T载体介导的基于attL核心区LR反应的简化快速Gateway克隆系统

Gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。Gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵。本研究首先对3个常用Gateway载体的atts特异位点序列比对发现,attL序列核心交换位点“core attL”的21~22 bp长的碱基是保守和必要的。由此,设计含有core-attL序列的引物,通过PCR克隆得到DNA片段并连入pMD18-T载体,然后进行LR反应,可成功得到目标表达载体,并在保守的位点上正确重组。本研究还对其中一个带有绿色荧光蛋白基因的表达载体转化至烟草,能够正常表达该蛋白质。结果表明,通过将含有attL核心位点基因片段连接到pMD18-T载体上,可以省略BP反应而将目标片段连接到终载体上,节约了反应时间和成本。     

含甘露糖异构酶基因植物表达载体的构建

目的:构建了以manA基因为选择标记的植物表达载体。方法:从大肠杆菌DH5α中克隆出manA基因,连接到质粒pCAMBIA1301的XhoⅠ位点,替换hpt基因,通过酶切和PCR检测了插入片段的正确性,使用XbaⅠ和HindⅢ酶切Gateway载体(pGWCBF)获得含有P35S-T35S-attR1-attR2-CmR-ccdB的结构域,将其插入到表达载体pCAMBIA1301的相应位点中,获得中间表达载体pCAMBIA1301-manA-GW,使用Gateway载体的BP反应与LR反应,将转录因子CBF基因片段整合到载体中。结果:酶切结果表明以甘露糖异构酶基因(manA)为选择标记的植物表达载体pCAMBIA1301-manA-CBF已经构建完成。结论:将构建好的载体用液氮冻融法转化到农杆菌中,可以用于葡萄的遗传转化研究,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础。     

通路克隆入门载体pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~*的构建及其应用

为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点,然后在这两个酶切位点之间插入一个含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子(PrbcS)及其叶绿体基质定位序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(gfp)的DNA片段,获得pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体.用该载体和另一个含有attL1和attL2重组位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus)与Gateway的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3进行LR重组反应可以构建一个能串联gfp和gus两个报告基因表达盒的植物表达载体pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T-gus,所构建的植物表达载体转化烟草后,gfp和gus基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达,所表达的GFP蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中,而GUS蛋白也可以在叶片中表达.利用此表达载体通过一次转化事件不仅可以完成两个目的基因的转化操作,而且还可以利用叶绿体基质定位序列(*T)把PrbcS控制表达的目的蛋白直接定位到转基因植物的叶绿体中.因此pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体的应用进一步扩大了Gateway技术及植物表达载体的应用范围,为叶绿体基因工程操作提供了一个更方便的技术平台.     

转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用Gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。     

基于XcmⅠ的T载体及其在合成生物学中的应用

为了节约成本和提高实验效率,以商用p MD18-T载体为基础,构建获得了p FL-XS-T载体,其具有符合Biobrick标准的串联XbaⅠ-XcmⅠ-XcmⅠ-SpeⅠ克隆序列,通过对XcmⅠ的酶切处理即可以通过TA克隆方便地克隆PCR片段。克隆验证实验结果表明,经XcmⅠ处理的该载体可以与PCR片段进行TA连接,连接效率及阳性率均可以满足实验室要求并且可以得到Biobrick标准质粒。此外,该载体不仅可以与其余Biobrick标准元件进行串联,还可以作为功能DNA元件的筛选载体。     

托佩克猪SLA-3原核表达载体构建及表达

目的:研究托佩克猪SLA-3-TPK的原核表达载体的构建及蛋白表达。方法:设计引物扩增SLA-3-TPK胞外区(命名为SLA-3-TPKe),并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector,经双酶切筛选阳性克隆测序,序列正确的克隆片段与表达载体p ET-21a(+)连接,转化宿主菌BL21,并经过诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果:PCR成功扩增获得SLA-3-TPke,大小约为850bp,酶切后插入片段大小约为830bp,经克隆测序,阳性克隆序列与原序列一致,双酶切鉴定证实目的基因与p ET-21a(+)成功连接,经过IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测,结果显示目的基因成功表达且目的蛋白大小约为31k Da。结论:该研究成功构建了托佩克猪SLA-3原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。     

葡萄糖氧化酶基因片段的克隆与序列分析

根据Gen Bank发布的葡萄糖氧化酶基因序列设计PCR扩增引物,从筛选的1株可以产生葡萄糖氧化酶的菌株中克隆得到葡萄糖氧化酶基因片段,将该片段与p MD20-T载体连接后转化至大肠埃希菌DH5α中,测序并进行序列比对分析。结果表明,该克隆片段属于氧化还原酶超家族,且与同属氧化还原酶超家族中的Aspergillus niger strain BT18葡萄糖氧化酶相似度达到92%。从蛋白质预测的三级结构可以看出有FAD和NAG结合位点,说明该GOD片段理论上可以表达出GOD的主要功能。可以推断该克隆的基因片段为葡萄糖氧化酶基因片段。     

长春花萜类吲哚生物碱生物合成途径中重要酶(DXR、SLS、G10H、STR)基因的克隆与表达

以分离提取的2周龄长春花植物幼苗总RNA为模板,经两步Gateway-PCR反应扩增得到长春花萜类吲哚生物碱合成途径中编码重要酶：5—磷酸脱氧木酮糖还原酶（DXR）、次番木鳖苷合成酶 （SLS）、牻牛儿醇-10羟化酶（G10H）和异胡豆苷合成酶（STR）的cDNA 基因片段。利用BP重组酶将扩增片段克隆到Gateway化的入门载体pDONR201中,并进行测序验证。测序后的基因通过 LR重组酶的作用转移到带有HIS标签的目标载体pETG10A中,构成重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导得到了高效表达,通过Ni-TED树脂纯化方法得到了高纯度的蛋白。     

以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建

目的:构建以木糖异构酶基因xylA为筛选标记的无抗生素标记Gateway系统植物表达载体。方法:克隆大肠杆菌木糖异构酶基因xylA并用其替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因,利用载体中的多克隆位点将Gateway Binary Vector(pH7WG2D)中酶切位点XbaⅠ和HindⅢ之间包括P35S、T35S、attR1、attR2和CmR-ccdB的片段重组入表达载体pCAMBIA1301中,构建表达载体pCAMBIA1301-xylA-GW,利用含有津田芜菁HY5基因片段的BP反应产物与载体进行LR反应,获得含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5,并导入根癌农杆菌LBA4404中。结果:抗生素筛选及酶切和PCR鉴定表明成功构建了以xylA为筛选标记的无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5。结论:利用木糖异构酶基因xylA结合Gateway克隆技术构建无抗生素标记植物表达载体,可简化、方便植物转基因表达载体构建。     

用于通路(Gateway)克隆技术的植物表达载体研究进展

通路(Gateway)克隆技术是根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发的一套分子克隆新技术.利用该技术LR反应构建目的基因的表达载体时不需要经过酶切和连接等繁琐而又费时的过程,因此,可以节省很多时间.为了扩大Gateway技术在植物基因工程领域的应用,最近有很多研究机构和研究小组开发了能用于组成型或诱导型表达目的基因、基因沉默、启动子分析、蛋白质亚细胞定位、蛋白质/蛋白质相互作用、多个DNA片段的模块化组装和DNA组片段功能验证等研究用的植物表达载体.该文对这些技术的研究进展进行了综述.     

犬瘟热病毒H基因原核表达载体的构建

利用本实验以前构建的含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-T质粒,根据pMD18-T-H序列设计带有XbalI和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因进行PCR扩增,得到约1800bp左右的片段。该片段被克隆到pMD18-Tsimple载体上,用XbalI和HindⅢ进行单、双酶切鉴定．筛选阳性克隆。将阳性克隆再用XbalI和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDVH基因片段。将原核表达载体pPROEXTMHTa、pet-30b用同样的方法酶切,回收载体片段。将CDVH基因片段分别用T4连接酶连接到回收的pPROEXTMHTa、pet-30b载体上,构建原核表达载体质粒pPROEXTMHTa-H和pet-30b-H。再用XbalI和HindⅢ进行单、双酶切鉴定阳性载体。本实验为下一步H蛋白表达、纯化并作为CDV诊断用抗原及CD的免疫预防奠定了基础。     

布鲁菌抗原的快速克隆与高效表达

目的:通过Gateway技术构建布鲁菌抗原表达载体,并筛选出高效可溶性表达载体。方法:以山羊布鲁菌16M株染色体DNA为模板,扩增4个布鲁菌抗原基因BMEI2002、BMEI1069、BMEI1483和BMEI0748,利用GatewayBP反应将基因克隆到入门载体pDONR201中,构建重组质粒,然后用Gateway LR反应将基因重组到3种表达载体(pDEST17、pHXGWA、pHGGWA)中,构建相应的重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3)并诱导表达,分析利用3个不同载体所表达蛋白的表达量及表达形式。结果:利用BP反应构建了4个基因的重组质粒,用LR反应将这些基因分别克隆到表达载体,构建得到了相应的表达载体;诱导表达后的可溶性分析显示,含6×His和TRX标签的pHXGWA所表达的蛋白在表达量和可溶性方面均优于pDEST17和pHGGWA。结论:通过Gateway技术实现了布鲁菌抗原的快速克隆,筛选到的pHXGWA可作为后续大规模克隆表达载体,为布鲁菌抗原的大规模克隆表达和保护性抗原的筛选奠定了基础。     

利用TA克隆的方法简便构建入门克隆

Gateway技术是一种通用型克隆方法,其基于λ噬菌体位点特异性重组,将目的DNA快速克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上,不需要进行酶切和连接反应。但存在获得入门克隆过程中相关反应酶制剂价格昂贵,且药品订购时间较长等问题。通过对入门载体pDONR207的改造,使之产生3’端具有单个T 末端的线性化的入门载体,采用TA克隆的方法替代BP反应,从而简便、经济和快速地获得入门克隆。利用改造后的Gateway技术构建拟南芥SOS2基因的原核表达载体和真核表达载体,通过原核表达和原生质体瞬时表达证明通过此方法构建的表达载体在原核细胞和真核细胞中都得到了很好的表达。     

新型玉米种子生产技术表达载体的构建及遗传转化

本研究在GenBank中找到花粉育性恢复基因MS45、花粉致死基因ZmAA1、颜色筛选标记基因DsRed2及其特异性启动子和终止子序列,并在目的基因和植物表达载体pCAMBIA3300设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建表达载体pCAMBIA3300-MS45-DsRed2-ZmAAI,通过农杆菌介导的萌动胚遗传转化法将构建的表达载体转化到优良玉米自交系吉A001中,通过喷洒含5mg/L除草剂筛选得到397株草胺膦抗性植株,用PCR检测得到119株含有目的基因的阳性植株。结果表明,MS45-DsRed2-ZmAAI基因在玉米中得到表达。     

曼氏无针乌贼GT微卫星位点的筛选

采用链霉亲和素包被的磁珠富集法筛选曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)微卫星位点。试验样品来自舟山六横岛,提取4个样品的DNA混合成DNA pool,用限制性内切酶Sau 3A I酶切。接上接头后构建基因组PCR文库,用生物素标记的(GT)15探针筛选。将筛选获得目的片段进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入DH5α感受态大肠杆菌里,扩大培养后PCR筛选阳性克隆。总共选取278个克隆,对120个经过检测含有插入片段的克隆进行测序,发现102个克隆含有微卫星序列,阳性克隆比率为85%。除去重复测序和侧翼链不足的序列,可以设计引物的微卫星序列有64条。     

大肠杆菌表达SLA-3蛋白与口蹄疫病毒多肽的复性研究

【目的】研究大约克猪SLA-3(SLA-3-YDY)蛋白在体外与口蹄疫病毒多肽的复性。【方法】设计SLA-3-YDY胞外区引物,PCR扩增目的基因,并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector上,双酶切筛选出阳性克隆并测序,测序正确的片段连接至表达载体p ET-21a(+)上,转化大肠杆菌感受态BL21细胞中,IPTG诱导,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。超声破碎菌体,提取包涵体蛋白,通过稀释复性法将重链SLA-3-YDY、轻链sβ2m和口蹄疫病毒多肽Hu52按摩尔比1:1:1加入复性液,经分子筛层析纯化并检测复合物是否复性。【结果】PCR扩增获得SLA-3-YDY目的基因,经测序阳性克隆序列与原序列一致。经酶切鉴定,证明目的基因与p ET-21a(+)载体成功连接,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测,显示目的基因表达,大小约33 k D,SDS-PAGE检测包涵体蛋白,证明包涵体蛋白大小与菌体蛋白大小一致。分子筛及SDS-PAGE检测发现,通过稀释复性法实现了重链、轻链和多肽的复性,并得到蛋白复合物SLA-3-Hu52-sβ2m(45 k D)。【结论】构建了大约克猪SLA-3原核表达载体,获得目的蛋白,实现了口蹄疫病毒多肽Hu52与SLA-3重链及轻链的复性,为今后进一步研究SLA-3的结构和功能奠定基础。     

家蝇抗菌肽Defensin基因同向串联表达载体的构建和鉴定

目的:构建家蝇抗菌肽Defensin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法:PCR法扩增家蝇抗菌肽Defensin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoRⅠ和NheⅠ位点,下游5′端带有NotⅠ和XbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T载体,利用pMD18-T载体的NdeⅠ位点和目的片断上的一对同尾酶(NheⅠ和XbaⅠ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Defensin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果:PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功。结论:该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。     

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。