,与哺乳动物生殖过程密切相关。为进一步研究白血病抑制因子受体(LIFR)基因在卵巢中的表达,本研究对牦牛LIFR 基因进行克隆和序列分析,并利用RT-PCR 技术研究其在繁殖周期卵巢中的表达情况。本研究克隆得到牦牛3 329 bp 的LIFR 基因cDNA 序列,内含3 288 bp 开放阅读框序列。与家牛的相应序列具有很高的同源性(99 5% ),表明LIFR 基因在进化过程中较为保守。实时定量RT-PCR 检测LIFR 基因在繁殖周期卵巢中的表达,结果显示卵巢中LIFR 基因在妊娠期表达最强。表明LIFR 基因在牦牛繁殖周期中具有不可忽视的作用。     

牦牛TSHB、DIO2和DIO3基因的克隆及其在繁殖轴的表达研究

为了解TSHB-DIO2/DIO3系统对牦牛季节性发情的调控机制,以牦牛为研究对象,运用RT-PCR方法克隆牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因的cDNA序列,结合GenBank已公布的普通牛TSHB、DIO2、DIO3基因序列,构建遗传进化树,采用荧光定量PCR技术检测其在牦牛下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫中的表达水平。结果表明,牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因均与普通牛有最近的分子进化关系;TSHB基因CDS区为417 bp,在垂体中的表达水平高于其他组织,差异极显著(P0.01);DIO2基因cDNA为951 bp,在所检测的组织中均有表达,且在子宫中的表达水平高于其他组织,差异极显著(P0.01);DIO3基因cDNA为873 bp,在子宫组织中未检测到表达,在卵巢中的表达水平高于垂体、下丘脑和输卵管,差异极显著(P0.01)。提示TSHBDIO2/DIO3可能参与牦牛繁殖调控,旨为揭示牦牛季节性繁殖分子调控机制提供参考。     

牦牛OB基因的克隆及原核表达

肥胖基因(obese gene,OB gene)表达产物瘦蛋白(leption)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能。通过牦牛脂肪组织总RNA的提取,利用RT-PCR克隆出牦牛OB基因的成熟肽cDNA,构建OB基因的原核表达载体OB-pET32a(+),在大肠杆菌表达系统使融合蛋白表达,通过SDS-PAGE检测所表达的融合蛋白。结果表明,克隆的OB基因成熟肽片段为456 bp包含EcoR I和BamH I两个酶切位点,与普通牛、瘤牛该基因的相似性达98.6%。原核表达产物为包涵体形态,大小为31 kD,符合预期结果,为OB基因的高效表达系统的构建奠定基础。     

牦牛MC1R基因的克隆测序及其分析研究

以麦洼牦牛、斯布牦牛、天祝牦牛和九龙牦牛为研究对象,对黑色素皮质素受体1(Melanocortin receptor I,MCIR)基因编码区进行了克隆测序及分析.结果表明,牦牛的MC1R基因编码区全长954 bp,编码317个氨基酸:4个牦牛品种间及与普通牛间在MC1R基因的编码区内共有13个碱基差异,无碱基的插入和缺失现象,编码蛋白共有9个氨基酸差异.MC1R蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,有糖基化位点和7个跨膜区.系统进化分析显示,麦洼牦牛与斯布牦牛的MC1R基因相似性最近.本研究结果时今后开展MC1R基因与牦牛毛色性状的相关性分析以及牦牛的毛色遗传机理、基因定位、基因表达调控等研究具有重要的意义.     

牦牛Eppin基因CDS的克隆及其在附睾不同区段中的表达研究

为了研究牦牛附睾组织中精子成熟的相关机理,并为探讨高原动物的生殖机制提供基本数据。本研究运用基因克隆技术对牦牛附睾Eppin基因CDS全长序列进行克隆,采用生物信息学方法进行分析,Eppin基因和编码序列特征进行了预测和分析。结果表明,牦牛Eppin基因的CDS含有一个405 bp长度的片段,由134个氨基酸编码;牦牛Eppin基因对应的蛋白分子量和理论等电点分别为15.09 ku和8.67 ku,其对应的氨基酸没有跨膜结构,归于近水性蛋白;25个α-螺旋、27个延伸链、2个β-折叠及80个无规则卷曲构成其蛋白质二级结构;牦牛Eppin基因编码氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。本研究应用实时荧光定量PCR技术分析Eppin基因在附睾组织3个不同区段(头部,颈部和尾部)中的表达情况,荧光定量PCR结果显示,Eppin基因在牦牛附睾组织3个不同区段中均有不同程度的表达,在附睾头部中表达最高,颈部和尾部表达较低。本研究将为牦牛附睾精子成熟的机制和Eppin基因在牦牛附睾上皮细胞中的功能提供一定的基础数据。     

菘蓝牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶基因(IiGGPPS1)的克隆及其表达特性分析

本研究通过分析菘蓝转录组数据库得到一条牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)的编码序列,利用RT-PCR扩增得到其全长,命名为Ii GGPPS1,利用生物信息学方法对该基因及其编码的蛋白进行分析,并对该基因的功能、表达特性进行了研究。研究结果表明:Ii GGPPS1的c DNA序列全长为1 086 bp,开放阅读框长1 080 bp,编码359个氨基酸。Ii GGPPS1蛋白与其它植物GGPPSs高度保守,蛋白N端含有叶绿体信号肽,二级结构主要由螺旋和无规则卷曲组成,同源建模结果显示Ii GGPPS1蛋白是个同源二聚体。组织特异表达分析表明该基因在叶片中的表达量最高,根中次之,茎中最低,且受虫害颜色浅的叶片中该基因表达量显著低于正常叶片中的表达量,推测该基因可能与二萜化合物叶绿素的合成相关。该结果将为进一步研究菘蓝牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶基因(Ii GGPPS1)的功能及其表达调控奠定理论基础,也可为菘蓝的生长、发育调节与品质改良积累研究资料。     

牦牛HORMAD1基因的克隆及生物信息学分析

利用分子克隆技术获得了牦牛HORMAD1基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等方面进行了预测和分析.结果表明,牦牛HORMAD1基因包含一个长度为1 182 bp的开放阅读框,编码393个氨基酸;其编码蛋白属于亲水性蛋白,无明显的信号肽,含有很多个磷酸化位点.二级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主.HORMAD1基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,牦牛HORMAD1与黄牛、马和猪等物种的HORMAD1氨基酸遗传距离较近,具有高度相似性.     

牦牛CAPN1基因的克隆与序列分析

CAPN1是影响肌肉嫩度的数量性状位点 (QTL)的候选基因。根据GenBank发表的普通牛CAPN1基因序列设计特异性引物,以天祝白牦牛cDNA为模板,分段进行PCR扩增,克隆,测序。应用生物软件BioEdit对各测序结果进行序列拼接共获得牦牛CAPN1 cDNA 片段2267bp,其中包含一个2151bp的完整的开放阅读框(ORF),以及3’和5’末端非编码区的部分序列(77bp和166bp) 。分析表明：牦牛CAPN1基因编码区全长2151bp,共编码716个氨基酸。与已报道的牛,猪,人小鼠的序列进行比较,核苷酸同源性分别为99.3%,93.9%,90.0% ,85.5% 。预测氨基酸的同源性分别为99.4%,96.1%,94.6%,89.0%,并且对牦牛CAPN1四个结构域分别进行NCBI BLAST发现四个结构域在以上四个物种中都显示出很好的保守性,最为保守的在结构域Ⅳ(>96%)。牦牛与牛产生的 14个核苷酸突变中,有3个产生了氨基酸突变,均发生在结构域Ⅲ。构建分子系统进化树表明：聚类结果与传统分类学相符。     

大麦HvLEC1基因的克隆及其表达特征分析

植物LEC蛋白是NF-Y转录因子的一类B亚基,在植物胚状体形成过程中起重要作用。为了研究大麦小孢子体外培养形成胚状体的机理,本研究利用RACE技术在大麦中克隆了一个新的LEC基因,该基因cDNA全长为1004 bp,开放阅读框全长为597 bp,编码198个氨基酸,其蛋白1~59位氨基酸含有LEC结构域,命名为HvLEC1。HvLEC1在大麦的根、茎、叶和小孢子培养过程中均能表达,其中小孢子培养7 d时表达量最高,且HvLEC1在大麦品系BI04中的表达量比基19高,BI04愈伤产量也比基19高,表明HvLEC1表达量和愈伤产量有相关性,受盐胁迫后HvLEC1在大麦的根中快速上调表达,提示HvLEC1可能不仅参与小孢子胚状体发生,而且参与盐胁迫响应。     

牦牛SND1基因特征序列分析及其蛋白在乳腺的表达

Staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1（ SND1,Tudor-SN）是一种参与基因调控的转录共激活因子蛋白,本研究意在克隆牦牛泌乳相关基因SND1,分析其生物特性,研究其蛋白在乳腺的表达。采集牦牛泌乳期乳腺组织,胰蛋白酶消化法得到原代乳腺上皮细胞,纯化到3代, 采用RT-PCR扩增克隆SND1基因,测序并拼接,并用相关生物信息软件分析牦牛SND1基因特性;用免疫组织化学和免疫荧光技术对牦牛SND1基因编码蛋白进行定位分析。获得如下结果：牦牛SND1基因全序列为3294 bp,含有2733 bp的ORF,共包含20种氨基酸。SND1基因编码蛋白为非分泌蛋白,非跨膜蛋白;同源性分析显示,牦牛SND1基因与野牛、家牛、藏羚羊、山羊、猪、野骆驼、马、黑猩猩、人、褐家鼠的同源性分别为99%、98%、96%、94%、91%、90%、90%、89%、89%、85%;系统进化树表明与野牛和家牛的进化水平较近,与人和鼠的进化水平较远。免疫组织化学染色结果显示,SND1蛋白在分泌上皮细胞（乳腺上皮细胞）和导管上皮细胞呈阳性高表达,在肌上皮细胞呈弱表达。免疫荧光显示,SND1蛋白在乳腺上皮细胞胞核高表达,胞质弱表达。上述研究结果为进一步探究SND1对牦牛泌乳机能的调节提供了相关依据,也为高寒哺乳动物的研究提供了参考资料。     

牦牛CAPN3基因的克隆及组织表达特异性

以牦牛背最长肌为材料,采用RT-PCR法克隆了CAPN3基因的CDs区,并对其进行生物信息学分析。结果表明,牦牛CAPN3基因的CDs区长2 469 bp,编码822个氨基酸残基;生物信息学分析显示,其编码的蛋白属于非分泌表面蛋白,含有35个磷酸化位点,主要在细胞质和细胞核中发挥生物学作用。二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、伸展链和β-转角组成,具有Cys Pc、calpain-Ⅲ和EFh家族蛋白结构域,无信号肽。牦牛CAPN3基因与黄牛、绵羊和猪在系统发育树上的距离最近。运用实时荧光定量分析CAPN3在不同组织中的表达量,CAPN3基因在牦牛的7种组织中均有表达,但在背最长肌、胰脏中的表达量较高。     

牦牛CSRP3基因的克隆及组织表达分析

CSRP3基因(Cysteine and glycine-rich protein 3,CSRP3)编码CRP3蛋白,是一个肌发生的正调节因子,可通过多种方式在肌肉发育和肌肉细胞结构维持中起重要作用。通过对牦牛CSRP3基因进行克隆及组织表达谱分析,为后续提高牦牛肉品质的研究提供基础数据。采用RT-PCR方法克隆牦牛CSRP3基因CDS区;再对其进行序列分析及蛋白结构和功能预测等生物信息学分析;最后利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在牦牛不同组织中的表达量。牦牛CSRP3基因CDS区长585 bp,编码194个氨基酸;CSRP3基因的系统进化树结果显示,牦牛与黄牛的亲缘性最近,其次是绵羊。牦牛CSRP3基因编码的蛋白为偏碱性不稳定亲水蛋白,无跨膜结构和信号肽,为非分泌蛋白,含有磷酸化位点22个,N-糖基化位点2个,O-糖基化位点7个;存在两个LIM结构域,属于LIM结构域蛋白质超家族成员,主要分布于细胞核中;二级结构以无规卷曲为主,三级结构的最佳模型为1b8t.1.A;实时荧光定量PCR结果显示,牦牛CSRP3基因在臀大肌中有较高表达量。生物信息学分析结果显示,CRP3蛋白含有两个LIM结构域,主要分布在细胞核中,实时荧光定量PCR结果显示牦牛CSRP3基因在臀大肌中具有较高表达量,为牦牛CSRP3基因在牦牛肉品质方面的调控机制研究提供了基础数据。     

HPV16 l1基因的克隆及其在真核细胞中的表达

克隆并表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期基因l1,以期为研制防治宫颈癌的DNA疫苗奠定基础.本实验采用PCR方法从质粒p16L1BN1中获得HPV16l1基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体中,核酸序列鉴定HPV16l1基因真核表达质粒构建成功,再用脂质体介导基因转染7721人肝癌细胞.转化阳性细胞经SDS-PAGE显示在分子量大约为55kDa的位置出现一条特异性条带,与HPV16L1分子量大小相符.表达产物经Western blotting分析能与HPV16L1单克隆抗体特异结合.真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1构建成功并能在真核细胞7721中有效表达,为下一步进行动物DNA免疫实验奠定了基础.     

文昌鱼sfy1基因的克隆及其在早期发育中的表达

文昌鱼是公认现存最接近于脊椎动物的一种头索动物,具有与脊椎动物相似但简单得多的身体图式[1],因而是研究脊椎动物发育机制起源和进化的宝贵材料,也是发育生物学的经典实验模型之一.近年来,人们在对果蝇和脊椎动物发育分子机制的研究取得了一系列重大突破之后,利用发育调控基     

HPV16l1基因的克隆及其在真核细胞中的表达

克隆并表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期基因l1,以期为研制防治宫颈癌的DNA疫苗奠定基础。本实验采用PCR方法从质粒p16L1BN1中获得HPV16l1基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体中,核酸序列鉴定HPV16l1基因真核表达质粒构建成功,再用脂质体介导基因转染7721人肝癌细胞。转化阳性细胞经SDS-PAGE显示在分子量大约为55kDa的位置出现一条特异性条带,与HPV16L1分子量大小相符。表达产物经Western blotting分析:能与HPV16L1单克隆抗体特异结合。真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1构建成功并能在真核细胞7721中有效表达,为下一步进行动物DNA免疫实验奠定了基础。