刺槐核糖体蛋白同源基因RpRPL22在共生结瘤过程中功能研究

目的: 核糖体蛋白(RPs)属于多功能蛋白,能够参与调控细胞生长和响应胁迫条件。RpRPL22是一个从豆科植物刺槐中分离得到的结瘤相关基因,通过序列比对发现其与核糖体大亚基蛋白RPL22高度同源。对其如何通过调控根瘤菌侵染而在共生结瘤过程中发挥重要作用进行了较为深入的探索。方法: 利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析RpRPL22在接菌后不同时间及不同植物组织的表达变化。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得目的基因cDNA全长。通过GFP报告基因进行RpRPL22亚细胞定位分析。通过Gateway BP重组技术构建RNA干扰(RNAi)重组载体,借助电转化法将重组载体转至农杆菌K599,利用农杆菌介导植物根部,接菌后观察和测量植株表型。首先从宏观水平统计观察目的基因是否对结瘤过程有影响,其次从分子水平揭示目的基因在共生结瘤过程的重要功能。结果: 不同接菌时期、不同植物组织目的基因qRT-PCR相对表达量结果显示,几乎在所有取样的接菌时间,目的基因RpRPL22在接菌根中的相对表达量都低于未接菌对照根,只有接菌后第25天除外。在成熟的根瘤中,接菌后第25天该基因的表达量也最高。洋葱表皮和毛状根亚细胞定位结果均显示在椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子控制下,RpRPL22融合绿色荧光蛋白GFP的荧光信号在细胞核和细胞质有明显的表达。RNAi转化植株的表型统计观察结果,比如植株鲜重、植株的有效结瘤数目较对照组均有明显的降低;同时RNAi转化植株在根瘤菌侵染过程形成的侵染线数目和根瘤原基数目较对照均显著降低。根瘤切片实验用于观察根瘤显微超微结构,结果显示RNAi植株根瘤中固氮区的受菌侵染细胞数目与对照相比明显减少。电镜观察根瘤单个受菌侵染细胞中类菌体形态显示,RNAi根瘤中类菌体侵染细胞胞体多呈不规则形状,皱缩变形严重,环类菌体周间隙空间增大,多共生体融合,表现出细胞凋亡的迹象。对照根瘤中的受菌侵染细胞胞体多呈圆形椭圆形,胞质饱满丰富且分布均匀,细胞发育正常,表明RNAi植株根瘤发育过程明显受阻。结论: 核糖体蛋白(RP)能够参与调控豆科植物共生结瘤过程,相关同源基因RpRPL22可能在起始根瘤菌侵染植物和阻止类菌体降解过程中起重要作用。     

细胞粘附分子P-selectin功能片段在CHO细胞表面的锚定表达

为了筛选出针对细胞粘附分子P-selectin的特异性抗体, 克隆了P-selectin功能性基因片段, 使其通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定表达于真核细胞的细胞膜上, 以用作筛选的抗原。提取人血小板的总RNA, RT-PCR扩增出P-selectin目的基因片段, 同时用重叠延伸PCR的方法合成细胞膜锚定信号肽GPI基因; 将二者按上下游顺序插入含有弱化neo基因的真核表达载体pMCEw2中; 并将构建的重组质粒pMCEw2-GPI-P-selectin转染CHOdhfr-细胞, G418筛选获得阳性细胞株, 利用ELISA、免疫印迹和免疫荧光法检测P-selectin的表达。实验证实了P-selectin在细胞膜上获得稳定表达。为进一步进行抗P-selectin的特异性抗体的筛选提供了必要前提。     

华癸中生根瘤菌共生质粒的定向标记、消除与结瘤功能的鉴定

采用Tn5-mob-sacB转座子对华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)菌株7653R的共生质粒进行定向标记,获得该质粒标记菌株7653RT14.利用sacB基因对蔗糖的敏感性,对标记质粒进行消除实验,获得7653R的共生质粒消除突变株7653R-1.测得Tn5-mob-sacB转座频率高于10-5.突变株的培养特征与出发菌株基本一致.采用琼脂管法对7653RT14和7653R-1进行回接实验,结果显示7653RT14能正常结瘤固氮,表明Tn5的插入并未影响其共生能力,但失去共生质粒的7653R-1则为不结瘤或只结个别小瘤.稳定性实验结果表明供试菌株的标记质粒在本实验条件下是稳定的,可以作为共生质粒转移的供体菌.     

GABA/孕酮激发豚鼠精子聚磷酸肌醇降解及其在顶体反应中的作用

为了研究GABA/孕酮(P₄)激发精子聚磷酸肌醇(PPI)降解及其在顶体反应(AR)中的作用,将豚鼠精子在MCM培养基获能培养5.5 h,³²P-标记精子1h,经Percoll密度梯度离心洗涤,然后以AR刺激剂激发精子AR,并对精子膜脂进行提取、分离和鉴定,同时,以相差显微镜评价精子AR%.结果为:(i)GABA刺激二磷酸磷脂酰肌醇(PIP₂)和一磷酸磷脂酰肌醇(PIP)迅速降解,而磷脂酸(PA)增加;在5min时PIP₂和PIP明显下降,10min几近完成,而AR明显滞后,15min才达到峰值;(ii)A23187,P₄和GABA均可激发PPI降解和AR增加,其能力依次为A23187＞P₄≥GABA;(iii)新霉素可明显地抑制Ca²⁺/GABA 或P₄及A23187刺激PIP₂和PIP降解、PA产生和AR增加;(iv)PPI降解需Ca²⁺参与.当EGTA或Ca²⁺通道阻滞剂(La³⁺)存在时,PIP₂和PIP降解,PA产生和AR升高均被明显抑制.上述结果表明,天然激动剂GABA或P₄刺激豚鼠精子膜PPI降解是引起AR的基础,该作用是通过Ca²⁺介导、激活膜磷脂酰肌醇特异磷脂酶C(PIC)而完成的.     

丛枝菌根形成过程及其信号转导途径

丛枝菌根是由一类土壤中古老的丛枝菌根真菌与植物根系形成的互利互惠共生体。通过共生作用丛枝菌根真菌帮助宿主植物提高水和矿质营养（特别是磷）的吸收效率。作为回报,大约20%的光合作用产物被转移到丛枝菌根真菌中,供其完成自身的生活史。丛枝菌根形成的过程中,需要植物与丛枝菌根真菌之间进行一系列信号分子的识别、交换以及信号转导作用,这一过程由一系列植物和菌根真菌的基因控制。首先,植物会分泌一种植物激素——独角金内酯来诱导菌根真菌加速分支,而菌根真菌也会分泌脂质几丁寡糖促进植物与其形成菌根。加速分支的菌根真菌接触到植物根部以后,会附着在植物根的表皮并形成附着胞,通过附着胞穿透植物根的表皮,最后进入维管组织附近的皮层细胞并在其中不断进行二叉分支,形成特有的丛枝结构。通过对模式植物共生现象的研究,已经发现很多植物基因参与到共生形成的信号转导过程中,包括早期植物反应的基因、菌根与根瘤共生共同需要的转导因子以及菌根特异的信号分子等。本文对菌根的形成过程及信号转导途径进行详细的介绍,为人们深入研究菌根关系提供参考。     

大豆快生根瘤菌SMH12效应蛋白NopP在共生固氮过程中的功能

【目的】研究Sinorhizobium fredii SMH12中的nopP在共生固氮过程中的功能,为深入解析根瘤菌效应蛋白的菌植互作机理提供线索,进而为大豆高效根瘤菌的遗传改良提供一定的科学依据。【方法】利用生物信息学分析nopP的结构特征,构建nopP缺失、过表达和互补菌株,并对其进行共生表型分析;通过qRT-PCR分析nopP在共生过程中的时空表达特征,测定在接野生型和突变体的冀豆17中NIN、ENOD40、PR1、PR2和PR5的表达量;采用激光共聚焦显微镜观察NopP的亚细胞定位。【结果】根瘤菌的NopP不包含任何已知功能域,与病原体的任何Avr效应物没有同源性。nopP缺失之后对冀豆17和中黄13的根瘤固氮酶活均有显著影响,在瘤数上对冀豆17有显著增加,表明nopP突变后促进其与冀豆17和中黄13的共生固氮。qRT-PCR显示,nopP在自生条件下少量表达,在共生条件下表达量显著升高,尤其在接菌2 d后表达量达到最高,显示该基因可能与根瘤菌早期侵染相关。此外,发现NopP在烟草叶片和大豆根中均定位于细胞膜和细胞核。接种突变体的冀豆17根中NIN的表达量升高1.2倍,PR5的表达量降低3.6倍。【结论】效应蛋白NopP在与大豆共生过程中,参与根瘤菌的早期侵染以及在根瘤菌与豆科宿主植物之间的免疫防御反应中发挥重要功能。     

PH结构域的结构和功能研究进展

PH结构域是一种存在于多种信号转导蛋白和细胞骨架蛋白中的大约由120个氨基酸组成的功能性区域.不同蛋白质中的PH结构域在一级结构上的同源性并不很高,但其空间结构中肽链主链的折叠方式基本相同,而主要差别存在于其中的三个可变环上,含有这些环的侧面带有正电荷,被认为可能是其配体的结合部位.目前已知的配体有G蛋白βγ亚单位（Gβγ）、蛋白激酶C（PKC）和磷脂酰肌醇衍生物（PIP₂或IP₃）,所以PH 结构域可能介导信号蛋白与这些分子间的相互作用,参与细胞信号转导网络的构成.     

在结瘤基因nodA启动子内发现了两个不同功能的结构区域

豌豆根瘤菌(Rhizobium Leguminosarum)结瘤基因nod A的启动子内发现了具有两个不同功能的结构区域：其一我们称为Rip在nodA诱导表达中起着关键作用,可能识别经诱导剂作用而发生构象变化的调控蛋自NodD;另一为Rip缺失后留下的,我们称为Rp区。只要Rp存在,不需要诱导荆,NodD蛋白即能导致结瘤基因nodA的表达。因此该区可能识别原始构象的调控蛋白NodD。     

蛋白激酶B及其在磷脂酰肌醇3-激酶介导的信号转导中的作用

蛋白激酶Ｂ（ＰＫＢ）是原癌基因ｃ－ａｋｔ的表达产物,它参与由生长因子激活的经磷脂磷肌醇３－激酶（ＰＩ３Ｋ）介导的信号转导过程。与许多蛋白激酶相似,ＰＫＢ分子具有一特殊的ＡＨ／ＰＨ结构域（ＡＨ／ＰＨｄｏｍａｉｎ）,后者能介导信号分子间的相互作用。ＰＫＢ是ＰＩ３Ｋ直接的靶蛋白。ＰＩ３Ｋ产生的脂类第二信使ＰＩ－３,４,Ｐ２和ＰＩ－３,４,５－Ｐ３等均能与ＰＫＢ和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶（ＰＤＫ）的ＡＨ／Ｐ     

病毒蛋白脂酰化及其功能

脂酰化是一种重要的蛋白翻译后修饰,主要包括棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊烯化和糖基化磷脂酰肌醇(GPI)共价结合4种方式。不同的病毒蛋白可发生不同类型的脂酰化,其生物学功能也会发生相应改变。棕榈酰化通常能增强病毒跨膜蛋白的疏水性,调节这些蛋白的胞内运输及定位,进一步影响病毒感染过程中的膜融合、病毒颗粒装配及释放等步骤。豆蔻酰化则可调控病毒蛋白表面的正电荷强度,使病毒蛋白与脂质膜的亲和力改变,如preS1豆蔻酰化加强乙型肝炎病毒(HBV)和丁型肝炎病毒(HDV)的受体识别能力及感染性,而人类免疫缺陷病毒(HIV)Nef豆蔻酰化为病毒感染及免疫应答所必需。异戊烯化能使病毒游离的蛋白与膜结合,并介导蛋白间的相互作用,如大HDV抗原(L-HDAg)异戊烯化有利于其运输至内质网膜上,与HBV表面抗原(HBsAg)及HDV RNA共同形成HDV颗粒。此外,一些病毒蛋白与GPI通过共价结合形成复合物,GPI基团可改变感染细胞的膜结构及胞质内磷脂构成,如GPI与朊蛋白(PrP)结合导致细胞型朊蛋白(PrPc)交联或羊痒疫朊蛋白(PrPsc)聚集,与朊病毒引起的海绵样病变有关。进一步了解病毒蛋白脂酰化机制,有利于设计和开发以此为靶点的特异性抗病毒新药。     

Invasive Robinia pseudoacacia in China is nodulated by Mesorhizobium and Sinorhizobium species that share similar nodulation genes with native American symbionts

The aim of this work is to describe the diversity of potentially symbiotic bacteria associated with the invasive introduced legume Robinia pseudoacacia in China. Thirty-three isolates from 33 separate trees and nodules were characterized using restriction length fragment polymorphism and sequencing of 16S rRNA, nodA, nodC and nifH genes. Their 16S rRNA gene patterns and sequences placed them in three clades: 85% of isolates were related to the Mesorhizobium mediterraneum/temperatum group, whereas the remaining were similar either to Mesorhizobium amorphae or to Sinorhizobium meliloti . However, despite their diverse taxonomic positions, the nodA, nodC and nifH genes' phylogenies indicated that these R. pseudoacacia symbionts share similar symbiosis genes, implying gene transfers and a degree of host specificity. Comparison of R. pseudoacacia symbiotic diversity in native and other invaded areas suggests that most Chinese symbionts may not have arrived with the seed but were local bacteria that acquired specific symbiotic genes from native American rhizobia.     

刺槐叶绿素荧光特性的研究

用L I-6400光合仪对黄土高原常用造林树木刺槐的叶绿素荧光动力学曲线、淬灭分析、荧光光曲线以及荧光AC I曲线等生理特性进行测定和对比分析.结果表明:随着光照时间的加大,刺槐的荧光参数ETR、qP和N PQ逐渐上升并在21 m in左右达到稳定,与光合同步.最大荧光产量F m在叶片转入黑暗后逐渐上升,在44 m in左右趋于稳定;N PQ则开始下降,在35 m in左右达到稳定.当光强度>200μm o l.m-2.s-1时,Ph iPS2和Ph iCO2呈线性正相关,而当光强度<200μm o l.m-2.-s 1时,Ph iPS2和Ph iCO2呈线性负相关.CO2浓度和刺槐的荧光光合速率、Ph iPS2、Ph iCO2值存在着一定的正相关关系.     

刺槐林下菌根真菌资源的调查、分离及回接

植物与微生物的共生体在长期协同进化的过程中形成了对各种胁迫的适应性。在北方干旱、半干旱的逆境条件下植物生长除受水分制约外 ,氮、磷元素的供应也是重要的限制性因子。固氮植物可以通过根瘤进行固氮作用弥补氮源不足 ,而菌根能够提高宿主植物对磷元素的吸收。研究表明 ,植物感染菌根后可以提高宿主的抗旱性、抗盐碱性、抗重金属毒害、抗极端湿度、抗极端 ｐＨ等的能力[1]。近年来 ,菌根技术被应用于营林实践中 ,在进行某些树种造林时 ,利用人工接种外生菌根真菌的方法 ,已取得初步的成功[2 ]。在我国广大农村 ,薪材在能源消费中占有重…     

Developmental patterns in rat brain of phosphatidylinositol synthetic enzymes and phosphatidylinositol transfer protein

Phosphatidylinositol synthetic and intermembrane transfer activities were studied in rat in the developing whole brain and isolated cerebellum. Specific activities of CTP: phosphatidate cytidylyltransferase and CDPdiacylglycerol: inositol phosphatidyltransferase were found to have similar developmental patterns. Levels of phosphatidyltransferase seen in fetal animals (whole brain only) and neonatal (whole brain and cerebellum) were maintained through approximately postnatal day 15, peaked at day 28, and then declined to somewhat higher than fetal levels at day 60. Cytidylyltransferase activity varied from the phosphatidylinositol synthesizing enzyme in that specific activity continued to increase up to day 60. Whole brain phosphatidylinositol transfer specific activity showed a sharp peak at postnatal day 9 after which activity was maintained at or above the fetal levels to day 60. Cerebellum phosphatidylinositol transfer specific activity had a similar peak which was delayed 7–10 days compared to the whole brain. Phosphatidylinositol transfer protein was also determined immunologically: whole brain levels increased dramatically from fetal day 16 to 18 and then remained relatively constant, while cerebellum levels (measured from postnatal day 7) displayed a variable profile between days 7 and 28. The developmental pattern of CTP: phosphatidate cytidylyltransferase in rat brain is reported here for the first time.     

刺槐根瘤菌的表型多样性研究

从杨陵地区采集豆科树种刺槐的根瘤,经分离、纯化,获得40株未知菌株,并选取35株参比菌株,进行唯一碳源、氮源利用、对抗生素和染料的抗性、耐盐性、初始pH生长、生长温度范围及石蕊牛奶反应等共105项生理生化测定。结果表明：供试的刺槐根瘤菌在碳、氮源利用、抗生素敏感性、对染料的抗性程度等方面存在着差异。部分菌株具有较强的耐盐碱能力,其中42．5％的菌株能耐受3.0％的NaCl,17．5％的菌株可在初始pH12的YMA培养基上生长。从数值分类树状图可见,在86％的相似水平上未知菌株构成了3个新的类群,其中第1、2类群各有10株菌,中心菌株分别为NWYC113和NWYCl29,第3类群有7株菌,中心菌株为NWYC147。其分类地位需进一步研究和确定。     

Formation of heartwood substances in the stemwood of Robinia pseudoacacia L. II. Distribution of nonstructural carbohydrates and wood extractives across the trunk

Summary The distributions of reserve carbohydrates and of three dominant heartwood extractives were determined in the trunkwood of Robinia pseudoacacia L. The trees were cut at different times of the year (September, November, January, and April). With the exception of the tree felled in January, all trunks exhibited highest contents of nonstructural storage carbohydrates (glucose, fructose, sucrose, and starch) in the youngest, outermost sapwood zone. With increasing depth of the trunk, the levels of carbohydrates decreased. At the sapwood-heartwood transition zone, only trace amounts of nonstructural carbohydrates were present. The heartwood itself contained no storage material. The wood zones of different ages of the trees cut in September, November, and January exhibited glucose/fructose ratios of approximately 1. In April, however, there was a shift to glucose. In the youngest sapwood the amounts of soluble sugars were higher in the earlythan in the latewood. Older zones of the sapwood and the sap-wood-heartwood transition zone showed the opposite behaviour. Three main wood extractives of Robinia were characterized and quantified: the flavanonol dihydrorobinetin (DHR), the flavonol robinetin (ROB) and a hydroxycinnamic acid derivative (HCA). Only DHR was present — in very low amounts — in the younger sapwood of all trunks investigated. Higher amounts (>1 mol/g dry weight) of this compound and the HCA were present in the sapwood-heartwood transition zone. DHR augmented within the heartwood up to a more or less constant level. HCA increased towards the heartwood and decreased again in the inner heartwood parts. ROB appeared in the innermost parts of the sapwood-heartwood transition zone and reached maximum values in older parts of the heart-wood. The results indicate that starch is hydrolyzed at the sapwood-heartwood boundary and thus represents a primary major source of hydroxycinnamic acid and flavonoid synthesis.Dedicated to Prof. Meinhart H. Zenk on the occasion of his 60th birthday     

刺槐叶片可塑生长的密度依赖性

为了探明刺槐叶片性状对种植密度的依赖性,通过刺槐田间栽培试验,研究了刺槐叶片可塑生长的密度依赖性以及主要叶片性状因子之间的关系.结果表明,不同种植密度条件下刺槐叶片厚度均无显著差异,但叶面积、叶绿素含蜃、叶片干重、比叶面积、叶干物质含量和叶片N含量差异显著,表明不同种植密度条件下刺槐叶性因子参数的变异较大,刺槐叶片性状对密度的依赖性较强.叶干重、叶厚度和叶片干物质含量均随种植密度的降低而呈增加趋势,叶片干物质含量与种植密度的相关性达到显著水平(P<0.01),而叶干重、叶厚度与种植密度的相关性不显著(P>0.05).比叶而积和叶片N含鼍均随种植密度的降低而降低,表明刺槐各叶性因子之间对种植密度的依赖性差异明显.对刺槐各叶性因子的相关分析表明,不同种植密度条件下各叶性因子之间的相关性及其强弱均存在差别,表明种植密度是影响刺槐叶性因子变异及叶性因子之间关系的因素之一.叶性特征对种植密度响应存在差异的主要原因是叶性因子之间的协同变化、刺槐生长微环境的差异和刺槐间竞争强度的差异,刺槐不同叶性因子之间的协调平衡和对种植密度响应程度与方向的差异表明了刺槐对其生长环境的适应.     

生态环境对刺槐根瘤菌共生体系的影响

刺槐(Robinia pseudoacacia)是我国营造用材林、能源林的树种,又是豆科固氮树种。刺槐根瘤菌共生体所固定的氮,是刺槐树木生长所需氮的绝大部分。为提高刺槐固氮和增加生物量的潜力,作者探讨了生态条件对刺槐根瘤菌共生体的效应,为其广泛应用提供科学依据。