大鼠STIM1基因真核表达载体构建及蛋白表达定位

[目的]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞中表达、定位。[方法]应用基因合成方法获得STIM1基因序列,克隆至携带EGFP标签的真核表达载体p EGFP-C_1、p IRES_2-EGFP,经菌落PCR、酶切、测序鉴定后,转染至A7r5细胞,Western Blot检测蛋白表达,激光共聚焦观察其定位。[结果]STIM1全长2 058 bp,重组载体经酶切、PCR、测序鉴定构建正确,在A7r5细胞内高表达,并主要定位于细胞质。[结论]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞质中表达,为建立稳定高表达细胞系及后续功能研究奠定基础。     

SD大鼠维生素D受体真核过表达载体构建及功能分析

[目的]构建SD大鼠维生素D受体真核过表达载体并将其在癌细胞中表达及分析不同癌细胞VDR表达的差异性。[方法]通过基因工程方法从p UC18-rat-VDR质粒载体上通过PCR扩增得到了大鼠VDR片段全长,并构建CD513-VDR-EGFP真核超表达载体;经常规PCR、XbaⅠ和Bam HⅠ双酶切及测序鉴定后提取重组质粒CD513-VDR-EGFP并进行细胞转染。利用Western Blot和q PCR方法分析蛋白和基因表达差异。[结果]荧光显微镜下可见单独转染CD513-EGFP和单独转染CD513-VDR-EGFP的293T细胞和He La细胞表达强烈的绿色荧光蛋白,并检测到蛋白及基因表达差异性的存在。[结论]成功构建重组质粒CD513-VDR-EGFP并在目的细胞中过表达(P0.01),本底水平表达的VDR在He La细胞中的表达略高于293T细胞(P0.05)。     

布鲁氏菌分泌蛋白BspJ亚细胞定位分析

[目的]对布鲁氏菌分泌蛋白BspJ进行亚细胞定位分析,为深入探索该分泌蛋白的功能奠定基础。[方法]使用生物信息学方法对分泌蛋白BspJ的核酸和氨基酸序列进行生物信息学分析;利用常规PCR方法扩增BspJ目的基因并克隆到p MD19-T载体;构建真核表达载体p DsRed2-C1-BspJ并转染HEK293T细胞,制作细胞爬片后进行激光共聚焦显微镜分析;利用RT-PCR方法分析HEK293T转染细胞中BspJ转录情况。[结果]生物信息学分析结果显示,BspJ基因ORF全长是531 bp,共编码177个氨基酸,BspJ蛋白无跨膜结构,有7个抗原决定簇,具有核定位信号(NLS)和核输出信号(NES),据此推测BspJ蛋白亚细胞定位可能具有核—胞浆穿梭过程; PCR方法扩增出BspJ基因;成功构建p DsRed2-C1-BspJ重组质粒;激光共聚焦分析显示BspJ蛋白定位于宿主细胞核及核周围; RT-PCR分析显示BspJ基因于宿主细胞中进行转录。[结论]布鲁氏菌分泌蛋白BspJ分布于宿主细胞核及核周围,可能具有胞核—胞质穿梭过程。     

PRRS病毒主要受体蛋白CD151和CD163真核表达载体的构建

为了进一步研究PRRSV与细胞受体之间的相互作用机理,通过基因工程方法从PAM细胞中克隆获得了CD151和CD163全长编码片段,利用Sal I和Kpn I内切酶对回收得到的CD151(762 bp)和CD163(3 333 bp)DNA片段进行酶切,构建了p IRES2-EGFP-CD151和p IRES2-EGFP-CD163真核表达载体。经PCR和酶切鉴定后,分别提取重组质粒进行细胞转染。荧光显微镜下可见单独转染CD151和CD163基因或CD151/CD163共转染的Marc 145细胞表达强烈的绿色荧光,Western blot分析结果进一步证实,CD151和CD163蛋白在转染后的细胞中获得超表达。猪CD151和CD163真核表达载体的成功构建为进一步探索CD151和CD163在PRRSV感染细胞过程中的协同作用提供了物质基础,特别是对深入研究PRRS病毒的入侵及宿主识别具有重要意义。     

copine Ⅴ蛋白的亚细胞定位

目的:确定copineⅤ蛋白的亚细胞定位,初步研究该蛋白的生物学功能。方法:将copineⅤ编码区基因分别构建真核表达载体pEGFP-copineⅤ(或pRED-copineⅤ),转染HEK293、HeLa细胞,在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1(或pRED-N1)的细胞比较观察。结果:经限制性内切酶分析鉴定,构建的重组表达载体正确。通过激光共聚焦荧光显微镜观察,转染了重组载体pEGFP-copineⅤ的细胞荧光信号集中分布于胞膜和内膜系统;进一步研究表明copineⅤ定位于内质网而非线粒体,而空载体则在整个细胞中均匀分布。结论:copineⅤ蛋白定位于细胞膜和内质网上,而不定位于线粒体。     

copine V蛋白的亚细胞定位

目的：确定copine V蛋白的亚细胞定位,初步研究该蛋白的生物学功能.方法：将copine V编码区基因分别构建真核表达载体pEGFP-copine V（或pRED-copine V）,转染HEK293、HeLa细胞,在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1（或pRED-N1）的细胞比较观察.结果：经限制性内切酶分析鉴定,构建的重组表达载体正确.通过激光共聚焦荧光显微镜观察,转染了重组载体pEGFP-copine V的细胞荧光信号集中分布于胞膜和内膜系统;进一步研究表明copine V定位于内质网而非线粒体,而空载体则在整个细胞中均匀分布.结论：copine V蛋白定位于细胞膜和内质网上,而不定位于线粒体.     

荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白在BHK-21细胞亚细胞定位的影响

【目的】探究荧光蛋白标签对马疱疹病毒I型(Equine herpes virus type 1,EHV-1)gD囊膜蛋白亚细胞定位的影响。【方法】以EHV-1基因组为模板利用PCR扩增gD全基因,分别克隆至pAcGFP1-C1和p Ds Red2-N1质粒,构建p Ac-GFP-gD(GFP-gD)和p Ds-gD-Red(gD-Red)重组质粒;将GFP基因插入gD基因信号肽序列之后并克隆至PVAX-1质粒,构建PVAX-S-GFP-gD’(S-GFP-gD’)重组质粒;将Flag标签序列与gD囊膜蛋白N端序列融合后并克隆至p VAX-1表达载体,构建p VAX-Flag-gD(Flag-gD)重组质粒。将4种不同重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过激光共聚焦显微镜对不同融合蛋白gD进行亚细胞定位。【结果】成功构建4种不同的融合蛋白gD真核表达载体;在BHK-21细胞单独表达时,不同融合蛋白gD绝大部分都定位于高尔基体,极少量定位于细胞核内。【结论】不同插入位点的荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白亚细胞定位无明显影响,这对今后研究其它蛋白亚细胞定位提供参考。     

人源性Rab38荧光融合蛋白表达载体的构建及功能鉴定

目的构建人源性Rab38与EGFP融合蛋白表达载体pEGFP-Rab38,观察Rab38在人黑素细胞瘤细胞系A375中的细胞定位情况,为进一步研究Rab38在黑素代谢中的作用提供实验依据。方法收集A375细胞,提取总RNA并逆转录成cDNA。特异性引物PCR扩增Rab38片段并插入pEGFP-C3载体,随后转化至感受态大肠杆菌DH5α中,挑取单克隆菌落进行鉴定。将鉴定正确的重组表达载体转染A375细胞,检测细胞中Rab38和Tyrp1(酪氨酸酶相关蛋白1)的表达并观察Rab38的亚细胞定位。结果 pEGFP-Rab38重组质粒经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确;转染A375细胞后,激光共聚焦显微镜观察到Rab38定位于胞浆中,且大量聚集于细胞核周围;实时定量PCR和Western blot可检测出细胞中EGFP-Rab38融合蛋白的表达,且细胞中Tyrp1的表达明显升高。结论融合蛋白表达载体pEGFP-Rab38成功构建,观察了Rab38在细胞中的定位并初步研究了其对黑素合成关键蛋白Tyrp1的影响,为进一步研究Rab38在黑素代谢中的作用奠定了良好的基础。     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建北大核心

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

BALB/c小鼠I-Ad αβ链RFP融合双顺反子表达载体的构建及其在COS-7中的表达

构建了在β链C端融合红色荧光蛋白(RFP)标签的BALB/c小鼠I-Adαβ链真核双顺反子表达载体pRed-IRES-I-Ad,使用LipofectAMINE2000转染COS-7细胞,用激光共聚焦显微镜观察外源蛋白在细胞中的表达与定位.I-Adαβ分子在COS-7细胞中能够以较高的效率表达,并且在COS细胞中能形成聚集状态.与通常的真核翻译帽子结构起始相比,IRES启动真核翻译系统的效率低于前者;与空质粒对比,IRES介导的真核翻译起始,RFP的表达量较低.     

小鼠IL-39的克隆及真核表达载体的构建

[目的]构建小鼠白介素(interleukin,IL)-39单链融合基因及其真核表达载体。[方法]通过RT-PCR得到小鼠EB病毒诱导基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)及IL-23p19基因的全长编码区。通过重叠延伸PCR和编码疏水性多肽接头(linker)(Gly4Ser)3的DNA序列将小鼠EBI3全长编码区及IL-23p19成熟肽编码区连接起来,构建小鼠IL-39单链融合基因,并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5-His中,通过限制性内切酶双酶切及基因测序鉴定阳性重组载体。[结果]通过重叠延伸PCR得到1 254 bp大小的目的条带,测序分析显示,小鼠IL-39单链融合基因中EBI3、linker和IL-23p19的基因序列及连接顺序和方向均完全正确。[结论]成功构建了小鼠IL-39单链融合基因及其真核表达载体。     

一种原位示踪外源目的基因表达载体的构建

应用分子克隆技术 ,分别将增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)、内部核糖体进入位点 (internalribosomeentrysite,IRES)和编码H-ras基因C端 2 0个氨基酸的DNA(rasc2 0 )片段插入真核表达载体pcDNA3,构建真核重组表达载体并将其命名为pZX。通过脂质体介导将该载体转染人宫颈癌细胞系HeLa ,培养过夜后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞内的分布 ,并与pEGFP-C3质粒DNA转染该细胞系进行比较。结果表明 ,转染pZX载体的实验组细胞膜发出绿色荧光 ,而对照组绿色荧光则均匀弥散于整个细胞中 ,工具性载体pZX已构建成功     

EGFP/SDCT1融合蛋白表达、亚细胞定位信号分析、组织分布及电生理功能研究

从正常人肾中克隆低亲和力钠离子依赖二羧酸共转运蛋白 1(sodium-dependent dicarboxylate co-transporter 1, SDCT1, NADC1)全长基因, 并将其和N端及C端缺失突变的SDCT1基因分别插入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达载体中构建EGFP/SDCT1融合蛋白真核表达载体, 然后将它们转染到人肾小管上皮细胞HKC中表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位情况以确定其定位信号. 双重PCR分析证实融合基因已整合到细胞基因组中, Western blot显示融合基因已在细胞中得到表达. 共聚焦显微镜分析显示正常人SDCT1蛋白主要定位于细胞膜上, 与生物信息学的预测结果一致, 而C端缺失的SDCT1基因转染的细胞, 其绿色荧光位于细胞质, N端缺失基因转染的细胞, 其绿色荧光主要位于细胞膜上. 将体外转录的融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达并用双电极电压钳技术记录细胞跨膜电流, 结果在卵细胞膜上测定出了Na⁺内向电流. 免疫组化结果显示SDCT1主要表达于人近端肾小管上皮细胞的管腔侧, 而在远端肾小管、集合管、肾间质和肾小球中未见SDCT1的表达. 上述研究表明, 正常人SDCT1蛋白定位于近端肾小管上皮细胞的管腔侧膜上, SDCT1蛋白的C端部分对于其合成后的迁移及靶向定位是必需的, 人SDCT1蛋白的细胞膜定位序列可能位于其C端部分.     

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-SCG10在HEK293细胞内定位。结果 SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。pEGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,pEGFP-SCG10蛋白主要定位于HEK293细胞浆内。     

信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA 蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响

[目的]构建绿色荧光蛋白(GFP)与禽流感病毒(AIV)HA基因的融合表达载体,观察信号肽序列的有无及位置对HA-GFP在293T细胞中的表达影响.[方法]应用PCR方法从H5N1亚型AIV质粒DNA中扩增出完整的或除去信号肽序列的HA基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和SmaⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的不同位点,将得到的重组体M1,M2和M3分别转化宿主菌DH5a,经双酶切及.DNA测序鉴定分析后,采用脂质体转染法将pEGFF-C1,M1,M2和M3转染人胚肾细胞系293T细胞,荧光显微镜下观察HA-GFP的表达,流式细胞仪检测表达HA蛋白的细胞百分数.[结果]经酶切及测序鉴定成功构建了HA-GFP重组表达载体M1,M2和M3,荧光显微镜及流式细胞仪检测到重组质粒转染的293T细胞表达强的荧光蛋白,信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达有显著影响,信号肽序列使HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达减少,而信号肽的位置对融合蛋白表达量的影响不显著.[结论]信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在细胞中的表达有显著影响.     

应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系

[目的]探索应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系的筛选方法。[方法]EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接构建目的基因p IRES2-EGFP表达载体并测序确定,Lipofectamine3000转染Hela细胞分为Mock组(未转染组)、NC组(p IRES2-EGFP空载对照组)、重组质粒转染组,转染后24 h消化细胞进行初步筛选(900μg/m LG418),转染后14～16 d将长至肉眼可见的细胞克隆全部重新消化进行二次筛选(方法同初步筛选),转染后28～32 d挑选3个肉眼可见的细胞克隆,实时荧光定量PCR和WB检测目的基因过表达效率。[结果]双酶切及测序确定重组质粒成功构建,与Mock组相比,NC组无明显变化,重组质粒转染组各克隆目的基因mRNA水平分别升高109±8. 3、127±10. 5、122±9. 1倍,P 0. 01,蛋白水平分别升高33±3. 3、45±4. 7、47±4. 9倍,P 0. 01。[结论]该筛选方法 28～32d左右可快速建立Hela细胞稳转细胞系,过表达效率高,可直接进行后续实验。     

家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及定位

[目的]在Bm N细胞中表达家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,Bm BDV)非结构蛋白NS1,并分析其亚细胞定位。[方法]在病毒非结构蛋白NS1基因5'端加上kozak序列、3'端融合Flag标签序列;将重组序列克隆至昆虫细胞表达载体pIBV5/His上,转染BmN细胞,通过Western blot和免疫荧光检测NS1蛋白的表达和亚细胞定位。[结果]PCR和酶切鉴定显示重组表达载体构建正确;Western blot检测到一条大小约37 kDa的特异条带,免疫荧光分析显示表达的蛋白主要定位于细胞核中。[结论]构建的真核表达质粒能在BmN细胞中稳定表达NS1蛋白,该蛋白主要定位在细胞核中。     

对细胞膜质蛋白共定位染色方法的改良

[目的]将流式细胞术染色方法进行改良用于T细胞膜质蛋白共定位的共聚焦显微镜检测,在共定位表达于细胞膜上的CD4和细胞质内表达的TIPE2蛋白较常规镜检免疫荧光染色法可提高实验效率。[方法]取小鼠脾脏T细胞,用流式细胞术的染色方法代替实验室常规免疫染色法,对细胞膜上的CD4与细胞质内的TIPE2蛋白进行染色,制片并在激光共聚焦显微镜下观察。[结果]小鼠脾脏CD4+T细胞上出现了TIPE2蛋白的共表达,符合实验预期,同时实验效率从原有10%提高到90%。[结论]采用该染色方法后突破了常规免疫荧光染色必须要在载玻片上进行的局限,简化了操作,保证了实验的有效性,提高实验效率。     

GnRH及其转运肽基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建GnRH/TRS与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因并表达.方法 利用DNA重组技术,将GnRH/TRS片段克隆至真核表达载体pEGFP-C1转化DH5 α,重组体质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS用LipoGen脂质体进行转染至Hela细胞,核酸序列测定和Western印迹分析基因表达,激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局.结果 重组子pEGFP-C1-GnRH/TR成功构建.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,GnRH/TKS-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.结论 GnRH/TRS-GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性,且不影响GnRH/TRS分子在细胞内的正确表达.     

PNRC1核定位信号序列的鉴定

为鉴定富含脯氨酸核受体辅调节蛋白1(PNRC1)分子的核定位信号序列（nuclear localization signal sequence, NLS）,在生物信息学方法预测的基础上,先构建野生型PNRC1及删除预测NLS的PNRC1突变体的绿色荧光蛋白（GFP）重组表达载体,转染细胞后通过激光共聚焦显微镜观察PNRC1分子在删除预测NLS后细胞内的定位变化.然后,将预测的NLS编码序列直接连到GFP表达载体上,以及将预测的NLS加到胞浆蛋白上构建其GFP重组表达载体,转染细胞,观察预测的NLS能否把构建的重组体都带到细胞核内.结果显示,删除PNRC1中预测的NLS后,其定位从细胞核中变为主要定位在细胞浆中,而预测的NLS能把GFP或胞浆中的蛋白带到细胞核中.研究表明,预测的NLS为PNRC1分子真正的NLS.