单分子实时测序技术在环境微生物研究中的应用

1975年,第一个cDNA的基因组——噬菌体фX174基因组的测序完成,标志着测序时代的开始。1996年以来人类基因组计划的发起极大地推动了测序技术的应用和发展,第二代测序技术也被称为高通量测序技术。而单分子DNA测序技术是最近10年内发展起来的新一代的测序技术,称为第三代测序技术,其中包括单分子实时测序(Single molecule real time sequencing,SMRT)、真正单分子测序和单分子纳米孔测序等技术。SMRT测序技术有超长读长、测序周期短、不需要模板扩增和直接检测表观修饰位点等特点,为研究人员提供了新的选择。本文综述了SMRT测序技术的基本原理、性能以及它在微生物16S rRNA基因、微生物全基因组以及微生物宏基因组测序等方面的应用,并分析了SMRT测序技术在环境微生物应用中的优势以及存在的问题。     

基于SMRT测序技术的16S rRNA基因全长测序及其分析方法

被称为第三代测序技术的单分子测序是最近几年发展起来的高通量测序技术。其中,由Pacbio Bio Sciences公司开发的单分子实时测序技术(SMRT)是最先商用的技术。SMRT测序技术通过对模板序列循环测序产生环形一致序列(CCS),成功克服第三代测序技术准确率低的弊病。通过SMRT测序技术,科学家可以更深入准确地探究复杂环境微生物的结构和功能。介绍SMRT测序技术在微生物16S rRNA基因测序中的优势和劣势,并就基于SMRT测序技术所得的全长16S rRNA基因序列的质量控制、错误序列排除、聚类和注释分析等重要分析环节进行概述,同时,提出利用SMRT测序技术研究复杂环境微生物可能存在的问题及其解决方法,期望能为研究人员提供参考。     

第三代测序技术的主要特点及其在病毒基因组研究中的应用

随着基因测序技术的创新和应用,新的高通量测序技术不断涌现,以Pacific Biosciences(PacBio)公司的单分子实时测序(single molecule real time sequencing)为代表的第三代测序(third generation sequencing,TGS)技术开始逐渐应用于基因组研究,包括大型基因组拼装、基因结构变异和表观遗传研究等方面。本文主要对TGS技术的原理、特点和应用,特别是在病毒研究中的应用进行介绍,并与第二代测序(next generation sequencing,NGS)技术进行比较,为基因组测序技术的选择及其临床应用提供一定参考。     

全长转录组测序在植物中的应用研究进展

全长转录组测序(Iso-Seq)是指使用第三代测序(TGS)技术获得mRNA的全长序列。随着以单分子实时(SMRT)测序为代表的TGS技术逐渐发展成熟,以及该技术在基因组和转录组de novo测序等方面的优势,全长转录组测序技术已经广泛被应用于动物、植物、微生物测序研究中,并挖掘出大量相关数据。本文综述了基于Iso-Seq技术的原理及其在模式植物和非模式植物研究中的应用,期望为研究植物全长转录组相关分析提供参考。     

基于三代测序技术的微生物组学研究进展

微生物在人类生活中无处不在, 过去人们对微生物的认识仅停留在单菌培养和定性研究上, 而测序技术的发展极大地促进了微生物组学的研究。越来越多的证据表明: 人体共生微生物、特别是肠道微生物与人类健康息息相关。 二代测序技术凭借其高通量、高准确率和低成本的特点, 成为微生物组学研究中的主流测序技术。但是随着研究的深入, 二代测序技术的短读长(< 450 bp)增加了后续数据分析和基因组拼接难度, 也限制了该技术在未来研究中的应用。在此背景下, 第三代测序技术应运而生。第三代测序技术又称单分子测序, 能够直接对单个DNA分子进行实时测序, 而不需要经过PCR扩增。第三代测序技术的平均读长在2-10 kb左右, 最高可以达到2.2 Mb, 实现了长序列的高通量测序。凭借其超长的测序读长、无GC偏好性等优势, 三代测序技术为微生物基因组全长测序, 组装完整可靠的基因组提供了新的方法。本文在描述三代测序的技术特点和原理的基础上, 重点介绍了三代测序技术在微生物16S/18S rRNA基因测序、单菌的基因组组装以及宏基因组中的研究应用和进展。     

基于16S rRNA基因测序分析微生物群落多样性

微生物群落多样性的研究对于挖掘微生物资源,探索微生物群落功能,阐明微生物群落与生境间的关系具有重要意义。随着宏基因组概念的提出以及测序技术的快速发展,16S rRNA基因测序在微生物群落多样性的研究中已被广泛应用。文中系统地介绍了16S rRNA基因测序分析流程中的四个重要环节,包括测序平台与扩增区的选择、测序数据预处理以及多样性分析方法,就其面临的问题与挑战进行了探讨并对未来的研究方向进行了展望,以期为微生物群落多样性相关研究提供参考。     

枯草芽孢杆菌N2-10的基因组测序和比较基因组分析

【背景】枯草芽孢杆菌N2-10是一株具有较强抑菌能力且能产纤维素酶等多种水解酶的革兰氏阳性菌,在发酵饲料中具有较大的应用潜力。【目的】通过获得枯草芽孢杆菌N2-10的全基因组序列信息,进一步解析菌株次级代谢产物合成基因信息,并通过比较基因组学分析菌株N2-10与模式菌株的差异性,为阐明N2-10抑菌和益生机制提供理论基础。【方法】通过二代Illumina NovaSeq联合三代PacBio Sequel测序平台,对菌株N2-10进行全基因组测序,将测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释,并利用比较基因组学分析N2-10与其他菌株的差异。【结果】菌株N2-10基因组大小为4 036 899 bp,GC含量为43.88%;共编码4 163个编码基因,所有编码基因总长度为3594369bp,编码区总长度占基因组总长度的89.04%;含有85个tRNA、10个5S rRNA、10个16S rRNA、10个23S rRNA,以及2个CRISPR-Cas、1个前噬菌体和6个基因岛;在GO (gene ontolog)、COG (clusters of orthologous groups of...     

DNA聚合酶对PacBio SMRT测序结果影响的评价

目的 评估不同DNA聚合酶是否会对以16S rRNA全长为测序靶点的肠道微生物多样性研究结果产生影响。方法 用美国太平洋公司的三代测序仪（PacBio single molecule real-time sequencing technology）对3份分别采用KAPA HiFiTM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶扩增的军犬粪便样品进行精确至“种”水平的测序分析。结果 经配对Mann-Whitney U检验显示,不同DNA聚合酶扩增的同一样品在门、属和种水平上差异无统计学意义（P>0.05）,然而在某些相对含量较少的操作分类单元（OTU）上,其扩增效率存在差异。经基于非加权UniFrac距离的非加权组平均法聚类分析和基于加权UniFrac距离的非参数多元方差分析发现不同DNA聚合酶扩增的同一样品其多样性差异无统计学意义（P>0.05）。结论 KAPA HiFiTM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶虽对模板DNA扩增存在一定的偏好性,但该偏好性不影响PacBio SMRT测序结果。     

PCR-DGGE技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)在微生物生态学领域有着广泛的应用。研究采用化学裂解法直接提取出不同农田土壤微生物基因组DNA,并以此基因组DNA为模板,选择特异性引物F357GC和R515对16S rRNA基因的V3区进行扩增,长约230bp的PCR产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分离后,得到不同数目且分离效果较好的电泳条带。结果说明,DGGE能够对土壤样品中的不同微生物的16S rRNA基因的V3区的DNA扩增片断进行分离,为这些DNA片断的定性和鉴定提供了条件。与传统的平板培养方法相比,变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术能够更精确的反映出土壤微生物多样性,它是一种有效的微生物多样性研究技术。     

粪便留取量对粪便中细菌结构和功能的影响CSCD

目的探究不同粪便留取量对肠道菌群构成研究结果的影响,为肠道菌群构成研究中粪便样本的采集方式提供参考。方法本研究分别对全便和部分粪便进行预处理,并使用PacBio SMRT测序技术对10名志愿者的20份粪便样本进行了16S rRNA全长测序,通过多元统计学等手段对粪便中细菌的构成、多样性和功能进行比较分析。结果Eubacterium rectale、Eubacterium ventriosum和Allisonella histaminiformans等低丰度物种的相对丰度在不同粪便留取量中有一定差异,其在全便中的相对丰度均显著高于部分粪便(P<0.05)。但Wilcoxon配对检验发现粪便留取量对肠道菌群结构、多样性和功能的影响均无显著性差异(P>0.05)。不同个体间肠道菌群结构存在明显差异,且粪便留取量的影响远小于个体差异。结论全便和部分粪便两种粪便留取量对检测微生物的组成、多样性和功能无显著影响,因此取部分粪便即可满足对肠道菌群研究的要求。     

16S rRNA基因在微生物生态学中的应用

16S rRNA(Small subunit ribosomal RNA)基因是对原核微生物进行系统进化分类研究时最常用的分子标志物(Biomarker),广泛应用于微生物生态学研究中。近些年来随着高通量测序技术及数据分析方法等的不断进步,大量基于16S rRNA基因的研究使得微生物生态学得到了快速发展,然而使用16S rRNA基因作为分子标志物时也存在诸多问题,比如水平基因转移、多拷贝的异质性、基因扩增效率的差异、数据分析方法的选择等,这些问题影响了微生物群落组成和多样性分析时的准确性。对当前使用16S rRNA基因分析微生物群落组成和多样性的进展情况做一总结,重点讨论当前存在的主要问题以及各种分析方法的发展,尤其是与高通量测序技术有关的实验和数据处理问题。     

基于分子标记的宏基因组16S rRNA基因高变区选择策略

随着新一代DNA测序技术出现,人们能够同时对多个DNA样本的宏基因组进行并行分析,尤其是以16S rRNA基因高变区为分子标记的测序已经成为微生物多样性研究最为简洁有效的方法. 目前二代高通量测序的读长不能覆盖16S rRNA基因的全长,需要选择一个有效的高变区进行测序.十多年来,对于16S rRNA基因高变区的选择策略没有统一的标准.本文分析了常用的高变区选择策略,指出不同环境条件是影响高变区选择的重要因素之一.在此基础上,提出了高变区选择的参考准则,同时建议应对选择的高变区进行有效评估.     

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)全长转录组测序及分析

为了深入分析和探索豆科模式植物蒺藜苜蓿的mRNA完整结构,使用单分子长读数测序技术(single-molecule long-read sequencing technology,SMRT)对蒺藜苜蓿进行全长转录组测序及分析.共获得7728183个subread和509014条全长非嵌合序列(full-length n...     

快速评价肠道微生物的qPCR方法的建立

【背景】近些年,16S rRNA基因测序与宏基因组分析常用于肠道微生物病原体检测。【目的】为了使检测不受限于高成本与耗时长的问题,基于荧光探针的实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR),建立一种评估人类肠道微生物群组成的平台用于检测肠道微生物丰度。【方法】从公共数据库筛选10种肠道中普遍存在的微生物分类群,使用20个粪便样本验证为10种靶标所设计的特异性引物与探针,最后通过比较qPCR方法和16SrRNA基因测序技术的检测结果来评估该平台的有效性。【结果】10对引物及其探针对靶标分类群具有特异性并且在HITdb数据库中靶向菌种的覆盖率超过70%;样本检测结果的变异系数(coefficient of variation,CV)小于10%,证明了该方法具有很高的稳定性;qPCR方法检测样本中物种的相对丰度与16S rRNA基因序列生物信息学分析结果大部分具有显著相关性(P<0.05)。【结论】本研究根据HITdb数据库设计的靶向微生物群的引物和探针检测到的粪便样本中微生物的相对丰度结果与16S rRNA基因测序结...     

耐草甘膦菌株Pantoea rodasii S1536全基因组测序及比较基因组分析

耐草甘膦菌株泛菌属S1536 (Pantoea rodasii S1536)是从草甘膦污染土壤中分离筛选出来的一种革兰氏阴性菌,对草甘膦的抗性能高达400 mmol/L。本研究首次通过PacBio RSII平台对泛菌属S1536进行全基因组测序,使用SMRT portal软件对reads进行组装,获得10个contigs,最终获得高质量且无间隔的泛菌属S1536基因组包含1条染色体和2个质粒,序列全长为5.16 Mb,其GC含量为55.16%。本研究进一步对基因组序列进行基因预测与功能注释、COG和GO聚类分析,预测了次级代谢产物合成基因簇及草甘膦抗性机制,最终得到编码基因有4 843个,4 656个蛋白获得COG功能注释,预测到2个NRPS类基因簇、1个thiopeptide类基因簇和1个hserlactone-arylpolyene类基因簇。莽草酸代谢途径关键酶EPSP合酶基因分析表明,泛菌属S1536中的EPSP合酶属于ClassⅠ型EPSPS。根据已报道的3株同一种Pantoea rodasii strain ND03、Pantoea rodasii strain DSM 26611和Pantoea rodasii strain LMG 26273的基因组信息进行全基因组关联比较分析,结果显示4株菌虽然属于同一种,但在进化中产生了较大差异。相关研究结果将为泛菌属S1536功能基因组学研究、耐除草剂机制的研究及耐除草剂基因的挖掘提供基础数据。     

利用木质纤维素类生物质产微生物絮凝剂Pseudomonas boreopolis GO2的全基因组测序及比较基因组学分析

【目的】Pseudomonas boreopolis GO2可以利用木质纤维素类生物质为唯一碳源发酵产微生物絮凝剂。解析菌株GO2的全基因组特征可为利用木质纤维素类生物质定向合成多糖型微生物絮凝剂提供分子基础。【方法】利用Illumina NovaSeq测序平台对菌株GO2进行测序,用SMRT等软件进行基因组组装、系统发育分析、基因预测和功能注释,并与4株近缘模式株进行了比较基因组分析。【结果】菌株GO2基因组大小为4 498 896 bp,GC含量为69.5%,共编码3 906个基因。菌株GO2与Pseudomonas boreopolis JCM 13306的16S r RNA基因相似性、平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)、DNA-DNA杂交(DNA-DNA hybridization, DDH)值最高,分别为99.93%、98.36%和88.00%,将菌株GO2命名为Pseudomonas boreopolis GO2。比较基因组分析发现,GO2与4个近缘模式菌株共有2 348个直系同源核心基因,主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢...     

蟋蟀肠道细菌多样性的宏基因组分析

【目的】了解油葫芦属蟋蟀成虫前中肠和后肠肠道细菌的多样性。【方法】首先,基于mtDNA-16S rRNA基因对蟋蟀进行分子鉴定,然后从蟋蟀前中肠和后肠分别提取总DNA,再使用Illumina Miseq平台进行细菌16S rRNAv3-v4变异区进行测序,最后分析蟋蟀肠道微生物的群落组成和多样性。【结果】蟋蟀mtDNA-16S rRNA基因分析结果显示归属于油葫芦属,暂时命名为平顶山油葫芦。细菌16SrRNA基因宏基因组测序分析,前中肠共获得21799条reads,857个操作分类单元(Operational taxonomic unit,OUT),后肠获得16 515条reads,2155个OUT。99%的蟋蟀肠道细菌归属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。前中肠归入232个属,前5个属分别是:乳球菌属(33.47%),泛菌属(21.50%),肠杆菌属(15.47%),沃尔巴克体属(9.47%)和魏斯菌属(5.34%);后肠归入152个属,前5个属分别是:未分类的瘤胃球菌科成员(Unclassified Ruminococcaceae)(30.07%),Parabacterides(10.93%),Incertae sedis(9.74%),Alistipes(5.86%),类杆菌属(5.50%),Dysgonomonas(4.91%)。【结论】mtDNA-16S rRNA是油葫芦属分子鉴定的有效工具。蟋蟀肠道含有丰富的微生物资源,为后续的肠道微生物资源开发奠定了基础。     

16S rRNA基因两个可变区对反映肠道菌群多样性与物种鉴定能力的比较分析

【摘 要】 目的 目前基于新一代测序技术开展的人类肠道元基因组学研究已成为微生物学乃至整个生物学中最活跃和最有潜力的学科方向。现阶段绝大部分以肠道菌群为靶标的研究主要基于16S rRNA基因可变区测序。本研究关注的是测序技术发展使得序列的读长能力延长后,选择16S rRNA基因V1-V3区与V3-V5区进行测序所反映的多样性与物种组成信息的异同点。方法 以两个真实的16S rRNA基因全长Sanger测序数据为基础,对其中的V1-V3和V3-V5两种片段进行了模拟数据的分析,将它们分别与16S rRNA基因的全长片段在OTU多样性水平和物种组成信息方面进行比较。结果 结果显示V1-V3区在OTU多样性上较V3-V5区更为接近全长序列;在物种组成表现上,两个可变区鉴定出的大部分的属的丰度与全长序列分析结果一致,但是各自有少数属的丰度结果与全长序列丰度结果存在差异。结论 在多样性分析上,选择V1-V3区片段能得到与全长更为接近的结果;而具体到菌种的组成分析中,V1-V3区和V3-V5区都有其局限性。     

小长蝽线粒体基因组全序列测定与长蝽总科系统发育分析

为了解小长蝽Nysius ericae(Schilling)线粒体基因组结构及长蝽总科的分子系统发育关系。本试验采用Illumina MiSeq测序平台对小长蝽线粒体基因进行测序,对基因组序列进行拼装、注释和特征分析,利用最大似然法和贝叶斯法构建基于12种长蝽总科昆虫线粒体全基因组核苷酸序列的系统发育树。小长蝽线粒体基因组全长为16 330 bp(GenBank登录号：MW465654),基因组包括13个蛋白编码基因(PCGs),22个tRNA基因,2个rRNA基因和1段非编码控制区。11个蛋白质编码基因的起始密码子为典型的ATN;cox1,nad4l的起始密码子为TTG。cob的终止密码子为TAG,其余蛋白编码基因的终止密码子为TAA。只有trnS1缺少DHU臂,其余tRNA基因均能形成典型的三叶草结构。12种长蝽总科昆虫线粒体全基因组序列构建的昆虫系统发育树结果显示,小长蝽与Nysius plebeius具有更近的亲缘关系,且与传统形态学分类基本一致。小长蝽线粒体基因组符合长蝽总科线粒体基因组的一般特征。结果表明小长蝽与N.plebeius的亲缘关系更近。     

基因组时代的放线菌系统分类学及其研究进展

由于放线菌在生物技术、医药卫生和环境治理等领域中的实际重要性,已经成为人们研究得最为深入的微生物类群之一。现代放线菌分类学是建立在对16S rRNA基因保守分子序列的系统发育学分析基础上、综合利用多种微生物信息的多相分类学(polyphasic taxonomy)。随着大规模基因测序技术的飞速发展,已经完成了超过100株放线菌的全基因组序列。近年来发展起来的"基因组系统发育学"有助让人们更加系统地理解放线菌类群的发生、演化,以及不同生境类群之间的相互关系。随着越来越多的以系统发育学为指导的基因组测序研究项目,例如"细菌和古菌基因组百科全书(Genomic Encyclopedia of Bacteria andArchaea,GEBA)计划"的出现,标志着放线菌系统学进入了基因组学研究时代。本文对基因组时代的放线菌系统学方法,以及国内外的相关研究成果进行综述。